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申请/专利权人：深圳大学

摘要：本发明提供了一种荧光发射比率三维超分辨成像方法，包括脉冲激光器，脉冲激光器发出的激光经过半波片，再经过格兰激光棱镜，经过格兰激光棱镜其中一束激光传向高速光电二极管探测器，另一束激光传向第一分束器，分别照向第一反射镜和0π相位板，经过0π相位板的激光传向第二反射镜，经过第二反射镜后传向角反射器，经过第一反射镜的激光传向第二分束器，分别传向角反射器和第三反射镜，经过第三反射器的激光依次通过双色镜、振镜、扫描透镜、管镜和四分之一玻片后，通过物镜后照射至样品上。本发明可以实现三维超分辨成像，激光功率低，成像系统简易、成本低，能以三维超分辨的角度观测和研究活细胞中细胞器的动态和相互作用过程。

主权项：1.一种荧光发射比率三维超分辨成像方法，其特征在于：包括脉冲激光器（1），所述脉冲激光器（1）发出的激光经过半波片（2），再经过格兰激光棱镜（3），经过格兰激光棱镜（3）分成两束激光，其中一束激光传向高速光电二极管探测器（11），另一束激光传向第一分束器（4），经过第一分束器（4）再次分成两束激光，分别照向第一反射镜（5）和0π相位板（6）；经过0π相位板（6）的激光传向第二反射镜（9），经过第二反射镜（9）后传向角反射器（10）；经过第一反射镜（5）的激光传向第二分束器（7），经过第二分束器（7）再次分成两束，分别传向角反射器（10）和第三反射镜（8）；经过第三反射镜（8）的激光依次通过双色镜（15）、振镜（17）、扫描透镜（18）、管镜（19）和四分之一玻片（20）后，通过物镜（21）聚焦后照射至载物台（22）的样品上；所述高速光电二极管探测器（11）连接有时间相关单光子计数器（12），所述时间相关单光子计数器（12）连接有计算机（13）；载物台（22）的样品被激发后产生荧光，荧光被物镜（21）收集后经四分之一玻片（20）、管镜（19）、扫描透镜（18）、振镜（17）和双色镜（15），被双色镜（15）反射后经过滤光片（16）到达光电倍增管（14），所述滤光片（16）用于去除荧光以外的杂散光，提高图像信噪比，时间相关单光子计数器（12）同时接收高速光电二极管探测器（11）和光电倍增管（14）采集的参考信号和荧光信号，并将数据传输至计算机（13）进行存储和处理；首先，以笼式激光脉冲所在的时间通道为界限将荧光信号分为两部分，前半部分的荧光光子由高斯型激光激发，形成由高斯光斑点扩展函数组成的图像，剩余部分的荧光光子由笼式激光激发，形成由笼式光斑点扩展函数组成的图像；然后，对这两幅图像对应坐标的灰度值进行判定，根据判定方案得到荧光发射比率纳米显微图像各坐标的灰度值，实现超分辨成像；高斯光斑激发图像和笼式光斑激发图像中各像素的灰度值分别由IGaussianx,y和I3Dx,y表示；首先，判断高斯光斑激发图像中各个坐标位置像素的灰度值IGaussianx,y是否为零，若IGaussianx,y=0，则荧光发射比率纳米显微图像中对应坐标像素的灰度值I3D-FERNx,y为0；若IGaussianx,y≠0，则判断笼式光斑激发图像对应坐标位置像素的灰度值I3Dx,y是否为零；此时，若I3Dx,y=0，则荧光发射比率纳米显微图像中对应坐标像素的灰度值I3D-FERNx,y与IGaussianx,y相同；若I3Dx,y≠0，则荧光发射比率纳米显微图像中对应坐标像素的灰度值I3D-FERNx,y为IGaussianx,yI3Dx,y；根据上述判定，得到荧光发射比率纳米显微图像；对Z轴上不同深度的图像数据分别进行处理，将图像堆叠后得到最终的荧光发射比率三维超分辨结果。

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