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申请/专利权人：北京康曦健康医学研究院;福建省海西细胞生物工程有限公司

摘要：本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种利用电磁场的人表皮角质细胞贴壁培养的方法，所述方法包括取材、分离、包被培养瓶、接种培养、换液、传代和鉴定步骤。本发明通过适宜电磁场刺激人表皮角质细胞，明确了电磁场具有促进贴壁作用，从而建立了一种简单高效的培养原代角质形成细胞的方法，该方法可克服细胞贴壁率低、耗时长的困难，可提高低密度细胞增殖的效率，并可高效缩短角质形成细胞的培养周期，以获得纯度更高的角质形成细胞。

主权项：1.一种利用电磁场的人表皮角质形成细胞贴壁培养的方法，其中，所述人表皮角质形成细胞来源于表皮组织，所述表皮组织已经使用表皮移植治疗仪在患者供皮区域用多孔吸盘以压力45~50kpa、温度38~45℃条件提取获得后放入含有0.5mMN-乙酰半胱氨酸和0.5mM葡萄糖的磷酸盐缓冲液中立即带回实验室，所述利用电磁场的人表皮角质形成细胞贴壁培养的方法包括以下步骤：1）分离：用无菌生理盐水将表皮组织漂洗7~10次，再在无菌条件下切割至1平方毫米大小，而后加入100ugmL的乙二胺四乙酸二钠在37℃培养箱恒温中孵育30min，再加入0.05%wt.%的胰蛋白酶溶液在37℃培养箱恒温消化30min，再加入胰蛋白酶抑制剂终止消化，之后将消化混合液以500g的速度离心5min，弃去上清，收集细胞沉淀备用；2）包被培养瓶：以5ugmL的纤维蛋白溶液包被塑料培养瓶，在2~8℃条件下过夜处理；3）接种培养：将步骤1）所得细胞沉淀用角质形成细胞培养基重悬，按5×104个cm2的密度接种于步骤2）得到的包被有纤维蛋白的培养瓶中，随后利用促进细胞贴壁的电磁设备，在37℃恒温条件下以75mA电流刺激细胞30min，再转移至37℃、5%CO2培养箱培养；4）换液：步骤3）的培养瓶培养至第3天进行首次更换角质形成细胞培养基，之后每隔3天进行全量换液；5）传代：待细胞生长至融合度50~80%时，用生理盐水洗涤细胞2次，加入0.05wt.%胰蛋白酶溶液在37℃培养箱恒温消化3~5min，用角质形成细胞培养基进行消化终止，收集消化细胞，按1×104个cm2的密度进行传代种瓶，在37℃、5%CO2培养箱中继续培养；6）鉴定：利用MTT试剂盒检测细胞贴壁生长数量；所述角质形成细胞培养基为CnT-PR培养基；所述促进细胞贴壁的电磁设备包括内置细胞培养液的培养瓶；所述培养瓶置于电磁感应线圈的中轴线处的磁场均匀位置；所述电磁感应线圈中轴线处的磁场方向为竖向；电磁感应线圈的磁场对培养液中的细胞施以向下的电磁力，以加快细胞沉降至培养瓶底部；所述培养瓶置于可提供恒温加热的加热台上；所述加热台的加热温度为37℃；所述电磁感应线圈与加热台共用电源；所述电源为直流电源。

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