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申请/专利权人：青岛科技大学

摘要：本发明研制了一种三重猝灭型光电化学生物传感器用于循环肿瘤DNA的超灵敏检测。Co3O4纳米酶能够催化氧化AEC产生不溶性沉淀，用于猝灭MgIn2S4的PEC信号，并对三重猝灭机理进行了深入研究。采用双适体夹心法引入Co3O4纳米酶，通过PEC信号的变化实现对ctDNA的超灵敏检测。

主权项：1.一种三重猝灭型光电化学生物传感器检测循环肿瘤DNA的方法，其特征是：利用Co3O4纳米酶催化氧化3-氨基-9-乙基咔唑AEC产生红色不溶性沉淀，用于猝灭MgIn2S4的光电信号，实现对循环肿瘤ctDNA的超灵敏检测；具体步骤：步骤1.MgIn2S2-COOH的制备：将0.1016gMgCl2·6H2O和0.2932gInCl3·4H2O超声溶解于70mL乙二醇中，然后加入0.3g的硫乙酰胺，搅拌10min后，将上述溶液置于50mL高压反应釜中，180℃下反应12h，将上述产物离心，用乙醇和水纯化多次，60℃下完全干燥，得到MgIn2S4微米花，再将20mgMgIn2S4微米花超声分散到20mL去离子水中，然后加入100μL巯基乙酸，室温搅拌12h，得到MgIn2S4-COOH；步骤2.无酶放大过程：首先，将10μL羧基修饰磁珠MB-COOH与30μL的40mMEDC溶液混合，反应30min，然后在上述溶液中加入30μL10mM的NHS溶液和10μL的1μM氨基修饰SC链，搅拌2h，使MB-COOH与SC链结合，随后通过磁分离获得MB-SC探针，并将其重新分散到PBS中备用，将80μLMB-SC探针与20μL的1μMPC混合，85℃加热10min，冷却至25℃，制得MB-SC-PC-PC探针，磁分离后，在MB-SC-PC-PC探针中加入10μL不同浓度的ctDNA和10μL1μM的FC链，在37℃下反应2h，得到大量产物链PC；ctDNA序列：5’-GTTGGAGCTAGTGGCGTAG-3’PC链序列：5’-GCTAGTGGCGTAGCCCTATATCCATAAATT-3’SC链序列：5’-NH2-AAAAAGGGCTACGCCACTAGCAGGGCTACGCCACTAGCTCCAAC-3’FC链序列：5’-GCTAGTGGCGTAGCCCTGCTAGTGGCGTAGCCCT-3’步骤3.Co3O4-PC探针的制备：将20μLPC链与100μL100μg·mL–1Co3O4纳米酶在37℃下混合4h,将所得溶液离心，沉淀重新分散于100μL0.1MPBS中；步骤4.PEC生物传感器的构建过程：首先，取25μL1mgmLMgIn2S4-COOH微花滴至清洗后的ITO电极上，自然干燥，然后在电极上滴入25μL40mMEDC和10mMNHS溶液，室温孵育2h，随后在电极上滴入25μL1μMCC链，室温孵育4h,将制备好的25μLCo3O4-PC探针滴到电极上，在37℃下孵育2h，随后电极浸入含有0.5mMH2O2和1mMAEC的0.1M，pH＝4.0醋酸钠缓冲液反应15min，最后，在含有0.1MAA的0.1M，pH＝7.4PBS进行PEC检测，初始电压为0V，激发光为蓝色LED，峰值波长为465nm；CC链序列：5’-NH2-AAAAAATTTATGGATATAGGGCTACGCCA-3’步骤5.真实样品检测：从当地医院获得新鲜人血清样本，先将上述血清样品10000rpm离心10min，上清液用0.1M,pH＝7.4PBS稀释10倍，然后将已知浓度的ctDNA，分别为0.1，1，5和50pM，加入上述稀释的血清样品中进行PEC检测。

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百度查询： 青岛科技大学 一种三重猝灭型光电化学生物传感器检测循环肿瘤DNA的方法