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申请/专利权人：合肥燃音生物科技有限公司

摘要：本发明公开了一种大脑类器官模型及其制备方法与应用，所述方法包括：获得具有边界限制的单层贴壁生长的多能干细胞，加入EB形成培养基维持培养4～6天；后采用神经诱导培养基培养2～6天；后吸弃培养基，用预冷的Matrigel包被，固化后，依次更换神经分化培养基培养3～5天、诱导成熟培养基培养10～30天，获得大脑类器官模型。本发明首次实现了从单层细胞培养生成大脑类器官模型，可实现高通量、一步法构建形态均一的类器官，并可原位观察类器官生长、发育全过程。

主权项：1.一种大脑类器官模型的制备方法，其特征在于，所述方法为以下方法一至方法九中的任意一种：方法一的具体操作为：（1）获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞，具体包括：使用软光刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量微柱阵列，微柱直径为500微米，高度为50微米，微柱间距为1000微米；将PDMS预聚物与固化剂按10:1比例混合后倾倒到SU-8模板上，抽真空去除气泡后，在上面覆盖一层0.2mm的PMMA板，用两个盖玻片夹持并用台虎钳固定，置于80℃烘箱聚合处理120min，取出待恢复至室温后将穿孔PDMS薄膜从SU-8模板上剥离，用直径10mm打孔器取下适合大小的薄膜，获得具有多个穿孔的PDMS薄膜；取48孔细胞培养板加入70%乙醇，将所述PDMS薄膜置于48孔细胞培养板底部，吸弃多余乙醇，80℃烘箱干燥，得到图案化芯片；将图案化芯片置于紫外灯下灭菌处理60min，每孔加入500µL1×DPBS润洗芯片，移除DPBS后加入0.2mgmLMatrigel：DMEMF12，37℃孵育1h备用；将融合度为70-80%的hiPSCs用Accutase消化成单个细胞，用nctarget重悬，吸弃2%Matrigel：DMEMF12，每孔加入1.5×105个细胞，待细胞贴壁后，将所述PDMS薄膜移走，获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞；所述人诱导多能干细胞的边界限制形状为圆形；所述人诱导多能干细胞的生长面积为0.2mm2；所述人诱导多能干细胞的生长区域间距为1.5mm；所述人诱导多能干细胞的生长区域排列方式为正方形顶点排列；（2）向所述具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞中加入EB形成培养基维持培养6天，待细胞增厚后，采用神经诱导培养基培养5天，后吸弃所述神经诱导培养基，1×DPBS润洗两次，加入预冷的Matrigel进行包被，37℃二氧化碳培养箱中固化37min后，依次更换神经分化培养基培养3天、诱导成熟培养基培养25天，获得大脑类器官模型；方法二的具体操作为：（1）获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞，具体包括：使用软光刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量微柱阵列，微柱直径为500微米，高度为50微米，微柱间距为1000微米；将PDMS预聚物与固化剂按10:1比例混合后倾倒到SU-8模板上，抽真空去除气泡后，在上面覆盖一层0.2mm的PMMA板，用两个盖玻片夹持并用台虎钳固定，置于80℃烘箱聚合处理120min，取出待恢复至室温后将穿孔PDMS薄膜从SU-8模板上剥离，用直径10mm打孔器取下适合大小的薄膜，获得具有多个穿孔的PDMS薄膜；取48孔细胞培养板加入70%乙醇，将所述PDMS薄膜置于48孔细胞培养板底部，吸弃多余乙醇，80℃烘箱干燥，得到图案化芯片；将图案化芯片置于紫外灯下灭菌处理60min，每孔加入500µL1×DPBS润洗芯片，移除DPBS后加入0.2mgmLMatrigel：DMEMF12，37℃孵育1h备用；将融合度为70-80%的hiPSCs用Accutase消化成单个细胞，用nctarget重悬，吸弃2%Matrigel：DMEMF12，每孔加入1.5×105个细胞，待细胞贴壁后，将所述PDMS薄膜移走，获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞；所述人诱导多能干细胞的边界限制形状为圆形；所述人诱导多能干细胞的生长面积为0.008mm2；所述人诱导多能干细胞的生长区域间距为1.0mm；所述人诱导多能干细胞的生长区域排列方式为正方形顶点排列；（2）向所述具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞中加入EB形成培养基维持培养6天，待细胞增厚后，采用神经诱导培养基培养5天，后吸弃所述神经诱导培养基，1×DPBS润洗两次，加入预冷的Matrigel进行包被，37℃二氧化碳培养箱中固化37min后，依次更换神经分化培养基培养3天、诱导成熟培养基培养25天，获得大脑类器官模型；方法三的具体操作为：（1）获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞，具体包括：使用软光刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量微柱阵列，微柱直径为500微米，高度为50微米，微柱间距为1000微米；将PDMS预聚物与固化剂按10:1比例混合后倾倒到SU-8模板上，抽真空去除气泡后，在上面覆盖一层0.2mm的PMMA板，用两个盖玻片夹持并用台虎钳固定，置于80℃烘箱聚合处理120min，取出待恢复至室温后将穿孔PDMS薄膜从SU-8模板上剥离，用直径10mm打孔器取下适合大小的薄膜，获得具有多个穿孔的PDMS薄膜；取48孔细胞培养板加入70%乙醇，将所述PDMS薄膜置于48孔细胞培养板底部，吸弃多余乙醇，80℃烘箱干燥，得到图案化芯片；将图案化芯片置于紫外灯下灭菌处理60min，每孔加入500µL1×DPBS润洗芯片，移除DPBS后加入0.2mgmLMatrigel：DMEMF12，37℃孵育1h备用；将融合度为70-80%的hiPSCs用Accutase消化成单个细胞，用nctarget重悬，吸弃2%Matrigel：DMEMF12，每孔加入1.5×105个细胞，待细胞贴壁后，将所述PDMS薄膜移走，获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞；所述人诱导多能干细胞的边界限制形状为圆形；所述人诱导多能干细胞的生长面积为0.03mm2；所述人诱导多能干细胞的生长区域间距为1.2mm；所述人诱导多能干细胞的生长区域排列方式为正方形顶点排列；（2）向所述具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞中加入EB形成培养基维持培养6天，待细胞增厚后，采用神经诱导培养基培养5天，后吸弃所述神经诱导培养基，1×DPBS润洗两次，加入预冷的Matrigel进行包被，37℃二氧化碳培养箱中固化37min后，依次更换神经分化培养基培养3天、诱导成熟培养基培养25天，获得大脑类器官模型；方法四的具体操作为：（1）获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞，具体包括：使用软光刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量微柱阵列，微柱直径为500微米，高度为50微米，微柱间距为1000微米；将PDMS预聚物与固化剂按10:1比例混合后倾倒到SU-8模板上，抽真空去除气泡后，在上面覆盖一层0.2mm的PMMA板，用两个盖玻片夹持并用台虎钳固定，置于80℃烘箱聚合处理120min，取出待恢复至室温后将穿孔PDMS薄膜从SU-8模板上剥离，用直径10mm打孔器取下适合大小的薄膜，获得具有多个穿孔的PDMS薄膜；取48孔细胞培养板加入70%乙醇，将所述PDMS薄膜置于48孔细胞培养板底部，吸弃多余乙醇，80℃烘箱干燥，得到图案化芯片；将图案化芯片置于紫外灯下灭菌处理60min，每孔加入500µL1×DPBS润洗芯片，移除DPBS后加入0.2mgmLMatrigel：DMEMF12，37℃孵育1h备用；将融合度为70-80%的hiPSCs用Accutase消化成单个细胞，用nctarget重悬，吸弃2%Matrigel：DMEMF12，每孔加入1.5×105个细胞，待细胞贴壁后，将所述PDMS薄膜移走，获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞；所述人诱导多能干细胞的边界限制形状为圆形；所述人诱导多能干细胞的生长面积为0.8mm2；所述人诱导多能干细胞的生长区域间距为2.0mm；所述人诱导多能干细胞的生长区域排列方式为正方形顶点排列；（2）向所述具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞中加入EB形成培养基维持培养6天，待细胞增厚后，采用神经诱导培养基培养5天，后吸弃所述神经诱导培养基，1×DPBS润洗两次，加入预冷的Matrigel进行包被，37℃二氧化碳培养箱中固化37min后，依次更换神经分化培养基培养3天、诱导成熟培养基培养25天，获得大脑类器官模型；方法五的具体操作为：（1）获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞，具体包括：使用软光刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量微柱阵列，微柱直径为500微米，高度为50微米，微柱间距为1000微米；将PDMS预聚物与固化剂按10:1比例混合后倾倒到SU-8模板上，抽真空去除气泡后，在上面覆盖一层0.2mm的PMMA板，用两个盖玻片夹持并用台虎钳固定，置于80℃烘箱聚合处理120min，取出待恢复至室温后将穿孔PDMS薄膜从SU-8模板上剥离，用直径10mm打孔器取下适合大小的薄膜，获得具有多个穿孔的PDMS薄膜；取48孔细胞培养板加入70%乙醇，将所述PDMS薄膜置于48孔细胞培养板底部，吸弃多余乙醇，80℃烘箱干燥，得到图案化芯片；将图案化芯片置于紫外灯下灭菌处理60min，每孔加入500µL1×DPBS润洗芯片，移除DPBS后加入0.2mgmLMatrigel：DMEMF12，37℃孵育1h备用；将融合度为70-80%的hiPSCs用Accutase消化成单个细胞，用nctarget重悬，吸弃2%Matrigel：DMEMF12，每孔加入1.5×105个细胞，待细胞贴壁后，将所述PDMS薄膜移走，获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞；所述人诱导多能干细胞的边界限制形状为正方形；所述人诱导多能干细胞的生长面积为1mm2；所述人诱导多能干细胞的生长区域间距为2.0mm；所述人诱导多能干细胞的生长区域排列方式为正方形顶点排列；（2）向所述具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞中加入EB形成培养基维持培养6天，待细胞增厚后，采用神经诱导培养基培养5天，后吸弃所述神经诱导培养基，1×DPBS润洗两次，加入预冷的Matrigel进行包被，37℃二氧化碳培养箱中固化37min后，依次更换神经分化培养基培养3天、诱导成熟培养基培养25天，获得大脑类器官模型；方法六的具体操作为：（1）获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞，具体包括：使用软光刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量微柱阵列，微柱直径为500微米，高度为50微米，微柱间距为1000微米；将PDMS预聚物与固化剂按10:1比例混合后倾倒到SU-8模板上，抽真空去除气泡后，在上面覆盖一层0.2mm的PMMA板，用两个盖玻片夹持并用台虎钳固定，置于80℃烘箱聚合处理120min，取出待恢复至室温后将穿孔PDMS薄膜从SU-8模板上剥离，用直径10mm打孔器取下适合大小的薄膜，获得具有多个穿孔的PDMS薄膜；取48孔细胞培养板加入70%乙醇，将所述PDMS薄膜置于48孔细胞培养板底部，吸弃多余乙醇，80℃烘箱干燥，得到图案化芯片；将图案化芯片置于紫外灯下灭菌处理60min，每孔加入500µL1×DPBS润洗芯片，移除DPBS后加入0.2mgmLMatrigel：DMEMF12，37℃孵育1h备用；将融合度为70-80%的hiPSCs用Accutase消化成单个细胞，用nctarget重悬，吸弃2%Matrigel：DMEMF12，每孔加入1.5×105个细胞，待细胞贴壁后，将所述PDMS薄膜移走，获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞；所述人诱导多能干细胞的边界限制形状为正三角形；所述人诱导多能干细胞的生长面积为0.43mm2；所述人诱导多能干细胞的生长区域间距为2.0mm；所述人诱导多能干细胞的生长区域排列方式为正方形顶点排列；（2）向所述具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞中加入EB形成培养基维持培养6天，待细胞增厚后，采用神经诱导培养基培养5天，后吸弃所述神经诱导培养基，1×DPBS润洗两次，加入预冷的Matrigel进行包被，37℃二氧化碳培养箱中固化37min后，依次更换神经分化培养基培养3天、诱导成熟培养基培养25天，获得大脑类器官模型；方法七的具体操作为：（1）获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞，具体包括：使用软光刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量微柱阵列，微柱直径为500微米，高度为50微米，微柱间距为1000微米；将PDMS预聚物与固化剂按10:1比例混合后倾倒到SU-8模板上，抽真空去除气泡后，在上面覆盖一层0.2mm的PMMA板，用两个盖玻片夹持并用台虎钳固定，置于80℃烘箱聚合处理120min，取出待恢复至室温后将穿孔PDMS薄膜从SU-8模板上剥离，用直径10mm打孔器取下适合大小的薄膜，获得具有多个穿孔的PDMS薄膜；取48孔细胞培养板加入70%乙醇，将所述PDMS薄膜置于48孔细胞培养板底部，吸弃多余乙醇，80℃烘箱干燥，得到图案化芯片；将图案化芯片置于紫外灯下灭菌处理60min，每孔加入500µL1×DPBS润洗芯片，移除DPBS后加入0.2mgmLMatrigel：DMEMF12，37℃孵育1h备用；将融合度为70-80%的hiPSCs用Accutase消化成单个细胞，用nctarget重悬，吸弃2%Matrigel：DMEMF12，每孔加入1.5×105个细胞，待细胞贴壁后，将所述PDMS薄膜移走，获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞；所述人诱导多能干细胞的边界限制形状为十字形；所述人诱导多能干细胞的生长面积为0.2mm2；所述人诱导多能干细胞的生长区域间距为1.0mm；所述人诱导多能干细胞的生长区域排列方式为正方形顶点排列；（2）向所述具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞中加入EB形成培养基维持培养6天，待细胞增厚后，采用神经诱导培养基培养5天，后吸弃所述神经诱导培养基，1×DPBS润洗两次，加入预冷的Matrigel进行包被，37℃二氧化碳培养箱中固化37min后，依次更换神经分化培养基培养3天、诱导成熟培养基培养25天，获得大脑类器官模型；方法八的具体操作为：（1）获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞，具体包括：使用软光刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量微柱阵列，微柱直径为500微米，高度为50微米，微柱间距为1000微米；将PDMS预聚物与固化剂按10:1比例混合后倾倒到SU-8模板上，抽真空去除气泡后，在上面覆盖一层0.2mm的PMMA板，用两个盖玻片夹持并用台虎钳固定，置于80℃烘箱聚合处理120min，取出待恢复至室温后将穿孔PDMS薄膜从SU-8模板上剥离，用直径10mm打孔器取下适合大小的薄膜，获得具有多个穿孔的PDMS薄膜；取24孔细胞培养板加入70%乙醇，将所述PDMS薄膜置于24孔细胞培养板底部，吸弃多余乙醇，80℃烘箱干燥，得到图案化芯片；将图案化芯片置于紫外灯下灭菌处理60min，每孔加入500µL1×DPBS润洗芯片，移除DPBS后加入0.2mgmLMatrigel：DMEMF12，37℃孵育1h备用；将融合度为70-80%的hiPSCs用Accutase消化成单个细胞，用nctarget重悬，吸弃2%Matrigel：DMEMF12，每孔加入1.5×105个细胞，待细胞贴壁后，将所述PDMS薄膜移走，获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞；所述人诱导多能干细胞的边界限制形状为圆形；所述人诱导多能干细胞的生长面积为0.2mm2；所述人诱导多能干细胞的生长区域间距为1.0mm；所述人诱导多能干细胞的生长区域排列方式为正方形顶点排列；（2）向所述具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞中加入EB形成培养基维持培养6天，待细胞增厚后，采用神经诱导培养基培养5天，后吸弃所述神经诱导培养基，1×DPBS润洗两次，加入预冷的Matrigel进行包被，37℃二氧化碳培养箱中固化37min后，依次更换神经分化培养基培养3天、诱导成熟培养基培养25天，获得大脑类器官模型；方法九的具体操作为：（1）获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞，具体包括：使用软光刻技术制备SU-8模板，此模板为高通量微柱阵列，微柱直径为500微米，高度为50微米，微柱间距为1000微米；将PDMS预聚物与固化剂按10:1比例混合后倾倒到SU-8模板上，抽真空去除气泡后，在上面覆盖一层0.2mm的PMMA板，用两个盖玻片夹持并用台虎钳固定，置于80℃烘箱聚合处理120min，取出待恢复至室温后将穿孔PDMS薄膜从SU-8模板上剥离，用直径10mm打孔器取下适合大小的薄膜，获得具有多个穿孔的PDMS薄膜；取24孔细胞培养板加入70%乙醇，将所述PDMS薄膜置于24孔细胞培养板底部，吸弃多余乙醇，80℃烘箱干燥，得到图案化芯片；将图案化芯片置于紫外灯下灭菌处理60min，每孔加入500µL1×DPBS润洗芯片，移除DPBS后加入0.2mgmLMatrigel：DMEMF12，37℃孵育1h备用；将融合度为70-80%的hiPSCs用Accutase消化成单个细胞，用nctarget重悬，吸弃2%Matrigel：DMEMF12，每孔加入1.5×105个细胞，待细胞贴壁后，将所述PDMS薄膜移走，获得具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞；所述人诱导多能干细胞的边界限制形状为圆形；所述人诱导多能干细胞的生长面积为0.2mm2；所述人诱导多能干细胞的生长区域间距为1.5mm；所述人诱导多能干细胞的生长区域排列方式为正六边形顶点排列；（2）向所述具有边界限制的单层贴壁生长的人诱导多能干细胞中加入EB形成培养基维持培养6天，待细胞增厚后，采用神经诱导培养基培养5天，后吸弃所述神经诱导培养基，1×DPBS润洗两次，加入预冷的Matrigel进行包被，37℃二氧化碳培养箱中固化37min后，依次更换神经分化培养基培养3天、诱导成熟培养基培养25天，获得大脑类器官模型。

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