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申请/专利权人：中国农业科学院兰州兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心)
摘要：本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种猪VASP基因敲除细胞系的构建方法。合成针对VASP基因的带有酶切位点的向导RNA及其互补序列，利用碱基互补配对原则将sgRNA及其互补序列连接为双链sgRNA片段，通过分子克隆重组技术构建重组CRISPRCas9质粒，转染到猪肺上皮细胞Porcinepulmonaryepithelialcell中，设计sgRNA引物，再通过嘌呤霉素药物筛选阳性单细胞克隆株，提取单细胞克隆株的DNA和蛋白质，进行VASP基因测序及蛋白表达检测，最后获得VASP基因敲除的PPE细胞。具有简便、高效、快速、低成本等特点。
主权项：1.一种VASP基因敲除细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1在sgRNA上加上Bbs1限制性内切酶的粘性末端和接头，得到插入片段；所述sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；2将所述步骤1得到的插入片段及其互补序列进行退火，得到双链片段；所述互补序列的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；3将所述步骤2得到的双链片段与PX459载体进行连接，将得到的连接产物转化感受态大肠杆菌，提取质粒，得到重组质粒PX459M-VASP-sgRNA；所述PX459载体经Bbs1酶酶切；4将所述步骤3得到的重组质粒PX459M-VASP-sgRNA与Lip2000脂质体、PPE细胞混合、转染，得到转染细胞；5将所述步骤4得到的转染细胞经嘌呤霉素筛选阳性单细胞克隆株，获得VASP基因敲除的PPE细胞系。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 中国农业科学院兰州兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心) 一种VASP基因敲除细胞系的构建方法
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