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申请/专利权人：石河子大学

摘要：本发明为一种老汉瓜的再生方法和遗传转化方法。一种老汉瓜的再生方法，包括以下步骤：1种子的消毒及无菌外植体的获得；2愈伤组织的诱导培养；3不定芽的诱导培养；4不定芽的伸长；5根的诱导培养。本发明还公开了一种老汉瓜的遗传转化方法。本发明所述的一种老汉瓜的再生方法和遗传转化方法，成功实现了老汉瓜子叶高效离体再生及遗传转化体系的建立，使得遗传转化率在86％以上。

主权项：1.一种老汉瓜的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）种子的消毒及无菌外植体的获得：老汉瓜种子去壳、消毒灭菌后，在萌发培养基中进行培养，至老汉瓜子叶完全展开，真叶未长出时，得子叶为无菌外植体；所述的萌发培养基为：12MS培养基中添加15-20gL蔗糖、8-9gL琼脂条，pH值为5.8-6.0；（2）愈伤组织的诱导培养：将所述的无菌外植体进行预培养、侵染和共培养后，再接入愈伤组织诱导培养基，在25-28℃的培养条件下培养15-20天；所述的预培养过程为：将所述的无菌外植体剪去头部和尾部，接入预培养培养基中，在25-28℃的培养条件下进行暗培养；所述的侵染及共培养过程为：用携带有植物表达载体的根癌农杆菌菌液，侵染所述的预培养后的老汉瓜子叶，再转移至愈伤组织诱导培养基，并用无菌滤纸将外植体与培养基隔开，进行共培养，在25-28℃的培养条件下暗培养2天；所述的根癌农杆菌菌液含有携带有植物表达载体pCAMBIA1302的根癌农杆菌GV3101、50-100mgL乙酰丁香酮，其OD600为0.4-0.6；所述的愈伤组织诱导培养基为：MS培养基中添加30gL蔗糖、9gL琼脂条、0.5-1.0mgL6-BA、0.15-0.3mgLIAA，pH值为5.8-6.0；（3）不定芽的诱导培养：待出现愈伤组织后，将外植体转入到芽诱导培养基中，在25-28℃，光周期为16h光照8h黑暗，光照强度为5000lx的组培室中进行培养，15-20d更换一次培养基，培养至出现不定芽；所述的芽诱导培养基为：MS培养基中添加30gL蔗糖、9gL琼脂条、0.5-1.0mgL6-BA、0.15-0.3mgLIAA、特美汀及抗生素潮霉素，pH值为5.8-6.0；（4）不定芽的伸长：待所述的不定芽长至0.5-1cm时，将带有不定芽的外植体，接入到不定芽伸长培养基中进行培养；培养条件为：在25-28℃，光周期为16h光照8h黑暗，光照强度为5000lx的组培室中进行培养，15-20d更换一次培养基；所述的不定芽伸长培养基为：MS培养基中添加30gL蔗糖、9gL琼脂条、0.5-1.0mgL6-BA、0.15-0.3mgLIAA、0.5-1.0mgLGA3、特美汀及抗生素潮霉素，pH值为5.8-6.0；（5）根的诱导培养：待所述的不定芽伸长至1.5-3cm时，将不定芽切下来，接入到根的诱导培养基中进行培养；培养条件为：在25-28℃，光周期为16h光照8h黑暗，光照强度为5000lx的组培室中进行培养；所述的根的诱导培养基为：12MS培养基中添加15gL蔗糖、9gL琼脂条、0.6-0.9mgLIAA、特美汀及抗生素潮霉素，pH值为5.8-6.0；（6）进行遗传转化苗的鉴定：对所述的根的诱导培养后的遗传转化的老汉瓜苗进行GFP荧光的检测；提取遗传转化的老汉瓜苗基因组DNA，进行PCR阳性检测，筛选阳性遗传转化苗。

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