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申请/专利权人：安徽师范大学

摘要：本发明公开了一种用于鉴定安吉小鲵Hynobius amjiensis的多重PCR引物和方法及应用，其中，所述多重PCR引物包括如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的引物对1，以及如SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示的引物对2。通过上述方案，从安吉小鲵成体、蝌蚪或是卵带等组织中提取其DNA，利用本发明提供的两对PCR引物对，根据琼脂糖凝胶电泳检测中是否出现两条条带来对安吉小鲵进行特异性鉴定，避免了常规DNA测序及序列比对等繁琐步骤，实现了仅需通过一次PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测即可鉴定安吉小鲵，检测时间短，操作简便且实际使用时更为经济而高效的效果。

主权项：1.一种用于鉴定安吉小鲵Hynobius amjiensis的多重PCR引物，其特征在于，所述多重PCR引物包括如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的引物对1，以及如SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示的引物对2。

全文数据：用于鉴定安吉小鲵的多重PCR引物和方法及应用技术领域[0001]本发明涉及生物物种的检测领域，具体地，涉及一种用于鉴定安吉小鲵的多重PCR引物和方法及应用。背景技术[0002]安吉小銳Hynobiusamjiensis隶属两栖纲Amphibia、有尾目（Caudata、小銳科Hynobiidae、小鲵属Hynobius，是中国特产的珍稀两栖动物。安吉小鲵直到1991年才被发现定名顾辉清，1991，其模式标本产地位于浙江省安吉县龙王山省级自然保护区GuandLau，2004。安吉小鲵一般均栖息在海拔1300米以上的高山湿地、草甸中，繁殖季节时进入附近的溪流源口处、小溪沟或水坑内配对产卵，繁殖期后营陆栖生活。由于安吉小鲵的分布区极度狭窄，其野外种群数量估计不足300只，处于极度濒危的境地顾辉清等，1999。自2000年被国家林业局列入《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》后，安吉小鲵在2004年被IUCN红色物种名录列为极危CR级物种。2010年，在国家林业局发布的《极度濒危陆生野生动物名录》中，安吉小鲵又被列在首位。国内外很多学者均呼吁应加强对该物种的保护和研究（傅萃长，2003;GuandLau，2004;杨莉等，2008〇[0003]基于分类学的准确物种鉴定是人类认知自然和可持续发展的必要前提。它为生物多样性的保护、物种资源的可持续性利用，以及生物来源的新产品开发等提供了知识和理论基础（肖金花等，2004。对于物种的鉴定，传统的方法主要是采用形态学证据来进行。但该方法的一些缺陷也造成了濒危动物保护工作的局限，例如表型可塑性和遗传可变性、无法区分隐存分类单元、受生物性别和发育阶段限制等李明等，2001。在野生动物保护的实践工作中，一些来源不明的动物样品（如毛发、残肢、腐败组织、骨骼、皮张及粪便等往往不完整且样品量较小，已很难从形态学上加以识别。然而，物种鉴定的结果往往又是林业、工商、边检等执法部门开展野生动物资源保护与管理工作的基础。另一方面，由于这些动物大都生活在高山密林、人迹罕至处，或由于气候等客观原因，保护工作者极少有机会能亲眼观察到它们，以致进一步开展基于物种DNA数据的种群数量、种群遗传等工作困难重重。[0004]具体到安吉小鲵物种，由于其平时均生活于湿地草甸泥炭藓下腐植质层中，只有在冬季产卵季节才进入水坑。因此，在实际野外保护工作中很难看到安吉小鲵，绝大多数情况下遇到、采集到的都是其繁殖期内的蝌蚪、卵袋等未变态的幼体。同时，安吉小鲵的栖息地内同时还生活着其它两栖动物，如东方蝾螈、无斑肥螈、各种蛙类等。这些动物的幼体蝌蚪期或卵袋期还存在着生态位的重叠现象。安吉小鲵刚从卵袋里孵化出来的时候通体黑色个体又非常幼小，与同一水域内其它两栖类动物的蝌蚪非常相似，极难辨认。繁殖期幼体安吉小鲵难以辨识的情况给安吉小鲵的种群遗传学、迀地保护等工作带来了极大困难。[0005]近年来DNA分类鉴定技术的飞速发展为物种的保护、野生动物的有效管理提供了强大的工具，更成为形态学物种鉴定手段的有益补充（李明等，2001。动物线粒体DNAmtDNA的Cytb基因和12SrRNA基因均具有母系遗传、进化速率快、基因结构简单、无组织特异性等特点，被认为是开展种及种下水平鉴定研究的理想DNA标记（牛屹东等，2001;Pfunderetal.，2004;Balitzki_Korteetal.，2005。较之于通用引物测序法、RFLP等DNA鉴定方法，位点特异性PCRAllele-specificPCR技术因其具有的物种特异性、条件严谨、可重复性好等优点在物种鉴定领域得到了广泛使用（刘忠权等，2001;Yanetal.，2005;WangandGuo,2008;顾海丰等，2012。[0006]因此，提供一种无需通过DNA的测序及序列比对等繁琐步骤，仅需通过一次PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，检测时间短，操作简便且实际使用时更为经济而高效的用于鉴定安吉小鲵的多重PCR引物和方法是本发明亟需解决的问题。发明内容[0007]针对上述现有技术，本发明的目的在于克服现有技术中通过形态学辨别安吉小鲵具有局限性，且常规DNA测序的鉴定方式不仅费时费力，且大大提高了鉴定成本的问题，从而提供一种无需通过DNA的测序及序列比对等繁琐步骤，仅需通过一次PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，检测时间短，操作简便且实际使用时更为经济而高效的用于鉴定安吉小鲵的多重PCR引物和方法。[0008]为了实现上述目的，本发明提供了一种用于鉴定安吉小鲵Hynobiusamjiensis的多重PCR引物，其中，所述多重PCR引物包括如SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示的引物对1，以及如SEQIDNo:3和SEQIDNo:4所示的引物对2。[0009]本发明还提供了一种利用多重PCR鉴定安吉小鲵Hynobiusamjiensis的方法，其中，所述方法包括：[0010]1提取待测样品的总DNA;[0011]2采用根据上述所述的多重PCR引物对步骤1中提取的总DNA进行PCR扩增；[0012]3将步骤2中得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测;其中，[0013]在步骤3中所得到的琼脂糖凝胶电泳图中，若含有步骤2中得到的产物的泳道中出现2条条带，则判断所述待测样品为来自安吉小鲵的样品，若含有步骤2中得到的产物的泳道中不出现2条条带，则判断所述待测样品不是来自安吉小鲵的样品。[0014]本发明还提供了一种根据上述所述的多重PCR引物或上述所述的方法在鉴定安吉小銳Hynobiusamjiensis中的应用。[0015]通过上述技术方案，本发明通过从安吉小鲵成体、蝌蚪或是卵带等组织中提取其DNA，并对提取后的DNA进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳检测，利用本发明提供的两对PCR引物对，从而根据琼脂糖凝胶电泳检测中是否出现两条条带来对安吉小鲵进行特异性鉴定，从而大大避免了常规DNA测序及序列比对等繁琐步骤，实现了仅需通过一次PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测即可鉴定安吉小鲵，检测时间短，操作简便且实际使用时更为经济而高效的效果。[0016]本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明[0017]附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：[0018]图1是实施例1-3和对比例1-9的扩增产物的糖凝胶电泳图；其中，用到C来自双蒸水样品，泳道M为分子量标记，泳道1来自安吉小鲵的卵带样品，泳道2来自安吉小鲵的成体肌肉样品，泳道3来自安吉小鲵的蝌蚪肌肉样品，泳道4来自东方蝾螈的肌肉样品，泳道5来自天台蛙的肌肉样品，泳道6来自花臭蛙的肌肉样品，泳道7来自凹耳蛙的肌肉样品，泳道8来自棘胸蛙的肌肉样品，泳道9来自黑斑蛙的肌肉样品，泳道10来自泽蛙的肌肉样品，泳道11来自中华蟾蜍的肌肉样品。具体实施方式[0019]以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。[0020]本发明提供了一种用于鉴定安吉小鲵Hynobiusamjiensis的多重PCR引物，其中，所述多重PCR引物包括如SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示的引物对1，以及如SEQIDNo:3和SEQIDNo:4所示的引物对2。[0021]本发明还提供了一种利用多重PCR鉴定安吉小鲵Hynobiusamjiensis的方法，其中，所述方法包括：[0022]1提取待测样品的总DNA;[0023]2采用根据上述所述的多重PCR引物对步骤1中提取的总DNA进行PCR扩增；[0024]3将步骤2中得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测;其中，[0025]在步骤3中所得到的琼脂糖凝胶电泳图中，若含有步骤2中得到的产物的泳道中出现2条条带，则判断所述待测样品为来自安吉小鲵的样品，若含有步骤2中得到的产物的泳道中不出现2条条带，则判断所述待测样品不是来自安吉小鲵的样品。[0026]上述设计通过从安吉小鲵成体、蝌蚪或是卵带等组织中提取其DNA，并对提取后的DNA进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳检测，利用本发明提供的两对PCR引物对，从而根据琼脂糖凝胶电泳检测中是否出现两条条带来对安吉小鲵进行特异性鉴定，从而大大避免了常规DNA测序及序列比对等繁琐步骤，实现了仅需通过一次PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测即可鉴定安吉小鲵，检测时间短，操作简便且实际使用时更为经济而高效的效果。[0027]在本发明的一种优选的实施方式中，出现的2条条带中所含有的DNA片段的长度分别为150bp和425bp。[0028]在本发明的一种更为优选的实施方式中，为了使最终泳道中出现的条带更为清晰可辨，相对于30yL的PCR扩增体系的总体积，每条引物的浓度为0.2-0.5pmolL，DNA模板的用量为40-60ng。当然，本领域技术人员可以根据实际情况进行用量的选择，本发明并不局限于此。当然，在PCR扩增过程中使用的聚合酶和缓冲液等可以为本领域常规使用的类型，用量本领域技术人员也可以根据实际情况进行选择，在此不多作赘述。[0029]所述PCR扩增过程可以按照本领域常规采用的方式进行操作，例如，在本发明的一种优选的实施方式中，为了使扩增效果更好，所述PCR扩增过程的变性温度可以设置为gags°c，变性时间可以设置为35-45S。[0030]同样地，在本发明的另一优选的实施方式中，所述PCR扩增过程的退火温度可以选择为55-60°C，退火时间可以选择为25-35s。[0031]本发明还提供了一种根据上述所述的多重PCR引物或上述所述的方法在鉴定安吉小銳Hynobiusamjiensis中的应用。[0032]以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，所述引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成且引物浓度为lOpmolL，所述裂解液可以为本领域常规使用的DNA裂解液，例如，在本发明中，每升所述裂解液中含有50mmol的Tris-HClpH8.0、25mmo1的乙二胺四乙酸pH8.0、IOOmmo1的氯化钠和1%重量份的十二烷基硫酸钠，本发明中使用的dNTPMix为Transgene公司的市售品，蛋白酶K为Merck公司的市售品，所述DNA纯化试剂盒为Tiangen公司的市售品，其余所使用的化学试剂均为常规市售分析纯试剂。[0033]实施例1[0034]将0.5g表1中编号为1的待测样品置于离心管中并在离心管中将待测样品用消毒剪刀剪碎，然后向离心管中依次加入500yL的裂解液，30yL的10%十二烷基硫酸钠和3以1^勺20mgml的蛋白酶K，充分混匀后56°C水浴消化12h至管内液体澄清。向上述消化后的混合物中加入1'1^8-平衡酸50^1^，并轻微振荡5111；[11后置于110001'111；[11的离心机上离心10111；[11，取离心后的上清液。重复上述离心步骤两次。向重复离心后最终得到的上清液中加入冰冻无水乙醇IOOOyL并于-20°C下放置Ih后置于12000rmin的离心机上离心13min后，弃上清液，并向得到的沉淀中加入70%的乙醇80^1^，并轻微振荡0.5111；[11后置于130001'111；[11的离心机上冰冻离心13min，弃上清液。重复上述离心步骤两次。将得到的沉淀置于无菌操作台上自然晾干2.5h后向其中加入TE溶液400yL，轻微振荡并用手指轻弹离心管后于4°C下放置3h后进行琼脂糖凝胶电泳，得到总DNA。[0035]向PCR仪的样品管中加入IOyL的10XPCRbuffer，每条引物各IyL，2yL的2mmoIL的dNTPMix，2yL的25mmolL的Mg2+，1U的Taq酶和50ng的总DNA，并用双蒸水补齐至SOyLt3PCR反应条件为:95°C预变性5min;然后进行30个循环，该循环包括:95°C变性40s，58°C退火30s和72°C延伸35s;最后再作72°C延伸lOmin。在上述反应条件下进行PCR扩增。将扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示泳道编号为1。[0036]实施例2[0037]按照实施例1的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为2,且每条引物的用量为〇.6yL，总DNA的用量为40ng，变性温度为92°C，变性时间为35s，退火温度为55°C，退火时间为25s，电泳结果如图1所示泳道编号为2。[0038]实施例3[0039]按照实施例1的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为3,且每条引物的用量为1.5yL，总DNA的用量为60ng，变性温度为98°C，变性时间为45s，退火温度为60°C，退火时间为35s，电泳结果如图1所示泳道编号为3。[0040]对比例1[0041]按照实施例1的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为C，电泳结果如图1所示泳道编号为C。[0042]对比例2[0043]按照实施例1的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为4,电泳结果如图1所示泳道编号为4。[0044]对比例3[0045]按照实施例1的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为5,电泳结果如图1所示泳道编号为5。[0046]对比例4[0047]按照实施例2的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为6,电泳结果如图1所示泳道编号为6。[0048]对比例5[0049]按照实施例2的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为7,电泳结果如图1所示泳道编号为7。[0050]对比例6[0051]按照实施例2的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为8,电泳结果如图1所示泳道编号为8。[0052]对比例7[0053]按照实施例3的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为9,电泳结果如图1所示泳道编号为9。[0054]对比例8[0055]按照实施例3的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为10,电泳结果如图1所示泳道编号为10。[0056]对比例9[0057]按照实施例3的制备方法进行制备，不同的是，待测样品的编号为11，电泳结果如图1所示泳道编号为11。[0058]测试例[0059]将得到两条条带的含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶块用干净的手术刀切胶后并在DNA纯化试剂盒中进行纯化后送至上海生工生物工程技术有限公司进行测序。[0060]表1[0061][0062][0063]通过表1的样品信息及图1的电泳图结果比对可以看出，通过本发明设计的两对引物对，在实际检测时可以将待测样品仅通过一次PCR扩增并通过凝胶糖电泳实验中的电泳图结果即可判断待测样品是否为安吉小鲵，不仅检测时间短，操作简便，而且实际使用时更为经济而高效。而且送至上海生工生物工程技术有限公司进行测序的DNA片段的序列，长度均为约150bp^enBank登录号分别为KU218709，KU218710和KU218711，利用GenBank数据库的Blast软件搜索比对后显示，3个安吉小鲵样品的DNA序列与GenBank中已有的安吉小鲵物种线粒体Cytb基因同源片段序列（登录号JQ929949.1的序列相似性均为98%以上，进一步证实了实验结果的准确性。同时，实验所采用的待测样品可以为成体肌肉，可以为蝌蚪肌肉，也可以为卵带，大大提高了其适用范围，降低了取样的难度。[0064]以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。[0065]另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。[0066]此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

权利要求：1.一种用于鉴定安吉小鲵Hynobiusamjiensis的多重PCR引物，其特征在于，所述多重PCR引物包括如SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示的引物对1，以及如SEQIDNo:3和SEQIDNo:4所示的引物对2。2.—种利用多重PCR鉴定安吉小鲵Hynobiusamjiensis的方法，其特征在于，所述方法包括：1提取待测样品的总DNA;2采用根据权利要求1所述的多重PCR引物对步骤1中提取的总DNA进行PCR扩增；3将步骤2中得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测;其中，在步骤3中所得到的琼脂糖凝胶电泳图中，若含有步骤2中得到的产物的泳道中出现DNA片段的长度分别为150bp和425bp的条带，则判断所述待测样品为来自安吉小鲵的样品，若含有步骤2中得到的产物的泳道中不出现上述2条条带，则判断所述待测样品不是来自安吉小鲵的样品。3.根据权利要求2所述的方法，其中，相对于30yL的PCR扩增体系的总体积，每条引物的浓度为〇.2-0.5pmolL，DNA模板的用量为40-60ng。4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述PCR扩增过程的变性温度为92-98°C，变性时间为35-45s。5.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述PCR扩增过程的退火温度为55-60°C，退火时间为25-35s。6.—种根据权利要求1所述的多重PCR引物或权利要求2-5任意一项所述的方法在鉴定安吉小鲵Hynobiusamjiensis中的应用。

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