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申请/专利权人：中国农业大学

摘要：本发明一种成年小鼠胃肌间神经元的分离和原代培养方法，基于胃组织和肠道组织圆筒形结构的不同，本发明将胃组织剪开后轻轻拉伸，将其铺平后用剪刀剪成1cm2左右的小方块，然后依次在解剖显微镜下利用直头眼科镊、弯头眼科镊、弯头维纳斯剪刀对肌肉进行剥离，获取到完整的肌间神经丛。

主权项：1.一种成年小鼠胃肌间神经元的分离和原代培养方法，所述方法具体为：步骤1：从成年小鼠上取出胃组织，进行清洗：将成年小鼠安乐死取出胃组织，用预冷的PBS清洗，确保清洗干净胃内容物；将上述的清洗干净的胃组织置于含有95％氧气和5％二氧化碳的Kerbs溶液中；步骤2：在解剖显微镜下剥离胃肌间神经丛：利用高压灭菌后的小剪刀，剪掉胃组织周围的肠系膜和周围结缔组织；用小剪刀从胃贲门开始，沿着胃大弯剪开胃组织，去掉胃底部，将剩余胃组织铺平后剪成0.5～1.5cm2的小组织块，在解剖显微镜下进行剥离，用载玻片刮去粘膜层，然后将浆膜层朝上放置，接着用一个直头眼科镊和一个弯头眼科镊剥离纵行肌及肌间神经丛LMMP；步骤3：采用消化培养基消化胃肌间神经丛，收集细胞沉淀：1将步骤2中取出的LMMP放到含有II型胶原酶的Krebs溶液中，用眼科剪将其剪成微小碎片，之后将培养皿放置于细胞培养箱中消化，其中间隔10～20min，进一步剪碎LMMP组织，吹打之后将培养皿中的液体放入离心管中，离心，去掉上清液收集细胞沉淀；2向离心管的细胞沉淀内加入胰酶，移液枪轻轻吹打混匀，在恒温培养箱中消化，然后加入等量的普通完全培养基终止消化，然后将细胞过滤膜放置在离心管上，用无菌注射器活塞部轻轻研磨组织，收集滤液，丢弃过滤膜，将过滤液离心，去掉上清液收集细胞沉淀；所述的消化是置于37℃的培养箱中，所述的消化时间为50～70min，所述的离心操作是4℃300～500g离心5～10min；步骤2中，胰酶加入量为0.01～0.1％；恒温培养消化是5～10min，细胞过滤膜为100μm的滤膜；离心条件为4℃，300～500g离心5～10min；步骤4：用完全神经元培养基重悬步骤3得到的细胞，并接种到包被处理好的细胞培养板上，细胞贴壁培养，得到胃组织肌间神经元：1所述包被的细胞培养板的制备方法为：Poly-D-多聚赖氨酸包被细胞培养板，将Poly-D-多聚赖氨酸液体加入到24孔板内，室温孵育，用双蒸水清洗细胞培养板后放置于超净工作台内，保持室温状态充分干燥，然后再将层粘连蛋白溶液加入到24孔板内，保证能完全覆盖培养孔，之后用封口膜将24孔培养板密封，放置于冰箱内待用；其中，Poly-D-多聚赖氨酸的浓度为80～120μgmL；其中加入的Poly-D-多聚赖氨酸的体积为200～400μL；其中的层粘连蛋白的浓度为30～70μgmL；加入的体积为200～400μL。

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