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申请/专利权人：深圳大学;深圳未知君生物科技有限公司

摘要：本发明公开了一种马氏巨球菌外源基因表达载体及其构建方法和引物，涉及基因工程领域。该方法包括：基于PacBio三代全基因组测序的甲基化修饰位点分析结果，在全基因组序列信息中检索马氏巨球菌的甲基转移酶，人工合成甲基转移酶的核酸片段并在E.coliDB24中表达，获得可表达马氏巨球菌甲基转移酶的E.coliDB24工程菌株；对NCBI数据库中及内部测序获得的巨球菌属的基因组数据进行预测分析，查找质粒序列并预测马氏巨球菌的复制元件，人工合成获得包含复制子在内的质粒骨架；将质粒骨架转入E.coliDB24工程菌株中，对质粒进行甲基化修饰；通过电转化将质粒转入菌株，获得用于马氏巨球菌外源基因表达的质粒载体。通过该方法可获得用于马氏巨球菌外源基因表达的质粒载体。

主权项：1.用于构建马氏巨球菌外源基因表达载体的引物，其特征在于，包括获得质粒pDB24-Tn7-Plac-methyls所使用的四对引物：DB24-Tn7-F：5’-CACCTGCCTCGCGCCGCAAAC-3’；DB24-Tn7-R：5’-AGCTCATGCATGATCGAATT-3’；ssD-methyl-F：5’-GAGGCAGGTGAGGAGGAAAATTATTGGGAGAAGTTGATTTGAGTGAGA-3’；ssD-methyl-R：5’-TAATTTTCCTCCTCACCTGCCTCATCACTCGATTTCACCGTCGA-3’；Eco-methyl-F：5’-GAGGCAGGTGAGGAGGAAAATTAATGTTAGAATATGTAGTGCGTCAGAC-3’；Eco-methyl-R：5’-TTTGCGGCGCGAGGCAGGTGCTAACTGTGCGAGGAAGAGC-3’；LacI-F：5’-AATTCGATCATGCATGAGCTAGATCTTTAGGAATTCTTTCAGCTCA-3’；LacI-R：5’-AATTTTCCTCCTCACCTGCCTCAGTATCTTGTTATCCGCTCACA-3’；用于构建马氏巨球菌外源基因表达载体的引物，还包括获得质粒骨架pXA511-mini所使用的三对引物：repM-F：5’-CGTTTTACAACGTCGTGACTGGGGAGTGCCTGGAACAAGAGTT-3’；repM-R：5’-AATAGCAACTCCTTCCGCTT-3’；cat-F：5’-AAGCGGAAGGAGTTGCTATTGAGCGCTTTTGAAGCTAATTC-3’；cat-R：5’-TTGGGTAACGCCAGGGTTTTGTTGTTACTAGTGCTTGGATTCTCAC-3’；pUC19-F：5’-AAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAA-3’；pUC19-R：5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’。

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