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申请/专利权人：上海交通大学
摘要：本发明属于生物技术领域，涉及一种基于CRISPR技术的eccDNA快速检测方法，所述方法使用CRISPR‑Cas9系统靶向包含目标序列的eccDNA，在靶位点的切口处进行单链DNA探针辅助的酶修饰之后，直接在恒温下对目标eccDNA开启滚环扩增，再使用CRISPR‑Cas14系统靶向结合单链状态的滚环扩增产物，激发Cas14的反式切割活性，实现对信号的二次放大；本发明由于在检测过程中存在多步特异性识别与信号放大过程，在对eccDNA进行检测前，不需要对基因组内存在的线性DNA进行消化，显著缩短了染色体外环状DNA的检测时间，降低了检测成本，能实现1fM水平的检测限，能成功在肿瘤细胞中检测到携带肿瘤疾病相关基因片段的eccDNA。
主权项：1.一种基于CRISPR技术的eccDNA快速检测方法，其特征在于，在不消化基因组中线性DNA的情况下，包括如下所述的步骤：S1、利用CRISPR技术，将Cas9n-sgRNA结合到目标双链环形DNA的靶位点；S2、根据所述靶位点序列信息合成长度为40nt的单链DNA探针，并将所述40nt的单链DNA探针结合到sgRNA的非互补链上；S3、以长度为40nt的单链DNA探针为模板，在靶位点处使用Klenow大片段酶延长sgRNA的非互补链；S4、以sgRNA的非互补链延长区域为起点，以与40nt的单链DNA探针对应的20nt探针为引物，对目标双链环形DNA进行链取代反应，使目标双链环形DNA变为单链环状DNA；S5、在反应体系中加入滚环扩增引物，使用Phi29对链取代得到的单链环状DNA进行滚环扩增，获得滚环扩增产物；S6、利用CRISPR技术，将Cas14a-sgRNA和报告探针结合到滚环扩增产物的靶位点，激发反式切割活性，切割报告探针；S7、定容反应体系，在荧光分光光度计下进行荧光检测。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 上海交通大学 一种基于CRISPR技术的eccDNA快速检测方法
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