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申请/专利权人：大连海关技术中心

摘要：本发明公开了基于多酶恒温扩增结合CRISPR‑Cas12a可视快速鉴定松茸方法及试剂盒。本发明首次应用MIRACRISPR‑Cas12a技术进行物种鉴定及食品真实性检测，采用松茸特异性检测引物，在等温体系中进行松茸基因扩增，特异性引物组合、crRNA、ssDNA包括如SEQIDNO.1～SEQIDNO.3、SEQIDNO.10所示的序列；将该特异性引物组合、crRNA、ssDNA制备成检测试剂盒，扩增结果可通过核酸侧流层析试纸条lateralflowdipstick，LFD进行可视化检测，具有反应快速，特异性强，灵敏度高，结果便于观察，对操作人员要求低，不需要昂贵复杂仪器等特点，适用于松茸源性成分的现场快速检测。

主权项：1.基于多酶恒温扩增结合CRISPR-Cas12a可视快速鉴定松茸的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：1阳性对照；2MIRA干粉试剂反应管；3BufferA；4BufferB；5松茸pol基因的特异性crRNA；6CRISPR蛋白；7ssDNA报告系统；8胶体金试纸条；所述MIRA干粉试剂反应管中装有含重组酶的反应液，所述含重组酶的反应液包括以下组分：重组酶200ngμL，单链DNA结合蛋白220ngμL，DNA聚合酶100ngμL，辅助蛋白80ngμL，上游引物10μM，下游引物10μM；所述上游引物序列如SEQIDNO.1所示；所述下游引物序列如SEQIDNO.2所示；SEQIDNO：1pol-F：5’-GAAGAAGGTTGTTACGGTGGAGAAACACAACG-3’SEQIDNO：2pol-R：5’Biotin-GTGCGTCGGAGATAGGACTGTCGTCAGCGAAC-3’所述BufferA包含一下组分：质量百分浓度3％的聚乙二醇，Tirs30mM；所述BufferB包括以下组分：280nM醋酸镁。所述松茸pol基因的特异性crRNA序列如SEQIDNO.3所示；SEQIDNO：3pol-cr1：UUUGCAGAUGUAAGGUUGGAUCCCAAG所述ssDNA报告系统包含可用荧光PCR系统进行判读，序列如SEQIDNO：10所示；SEQIDNO：10ssDNA：5’6-FAMTTTATTT3’BHQ1

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