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申请/专利权人：济南大学

摘要：本发明涉及一种用于检测T‑2毒素的光电化学传感器的制备方法。T‑2毒素对消化系统、神经系统和生殖系统具有毒性作用。它主要存在于谷物或谷物制品中，对人体健康构成潜在威胁。因此，有必要开发快速检测T‑2毒素的方法。本研究提出了一种基于钛酸锶信号猝灭以及具有Mn2+依赖性的DNAzyme辅助信号放大策略用于快速灵敏检测T‑2毒素的光电化学传感器。根据不同浓度的T‑2毒素与其适配体的结合，释放不同浓度的DNAzyme。在Mn2+的存在下，DNAzyme激活并切割底物DNAH1，暴露与H2连接的DNA部分，使其与钛酸锶修饰的H2结合。钛酸锶与异质结光电材料竞争光源使异质结接收的光源强度降低且由于钛酸锶较大的比表面积会使其产生空间位阻，这种模式有效降低了异质结材料的光电转换效率，导致信号猝灭，电流降低。在本研究中，T‑2毒素浓度与光电流信号在0.0001~50ngmL−1较宽的范围内呈线性关系，检出限低至0.021pgmL。

主权项：1.基于一种用于检测T-2毒素的光电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）硫化铟镉材料的制备将0.10~0.50g四水合硝酸镉溶解于150~200mL去离子水中，再缓慢加入0.30~0.60g水合硝酸铟和0.20~0.50g硫代乙酰胺，在室温下搅拌0.5~2h后，将混合溶液转移至高压反应釜中于120~160℃反应10~14h，反应结束后自然冷却至室温，沉积物用去离子水和乙醇各洗涤3次，洗涤结束后，将得到的沉淀物在40~80℃真空干燥10~12h，制得黄色的硫化铟镉材料；（2）镍酸镧材料的制备取0.30~0.60g六水合硝酸镧和0.20~0.30g六水合硝酸镍溶于80~100mL去离子水中，于室温下搅拌均匀，迅速加入20~30mL浓度为0.30~0.40molL氢氧化钠水溶液，在室温下搅拌10~30min后，将该混合溶液于40~60℃反应4~6h，反应结束后自然冷却至室温，沉积物用去离子水和乙醇各洗涤3次，洗涤结束后，将得到的沉淀物在40~60℃真空干燥，再将干燥后的样品在600~650℃下煅烧2~3h，制得黑色的镍酸镧纳米材料；（3）钛酸锶纳米材料的制备取3~4mL浓度为2.5~3.0molL的钛酸四丁酯溶于40~60mL乙醇胺中，随后向溶液中加入30~40mL浓度为1~3molL的氢氧化钠水溶液，再逐步加入10~20mL浓度为1~3molL的醋酸锶水溶液，将上述悬浮液转移至高压灭菌器中于160~180℃下反应20~24h，产品用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，洗涤结束后，产品于50~60°C下真空干燥过夜，制得钛酸锶纳米材料；（4）钛酸锶连接的发夹DNA（H2）的制备取浓度为6~8μmolL的H2在95~100℃下加热5~10min，避光条件下加入浓度为3~6mmolL的三（2-氯乙基）磷酸酯常温下静置2~4h，以减少二硫键。H2和钛酸锶由金属硫醇连接，具体步骤为:取80~120µL浓度为5~10mgmL的钛酸锶与80~120µL浓度为6~8μmolL的H2混合，在35~40℃下振荡10~15h，离心后加入100~300µL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和40~60µL的牛血清白蛋白溶液，在35~40℃下继续振荡30~60min后，产物于4°C下储存备用；（5）三螺旋结构与双螺旋结构的制备取6~10μmolL的H1和6~10μmolL的H2在95~100℃下加热5~10min，在室温下自然冷却2~6h，得到发夹结构，将6~10μmolL的T-2毒素的适配体和6~10μmolL的探针按等比例混合在结合缓冲液中，95~100℃下加热5~10min，室温冷却2~8h，形成三螺旋结构（THMS），DNA酶（DNAzyme）与捕获DNA（cDNA）按等比例体积进行混合，加热至95~100℃保持5~10min后冷却至室温，形成双螺旋结构DNAzyme-off；（6）光电化学传感器的制备1）将ITO导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；2）取6µL浓度为2~6mgmL的硫化铟镉的水溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面上，60oC干燥器上晾干；3）在修饰的电极表面继续滴加6µL浓度为2~6mgmL的镍酸镧的水溶液，电极在60oC下自然晾干；4）滴加6μL浓度为3~6mmolL的巯基乙酸（TGA），室温下孵化40~60min，从而引入羧基。再滴加6μL浓度为15mgmLN-羟基丁二酰亚胺（NHS）和30mgmL1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）的混合物，室温下作用40~60min，激活羧基；5）在修饰电极上加入3μL浓度为6~8μmolL的H1和3μL浓度为1~4μmolL的DNAzyme-off，在37℃孵育2~4h后，在电极上继续滴加6μL0.1wt%的牛血清白蛋白阻断活性位点，每一步用Tris-HCl缓冲液轻轻清洗。于4℃下避光保存备用；6）将不同浓度的10μLT-2溶液与90μLTHMS在100μL1x结合缓冲液中混合30min，将7μL溶液与3μL浓度为10~20mmolL的氯化锰混合后滴加在电极表面，60min以后，在电极表面滴加8μL钛酸锶-H2，孵育80~120min，传感器构建完毕；最后在pH=7.4的10mmolL的Tris-HCl缓冲溶液中测量。

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