买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

摘要：本发明公开了一种血清N末端B型利钠肽前体NT‑proBNP标准物质的定值方法，包括如下步骤：1合成同位素标记的NT‑proBNP内标；2外标法测定NT‑proBNP内标纯度；3重量法制备校准血清；4血清预处理与净化；5Glu‑c蛋白酶解；6高效液相色谱‑三重四极杆质谱采集特征肽段；7血清标准物质候选物中NT‑proBNP的定值。本方法以国家有证标准物质为溯源源头，在血清预处理前完成校准血清的制备，避免将复杂操作带来的误差引入定值结果，并基于同位素稀释质谱法消除了系统误差，与传统的肽段水平定值方法相比具有更高的检测灵敏度和定值准确性，定值结果可溯源至国际单位制。

主权项：1.一种血清N末端B型利钠肽前体NT-proBNP标准物质的定值方法，其特征在于，包括以下步骤：1合成同位素标记的NT-proBNP内标通过化学固相合成法对NT-proBNP和NT-proBNP内标进行合成；其中，NT-proBNP的氨基酸序列为：NH2-MHPLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPR-COOH；如SEQIDNO：1所示；其中，NT-proBNP内标使用稳定同位素标记的精氨酸R*替换序列中的两个常规精氨酸R；具体氨基酸序列为：NH2-MHPLGSPGSASDLETSGLQEQR*13C6,15N4NHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPR*13C6,15N4PTGVWKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPR-COOH；2外标法测定NT-proBNP内标纯度选取N末端B型利钠肽原NT-proBNP溶液标准物质GBWE091242为母液，50mM磷酸盐缓冲液为溶剂，通过天平准确称量，混合后配制成三个质量浓度，使用高效液相色谱在214nm处采集紫外吸收信号并积分；以重量法配制的质量浓度为横坐标、以峰面积积分为纵坐标建立标准曲线；在相同色谱条件下采集化学合成内标的紫外信号，根据标准曲线回归方程计算NT-proBNP内标纯度；3重量法制备校准血清使用商品化酶联免疫试剂或化学发光诊断试剂，对血清标准物质候选物的浓度进行初步测量；根据内标纯度测定结果，通过重量法向血清标准物质候选物加入精准称量后的NT-proBNP内标溶液，使候选物中NT-proBNP与内标的质量比为1:1；同时，根据酶联免疫试剂或化学发光诊断试剂测量结果，依次向健康人血清中加入相同浓度水平的NT-proBNP标准物质GBWE091242、NT-proBNP内标，使加标血清中二者质量比分别为0.8:1、1:1、1.2:1；4血清预处理与净化配制1％脱氧胆酸钠水溶液，与0.5mL血清样本等体积混匀后超声5min，室温下振荡10min；加入1mL乙腈，充分混匀后室温下振荡10min，随后15000rpm下离心15min，使用移液器吸取上清、待用；选取C18固相萃取SPE小柱作为分离介质，安装于SPE装置并压紧、扣紧，通过流量调节阀门控制萃取液流速为1滴秒，随后向小柱中添加2mL甲醇、2mL纯水分别进行活化和清洗，随后转移上清液至萃取小柱，吸附完毕后加入2mL纯水进行清洗，最后添加含0.1％甲酸的50％乙腈水溶液进行洗脱，收集洗脱液、氮气吹干或离心旋干后待用；5Glu-c蛋白酶解首先，随机选取三个吹干样本，分别加入0.5mL磷酸盐缓冲液复溶，使用BCA试剂盒或者可测定总蛋白含量的光谱仪，对回收到的蛋白质组进行量值测定；向其他待测样本中加入0.2mL尿素水溶液进行复溶，室温下振荡1h；加入0.2mL浓度为40mM的三2-羧乙基膦溶液，室温下振荡10min以还原蛋白组中的二硫键；加入碘乙酰胺溶液，使其终浓度达到20mM，反应30min以烷基化半胱氨酸；以蛋白质组初步定量结果为依据，按蛋白质组Glu-c＝25:1向反应体系中加入Glu-c酶液，最后加入纯水，使反应体积达到1.6mL，37℃下振荡反应16h；反应完成后氮气吹干或离心旋干，待用；6高效液相色谱-三重四极杆质谱采集特征肽段配制色谱流动相，即水相为含0.1％甲酸的纯水、有机相为含0.1％甲酸的乙腈；使用50μL水相复溶样本并转移至带有内插管的液相样品瓶中；随后，使用粒径≤2.6μm的C18色谱柱对酶解产物进行分离、洗脱，40min内有机相由2％提高至15％；选用三重四极杆质谱作为检测器，在多反应监测MRM模式下对NT-proBNP以及NT-proBNP内标释放出的特征肽段QE、QE*、SE和SE*进行检测，即步骤1所述NT-proBNP以及NT-proBNP内标的氨基酸序列中第21-31位的QRNHLQGKLSE、QR*13C6,15N4NHLQGKLSE，和第45-56位的SPRPTGVWKSRE、SPR*13C6,15N4PTGVWKSRE四条肽段，相应的母子离子信息下表所示： 7血清标准物质候选物中NT-proBNP的定值。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 中国计量科学研究院 血清N末端B型利钠肽前体NT-proBNP标准物质的定值方法