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摘要：本发明涉及一种基于PDMS材料的微室阵列式数字PCR芯片，所述芯片的材料为PDMS材料，包括进样口、微室阵列和出样口，所述进样口包括样品进样口和水进样口，所述出样口包括样品出样口和水出样口；所述水进样口和水出样口连通位于芯片外围的水微室阵列；所述样品进样口和样品出样口通过微管道连通微室阵列中的各反应室。本发明外围的水通道能够防止PCR过程中PCR反应液的蒸发；所设计的自动计数软件能够对芯片结果进行自动计数；本发明能够达到极高的检测灵敏度，实现DNA的单分子检测。

主权项：1.一种基于PDMS材料的微室阵列式数字PCR芯片，所述芯片的材料为PDMS材料，包括进样口、微室阵列和出样口，其特征在于：所述进样口包括样品进样口和水进样口，所述出样口包括样品出样口和水出样口；所述水进样口和水出样口连通位于芯片外围的水微室阵列，所述水微室阵列设置在所述微室阵列的外围，所述芯片外围的水微室阵列为内部PCR反应微室阵列提供潮湿环境；所述样品进样口和样品出样口通过微管道连通微室阵列中的各反应室，反应液能够在反应室中独立的进行PCR扩增；其中，所述微室阵列平均分为若干个矩形区域，每个矩形区域的尺寸对应显微镜视野大小，以形成若干个用于显微镜拍照的矩形区域。

全文数据：一种基于PDMS材料的微室阵列式数字PCR芯片技术领域[0001]本发明属于数字PCR领域，特别涉及一种基于PDMS材料的微室阵列式数字PCR芯片。背景技术[0002]数字PCR是一种能够对DNA分子拷贝数进行绝对定量的技术。该技术具有很多优点：能够对起始样品进行准确定量，且不需要预先绘制标准曲线;灵敏度高，检测限能够达到单个分子;可以定量核酸分子微小的浓度变化等。这些优点都使数字PCR比传统定量方法更准确、更灵敏，从而更加适用于对DNA分子的定量检测。[0003]数字PCR芯片也一直是微流控芯片领域的研究热点之一。目前，数字PCR微流体系统主要分为乳滴式和阵列式两类。首先是乳滴式数字PCR微流体系统，其原理是通过生成数万至数百万个油包水液滴，将PCR反应液均勾的分成一个个独立的反应单元，每个反应单元中的PCR过程将独立的进行。通过计数阳性反应单元的数目即可计算出初始DNA模板分子的数目。[0004]阵列式数字PCR芯片系统，该类型的数字PCR系统在芯片上预先制作数万个相互独立的反应室，然后通过将PCR反应液均匀的分配到这些反应室当中实现对PCR反应液的分液。每个反应室的PCR过程独立进行，并在PCR过程结束后对阳性反应室进行计数，通过泊松分布最终计算出初始DNA模板分子的数目。[0005]目前，乳滴数字PCR需要复杂的乳滴生成、操纵、读出设备，所以基于乳滴数字PCR的商用仪器十分昂贵。而目前的阵列式数字PCR尚不成熟，或结构复杂或使用操作繁琐。发明内容[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种基于PDMS材料的微室阵列式数字PCR芯片，该芯片外围的水通道能够防止PCR过程中PCR反应液的蒸发;所设计的自动计数软件能够对芯片结果进行自动计数;能够达到极高的检测灵敏度，实现DNA的单分子检测。[0007]本发明的一种基于PDMS材料的微室阵列式数字PCR芯片，所述芯片的材料为PDMS材料，包括进样口、微室阵列和出样口，所述进样口包括样品进样口和水进样口，所述出样口包括样品出样口和水出样口；所述水进样口和水出样口连通位于芯片外围的水微室阵列;所述样品进样口和样品出样口通过微管道连通微室阵列中的各反应室。[0008]所述芯片外围的水微室阵列为内部PCR反应微室阵列提供潮湿环境。[0009]所述微室阵列平均分为若干个矩形区域，每个矩形区域的尺寸对应显微镜视野大小。[0010]采用k-means聚类算法将阳性反应室与阴性反应室进行区分，并对阳性反应室的数目进行自动计数。[0011]有益效果[0012]1本发明能够实现DNA分子的单分子检测，表现出极高的检测灵敏度；[0013]2本发明操作简便，抗蒸发设计能够较好的抵抗PCR过程中反应仓的水分损失；[0014]3本发明使用基于k-means聚类算法的软件能够将阳性反应室与阴性反应室进行区分，并对阳性反应室的数目进行自动计数，能够直接数出DNA分子数目，不需要预先绘制标准曲线，实现了对DNA分子的绝对定量。附图说明[0015]图1为本发明的结构示意图；[0016]图2为本发明的抗水分损失能力示意图；[0017]图3a为阳性反应室与阴性反应室的显微照片，（b为沿线的荧光强度分布；[0018]图4为阳性反应室与阴性反应室的平均荧光强度，误差棒代表500次重复测量的标准差；[0019]图5为阳性反应室与阴性反应室的荧光强度分布直方图；[0020]图6为本发明的实物图；[0021]图7为不同浓度基因组DNA的数字PCR结果，其中（a为5X104c〇pyyL;b为104copyyL;c为103copyyL;d为102copyyL;e为10copyyL;f为未加入任何基因组DNA的对照组；[0022]图8为实施例测得的DNA目标片段浓度与DNA目标片段实际浓度线性关系曲线，误差棒代表三次独立复实验计算得到的标准差。具体实施方式[0023]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。[0024]实施例1[0025]1芯片结构[0026]如图1所示，本实施例提供了一种基于PDMS材料的微室阵列式数字PCR芯片，所述芯片的材料为TOMS材料，包括进样口、微室阵列和出样口，所述进样口包括样品进样口（图中标有Sample的进样口）和水进样口（图中标有Water的进样口），所述出样口包括样品出样口和水出样口；所述水进样口和水出样口连通位于芯片外围的水微室阵列；所述样品进样口和样品出样口通过微管道连通微室阵列中的各反应室。其中，样品进样口用于PCR反应液的进样，而水进样口用于芯片外围水微室阵列中水的进样。[0027]微管道宽约20-60μπι，高约10-30μπι，反应室的直径约ΙΟΟμπι，高度约ΙΟΟμπι。整个芯片共有反应室10368个，可将PCR反应液分成10368份，每一份反应液可以在反应室内独立的进行PCR扩增。由于芯片尺寸过大，无法通过一次显微镜拍照将整张芯片拍摄完全，所以将芯片的10368个反应室平均分成24个矩形区域，每个区域的尺寸正好是一个4倍显微镜视野大小。这样，通过24次拍摄就能够将整张芯片的所有反应室拍摄完毕。[0028]2芯片制作[0029]首先向硅基模具上浇筑TOMS预聚体与交联剂的混合物;然后经静置、加热等过程，使PDMS固化;将固化后的PDMS从模具上剥离，并与载玻片键和，芯片便制作完成。[0030]⑶芯片的抗水分挥发设计[0031]由于PDMS材料为多孔结构，所以在PCR过程中，反应室中的液体会受热挥发，导致反应室内水分的损失，芯片边缘部分的反应室会因水分损失而被完全蒸干。如图2所示，为了防止这一现象影响到PCR反应，在芯片边缘加上了如图所示的抗水分挥发设计。图中芯片外围的水微室阵列，其在数字PCR热循环过程中作为蒸发牺牲层，为内部的PCR微室阵列提供潮湿环境，以防止PCR反应液的蒸发。如图所示，使用胭脂红染料的水溶液测试芯片的抗蒸发能力。经40个PCR热循环过程，只有最外围水通道的部分反应室被蒸干，而内部的PCR微室阵列，没有明显的水分损失。上述实验结果证明，该芯片的抗蒸发设计能够较好的抵抗PCR过程中反应室的水分损失。[0032]⑷自动计数的设计[0033]数字PCR过程中，含有目的DNA片段的反应室会发出荧光信号，称为阳性反应室。而没有目的DNA片段存在的反应室则不会产生荧光信号，称为阴性反应室。为了对目的DNA片段进行定量，首先必须对芯片的阳性反应室数目进行计数。[0034]为了实现对阳性反应室的自动计数，首先应对阳性反应室与阴性反应室进行区分。图3a中所示为阳性反应室右与阴性反应室左）的荧光显微照片；图3b中所示为沿线的荧光强度分布。如图所示，阳性反应室的荧光强度比阴性反应室的荧光强度有显著升尚。[0035]使用Image-ProPlus软件（美国MediaCybernetics公司）对随机选取的500个阳性反应室与500个阴性反应室的显微照片进行了分析，结果如图4所示。阳性反应室的平均荧光强度明显高于阴性反应室的平均荧光强度。[0036]图5为阳性反应室与阴性反应室的荧光强度分布直方图。如图所示，直方图的X轴表示每个反应室的平均荧光强度，Y轴表示反应室的数目。从图中可以看出，阴性反应室的荧光强度主要分布于〇到30的范围内（单位为相对单位a.u.，而阳性反应室的荧光强度主要分布在100到140的范围内。这些数据说明两者的荧光强度数值有很大差异，可以通过聚类算法将两者自动区分开并对阳性反应室的数目进行自动计数。[0037]因此，根据上述结果，可以采用k-means聚类算法将阳性反应室与阴性反应室进行区分，并对阳性反应室的数目进行自动计数。[0038]⑶本实施例芯片的实际测试[0039]1.试剂与仪器：[0040]试剂：LightCycler480ProbesMaster德国Roche公司）；实验用水为DEPC处理水SangonBiotech；CpGMethylatedJurkatGenomicDNA香港NewEnglandBioLabs公司）。[0041]仪器：BX51焚光显微镜（日本OLYMPUS公司）；Mastercyclernexusflat原位PCR仪德国Eppendorf公司）；真空干燥器上海越磁电子科技有限公司）。[0042]DNA序列:实验中所用DNA序列见表1。标记有荧光基团与淬灭基团的Taqman探针序列由上海占标生物科技有限公司合成。PCR引物由生工生物工程上海股份有限公司合成，并由该公司经过聚丙烯酰胺凝胶电泳法PAGE进行纯化。[0043]表1实验所用DNA序列[0044][0045]2.PCR反应体系：[0046]为了测试该芯片的线性范围与检测灵敏度，对CpGMethylatedJurkat基因组DNA进行了梯度稀释，配制了一系列不同浓度的基因组DNA标准品（浓度从5XIO4CopyAiL到IOcopyAxL。实验前，取IyL标准品与PCR反应各组分配成13yLPCR反应预混液。将预混液在数字PCR芯片上进行热循环反应。数字PCR反应预混液的体系如表2所示，热循环参数如表3所示。PCR热循环过程在Mastercyclernexusflat原位PCR仪上进行。本实验中选择抑癌基因PCDHGB6的启动子作为PCR扩增的目的片段。[0047]表2数字PCR体系[0050]表3数字PCR热循环参考值[0052]3·实验结果：[0053]在PCR循环完成后，实验结果如图7所示，随着所加入基因组DNA浓度的逐渐减小，阳性反应室的数目也相应减少。同时，在未加入任何基因组DNA的对照组中，没有观察到任何阳性反应室。通过阳性反应室的数目，能够计算出待检测标准品中DNA分子的拷贝数。具体计算方法为：[0054]设芯片总阳性反应室数目为η，设芯片反应室数目设为N。由于DNA分子在反应室中的个数X满足泊松分布，则根据泊松分布的分布函数：[0056]公式3.1中λ为泊松分布的期望，而PX为每个反应室中DNA分子数目为X时的概率„由干阴件皮应室中含有0个目标DNA分子，咖有：[0058]通过公式3.2可以推出泊松分布的期望值λ的计算公式：[0060]当反应室中分子数X多1时，该反应室将产生荧光而成为阳性反应室，所以有下面式子：[0062]将公式3.4带入式3.3中，即可得出：[0064]λ是泊松分布中的期望，即单个反应室里面出现分子数目的期望值，所以只需要用λ乘以总反应室的数目N即可得出目的DNA分子的总拷贝数copy_number:[0065]copy_number=λXN3.6[0066]将总拷贝数C〇py_number除以初始样本的体积v，即可得到目标DNA分子的初始浓度：[0068]至此，通过数学计算，精确地得到了样品中目的DNA分子的拷贝数与浓度。[0069]图8为实验测得的目标DNA分子浓度与其实际浓度的线性关系曲线，如图所示，检测的线性范围为IOcopyAiL到5XHMcopyAxLR2=0.9999。该结果显示出，芯片对DNA分子的定量准确，并且线性度好。同时，最低检测限达到了10个分子。以上结果证明，该芯片可以用于目标DNA分子的绝对定量检测。

权利要求：1.一种基于PDMS材料的微室阵列式数字PCR芯片，所述芯片的材料为TOMS材料，包括进样口、微室阵列和出样口，其特征在于:所述进样口包括样品进样口和水进样口，所述出样口包括样品出样口和水出样口；所述水进样口和水出样口连通位于芯片外围的水微室阵列;所述样品进样口和样品出样口通过微管道连通微室阵列中的各反应室。2.根据权利要求1所述的一种基于PDMS材料的微室阵列式数字PCR芯片，其特征在于：所述芯片外围的水微室阵列为内部PCR反应微室阵列提供潮湿环境。3.根据权利要求1所述的一种基于PDMS材料的微室阵列式数字PCR芯片，其特征在于：所述微室阵列平均分为若干个矩形区域，每个矩形区域的尺寸对应显微镜视野大小。4.根据权利要求1所述的一种基于PDMS材料的微室阵列式数字PCR芯片，其特征在于：采用k-means聚类算法将阳性反应室与阴性反应室进行区分，并对阳性反应室的数目进行自动计数。

百度查询： 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 一种基于PDMS材料的微室阵列式数字PCR芯片