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申请/专利权人：中国科学技术大学;安徽省立医院(中国科学技术大学附属第一医院)

摘要：本发明提供了一种从小鼠脑膜中分离固有淋巴细胞的方法，并展示了这种方法在脑部疾病研究中的重要应用。该方法的过程包含：正确剥离小鼠脑膜，切碎，利用胶原酶消化并得到脑膜消化液，用percoll密度梯度离心法分离脑膜中单核细胞，细胞表面染色结合细胞核内染色以及流式细胞仪检测固有淋巴细胞以及固有淋巴细胞亚群ILC1，ILC2，ILC3的占比情况等过程。本发明有效地检测到了小鼠脑膜中的固有淋巴细胞，填补了长时间以来人们无法直接获取脑部固有淋巴细胞的空白，为脑膜免疫的研究工作奠定了实验基础。

主权项：1.一种从小鼠脑膜中分离固有淋巴细胞的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：正确剥离小鼠脑膜，收集小鼠脑膜组织；对获取组织切碎，消化并进行过滤，离心，取沉淀部分；用percoll密度梯度离心法分离脑膜中的单核细胞；将收集到的单核细胞表面非特异性抗体封闭；将封闭后样本进行死活染色和细胞表面染色，避光孵育；加入缓冲液，清洗；固定破除细胞核膜后，清洗，再进行细胞核内转录因子染色；利用流式分析仪分析染色好的细胞悬液样本，并检测样本中固有淋巴细胞的含量以及固有淋巴细胞亚群ILC1、ILC2和ILC3的占比情况；所述的收集脑膜的步骤如下：首先使用pH值7.4，0.01MPBS彻底经心灌注，利用脊髓脱臼法处死小鼠；进行断头操作，剪开头皮，暴露出完整颅骨，经过手术处理，收集小鼠的整个颅骨；将脑膜从脑表面和颅骨内部沿外侧至内侧方向剥离；将大脑分为小脑、脑干和大脑，从脑室、脑干和小脑皱襞中分别收集脑膜；所述的消化操作的步骤如下：每只小鼠的脑膜加入3～5ml浓度为2～2.5mgml的胶原酶D以及0.1mgml的DNase1消化，加入胶原酶D后在37℃的恒温箱中的摇臂上缓慢转动消化30～35分钟；所述脑膜组织的消化溶液是用100目的筛网过滤；所述Percoll法分离得到脑膜淋巴细胞的操作：用35％-40%的Percoll5ml重悬沉淀，进行930g离心20分钟；所述的将避光封闭后样本进行死活染色和细胞表面染色的操作：先加入0.5ultest死活染料，再加入1.5ultestPerCP.Cy5.5-antimouseCD45、PE-Cy7-antimouseCD127、PE-antimouse-ST2、5ultestFITC-antimouseLineageCocktail进行细胞表面抗体染色；所述的利用流式分析仪分析染色好的样本的操作：将流式细胞仪设置为CD45+Lineage-CD127+，检测固有淋巴细胞；将流式细胞仪设置为CD45+Lineage-CD127+Tbet+，检测ILC1细胞；将流式细胞仪设置为CD45+Lineage-CD127+ST2+，检测ILC2细胞；将流式细胞仪设置为CD45+Lineage-CD127+RORγt+细胞，检测ILC3细胞。

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