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申请/专利权人：复旦大学附属中山医院

摘要：本发明公开了UOX基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型的构建方法和应用，构建方法包括：通过CRISPRCas9设计UOX基因敲除的gRNA，序列如SEQIDNO:1和2所示；设计并合成gRNA引物，序列如SEQIDNO:3和4所示；以pUC57‑T7‑gRNA质粒为模板，使用gRNA引物进行PCR反应，得到PCR纯化产物，体外转录，得到gRNA；与Cas9蛋白导入C57BL6背景小鼠中，传代培养。本发明通过CRISPRCas9并利用非同源重组修复引入突变的方式准确敲除UOX基因，经过表型鉴定和生存率评估，得到高度模拟人类尿酸代谢的科学、合理、高效且长期稳定的高尿酸血症小鼠模型。

主权项：1.一种UOX基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型在高尿酸血症相关肾脏、心血管疾病及糖代谢紊乱的药物筛选中的应用，其特征在于，所述UOX基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型的构建方法包括以下步骤：S1、通过CRISPRCas9设计针对UOX基因敲除的靶点gRNA，所述靶点gRNA位于C57BL6背景小鼠UOX基因序列的第2至第4号外显子exon2-4，在intron1-2和intron4-5设计打靶得到，敲除区域为3.3kb；S2、设计并合成gRNA引物，分别为SgRNA-universal-PCR-F和SgRNA-universal-PCR-R，序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；S3、以pUC57-T7-gRNA质粒为模板，使用所述gRNA引物进行PCR反应，电泳检测PCR产物，纯化，得到PCR纯化产物；所述pUC57-T7-gRNA质粒包括pUC57-T7-gRNA1质粒和pUC57-T7-gRNA2质粒，序列分别如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示；S4、所述PCR纯化产物体外转录，得到gRNA，其包括gRNA1和gRNA2，序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；S5、所述gRNA和Cas9蛋白显微注射到C57BL6背景小鼠的受精卵细胞中，其中gRNA的终浓度为400ngμL，Cas9蛋白的终浓度为500ngμL；S6、所述C57BL6背景小鼠传代培养，得到稳定遗传的UOX基因敲除C57BL6小鼠；所述传代培养的方法包括：A1、对导入所述gRNA和Cas9蛋白的C57BL6背景小鼠进行UOX基因敲除检测，确定F0代小鼠UOX靶点敲除的效率；A2、F0代UOX基因敲除成功的成年小鼠UOX--与野生型C57BL6小鼠外交，得到F1胚胎，经基因型鉴定，得到F1代杂合子小鼠UOX+-；A3、F1代杂合子小鼠UOX+-内交，得到F2代小鼠；A4、所述F2代小鼠经基因型鉴定，得到UOX基因敲除的纯合子，即得；步骤A4中，所述UOX基因敲除的纯合子出生至4~5周为死亡高峰期，4~5周后仍存活的小鼠中位生存期为87天；所述UOX基因敲除检测采用的引物为F1和R1，序列分别如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示；所述F1胚胎基因型鉴定采用的引物为F2和R2，序列分别如SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示。

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