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申请/专利权人：贺州学院

摘要：发明提供一种冬青叶近红外荧光成像探针制备方法及其应用，该方法以冬青叶为原料，建立了一种简便绿色微波合成RCDs荧光成像探针的方法。得到最大发射波长为680nm的RCDs荧光成像探针，具有稳定性和生物相容性优良、荧光强度强、穿透能力强，背景荧光的干扰小等优点，并应用于细胞成像、体外实时长期示踪细胞、体内实时长期示踪肿瘤生长。体外实验结果显示，RCDs荧光成像探针进入细胞后能发出强烈、稳定的红色荧光，标记的HepG2细胞传代13代后仍能发出稳定的红色荧光。体内实验结果表明，RCDs荧光成像探针可以实时清晰监测肿瘤生长超过18天，荧光图像稳定性好，冬青叶近红外荧光成像探针RCDs可作为一种细胞和肿瘤的长期荧光示踪成像探针应用于肿瘤引导手术，可广泛应用于肿瘤细胞可视化治疗等领域中。

主权项：1.一种冬青叶近红外荧光成像探针制备方法及其应用，其特征在于，该冬青叶RCDs成像探针溶液的制备方法及在细胞和肿瘤示踪中的应用包括如下步骤：1冬青叶RCDs的制备：将新鲜冬青叶洗净晾干后，取适量的冬青叶浸入一定量无水乙醇中，连续搅拌2-5h，再在7000rpm转速下离心20min，得到绿色的上层清液，采用旋转蒸发器对上层清液进行浓缩，直至出现浆体样品，将浆体样品置于烧杯中，采用600-800W功率微波炉加热4-6min得到残渣，残渣分散于超纯水中得分散液，分散液通过0.22μm滤膜过滤器进一步过滤得到含小粒径的RCDs的滤液；2冬青叶RCDs在细胞示踪中的应用：取步骤1制备的RCDs的滤液适量，待贴壁HepG2细胞长满瓶底后，弃去旧的培养基，用PBS洗涤1-2次，将HepG2细胞接种于直径35mm的共聚焦细胞皿中，待细胞增殖至80％时，除去DMEM培养液，添加50-100μL浓度为10μgmL步骤1制备的RCDs的溶液，培养3-5h。然后除去培养液，用PBS缓冲液洗涤2-4次，加入0.6mL胰酶消化液消化1-3min，待细胞微微翘起变圆后，1000rpm离心2min，弃去消化液，加入新鲜的培养基吹打混匀，将细胞悬液稀释一半后接种于培养皿中继续放回37℃、5％CO2的细胞培养箱中传代培养；在一定时间间隔内，使用胰酶消化液将细胞消化悬浮，用4％多聚甲醛固定15min，设定激发波长为514nm，使用激光共聚焦显微镜收集650nm处的荧光进行拍摄，观察细胞内荧光成像。3冬青叶RCDs在肿瘤示踪中的应用：HepG2细胞种于90mm直径的细胞培养皿内，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养24h，待其贴壁后，将培养液换成50μL5-15μgmL步骤1制备的RCDs的溶液培养3-5h，吸去含药培养液，使用胰酶消化液将细胞消化悬浮，900-1100rmp转速下离心1-3min，吸走上清液，加入DMEM培养液轻轻吹打混匀；将HepG2细胞悬液通过皮下注射方式接种于裸鼠腿上部位1×106个细胞100μLDMEM溶液。肿瘤细胞接种于裸鼠体内后，在指定的时间间隔内第0天、第3天、第6天、第9天、第12天、第18天，裸鼠使用异氟烷进行麻醉，设置激发波长为600nm，发射波长680nm，使用小动物活体成像仪对裸鼠进行活体成像实验，检测皮下注射部位的近红外成像效果。4裸鼠离体脏器的荧光成像及苏木精-伊红HE染色实验体内肿瘤成像示踪实验结束后，将实验裸鼠经异氟烷麻醉处死后解剖，取出它们心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏以及肿瘤组织块，使用小动物活体成像仪对这些脏器以及肿瘤组织块进行荧光成像，同样采用600nm激发波长激发，680nm发射波长。肿瘤示踪成像实验的裸鼠离体脏器心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏用于荧光成像实验后，用4％多聚甲醛固定24小时后，组织切片进行HE染色实验，染色结果使用倒置显微镜拍摄，为了进一步验证RCDs对裸鼠的副作用低，取100μL10-30μgmL步骤1制备的RCDs的溶液尾静脉注射入空白裸鼠体内，观察一周，然后将裸鼠处死，取出心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行HE染色，观察其组织是否有凋亡或坏死现象。

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