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申请/专利权人：中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所）

摘要：本发明公开了NOP14基因及其蛋白在作为肿瘤对mTOR抑制剂敏感性的标志物方面的应用。本发明首次研究表明：基因NOP14在肿瘤细胞中的表达水平与肿瘤细胞对mTOR抑制剂（雷帕霉素及其衍生物等，如依维莫司）的敏感性呈正相关，基因NOP14高表达的肿瘤对mTOR抑制剂敏感，可作为肿瘤患者对mTOR抑制剂类药物的敏感性检测评价指标。因此，本发明为临床上mTOR抑制剂类药物的敏感性检测提供了新的指标，以这一基因为指标，在基因水平和蛋白水平上设计新的化学实体，可快速、便捷、有效地进行mTOR抑制剂类药物的敏感性检测，从而提高肿瘤患者对mTOR抑制剂类药物的疗效，促进肿瘤的个体化治疗，使患者更好地受益，具有很好的应用价值和前景。

主权项：1.NOP14基因及其蛋白在作为肿瘤对mTOR抑制剂敏感性的标志物方面的应用。

全文数据：N0P14基因及其蛋白作为肿瘤对mTOR抑制剂敏感性的标志物的应用技术领域[0001]本发明属于生物医学技术领域。更具体地，涉及N0P14基因及其蛋白在作为肿瘤患者对mTOR抑制剂雷帕霉素及其衍生物等，如依维莫司）敏感性的标志物方面的应用。背景技术[0002]mTOR的全称为哺乳动物雷帕霉素的革巴蛋白（mammaliantargetofrapamycin，是一种进化保守的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶。mTOR是很多常见变异的致癌通路，如PI3KAKT，的下游效应分子。因此，mTOR经常在肿瘤中存在过度活化，导致细胞快速增殖、抗凋亡、代谢异常等一系列恶性改变，是肿瘤治疗的重要靶点。[0003]mTOR抑制剂目前较多的是雷帕霉素rapamycin，雷帕霉素是从一种细菌中分离得到的大环内酯类免疫抑制剂，可以有效抑制真菌的生长，所以最初被用作低毒性的抗真菌药物。雷帕霉素后来被发现在免疫抑制、抗衰老、预防心血管疾病、延缓神经退行性疾病、抗肿瘤方面都具有很好的疗效。依维莫司等是mTOR抑制剂雷帕霉素的衍生物，研宄显示，具有类似的作用。[0004]虽然目前雷帕霉素以及改造分子己经用于晚期肾癌、晚期乳腺癌ER+HER2-、巨细胞星形细胞瘤和胰腺神经内分泌瘤的临床治疗，但是由于，其一，雷帕霉素和衍生物只抑制mTORCl，不抑制mT0RC2，其二，雷帕霉素关闭了S6K依赖的对IRS1-PI3K-PDK1通路的负反馈，导致Akt的反馈激活和最终的药物抵抗，因此，雷帕霉素及其衍生物的应用范围依旧狭窄。[0005]而且，mTOR抑制剂的抗肿瘤疗效也会因人而异。如目前比较明确的只有TSC1和TSC2基因突变的病人对雷帕霉素类药物反应良好，因为TSC1TSC2失活会造成mTORCl的过度活化。但在PI3K-Akt通路过度活化的肿瘤里，如发生PTEN缺失、HER2基因扩增、P13K催化亚基的组成型活化、IGF-1R或EGFR过表达的肿瘤，一样造成mTORCl的激活，可是雷帕霉素类药物如依维莫司和坦罗莫司的效果都不理想。[0006]目前缺乏有效的敏感性标志物已经是限制雷帕霉素类药物推广的关键因素。发明内容[0007]本发明要解决的技术问题是克服雷帕霉素及其衍生物等mTOR抑制剂缺乏有效的敏感性标志物、应用范围狭窄的缺陷和不足，提供一种检测雷帕霉素及其衍生物等mTOR抑制剂敏感性的标志物。本发明首次发现，NOP14表达量高的肿瘤细胞对雷帕霉素更加敏感，可克服Akt的反馈激活，造成雷帕霉素敏感;为雷帕霉素及其衍生物的应用和肿瘤患者中敏感性人群的筛选提供了新的标志物，更好的指导用药，提高患者疗效。[0008]本发明的目的是提供N0P14基因及其蛋白在作为肿瘤对mTOR抑制剂敏感性的标志物方面的应用。[0009]本发明另一目的是提供N0P14基因及其蛋白在制备检测肿瘤对mT0R抑制剂敏感性的试剂方面的应用。[0010]本发明再一目的是提供N0P14基因及其蛋白在制备检测或筛选mTOR抑制剂敏感人群的试剂方面的应用。[0011]本发明上述目的通过以下技术方案实现：本发明首次研究表明：基因N0P14在肿瘤细胞中的表达水平与肿瘤细胞对mTOR抑制剂雷帕霉素及其衍生物等，如依维莫司）的敏感性呈正相关，基因N0P14高表达的肿瘤细胞对mTOR抑制剂更加敏感，可作为肿瘤患者对mTOR抑制剂类药物的敏感性检测评价指标，指导肿瘤的个体化用药和治疗，使患者更好地受益。因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：N0P14基因及其蛋白在作为肿瘤对mTOR抑制剂敏感性的标志物方面的应用。[0012]N0P14基因及其蛋白在制备检测肿瘤对mTOR抑制剂敏感性的试剂方面的应用。[0013]所述肿瘤是指肿瘤患者或肿瘤细胞。[OOM]N0P14基因及其蛋白在制备检测或筛选mTOR抑制剂敏感人群的试剂方面的应用。[0015]优选地，所述mTOR抑制剂为雷帕霉素及其衍生物等。[0016]优选地，所述雷帕霉素的衍生物为依维莫司等。[0017]另外，本发明还明确了p〗3KmT0R通路的抑制剂能够显著抑制N0P丨4高表达细胞的Akt活性，抑制肿瘤细胞的克隆形成能力，抑制肿瘤细胞移植瘤的生长;对应的，p13KmT0R通路抑制剂对N0P14低表达细胞的Akt活性没有很好的抑制效果。因此，以下应用也应在本发明的保护范围之内。[0018]pmmTOR通路的抑制剂在制备肿瘤防治药物中的应用。[0019]PI3KmT0R通路抑制剂在制备抑制肿瘤细胞克隆形成能力药物中的应用。[0020]PI3KmT0R通路抑制剂在制备抑制肿瘤细胞移植瘤的生长药物中的应用。[0021]所述肿瘤是指N0P14高表达的肿瘤细胞。[0022]本发明具有以下有益效果：本发明首次研宄表明：基因N0P14在肿瘤细胞中的表达水平与肿瘤细胞对mTOR抑制剂雷帕霉素及其衍生物等，如依维莫司）的敏感性呈正相关，基因N0P14高表达的肿瘤对mTOR抑制剂更加敏感，可作为肿瘤患者对mTOR抑制剂类药物的敏感性检测评价指标和标记物。[0023]同时，本发明还明确了P13KmT0R通路的抑制剂能够显著抑制NOP14高表达细胞的Akt活性，抑制肿瘤细胞的克隆形成能力，抑制肿瘤细胞移植瘤的生长;对应的，p13KmT0R通路抑制剂对N0P14低表达细胞的Akt活性没有很好的抑制效果。[0024]因此，本发明为临床上mTOR抑制剂类药物如雷帕霉素及其衍生物的敏感性检测提供了新的指标，以这一基因为指标，在基因水平和蛋白水平上设计新的化学实体，可快速、便捷、有效地进行mTOR抑制剂类药物的敏感性检测，从而提高肿瘤患者对mT〇R抑制剂类药物的疗效，促进肿瘤的个体化治疗，使患者更好地受益，具有很好的应用价值和前景。附图说明[0025]图1为PI3K-mT0R通路抑制剂对N0P14表达水平的影响。[0026]图2为过表达或敲低N0P14对Akt的蛋白水平、激活水平及其下游通路的影响。[0027]图3为在裸鼠皮下成瘤实验中过度表达N0P14的肿瘤细胞对mTOR抑制剂敏感。LUUZ〇J乃丨4，，胛熘细胞糸中的表达情况，以及对应的mTOR-Akt的活化情况。[0029]图5为N0P14尚低表达的肿瘤细胞在PI3K抑制剂和mT〇R抑制剂处理后Akt的反馈激活情况。[0030]图6为N0P14高低表达的肿瘤细胞对mT〇R抑制剂的敏感性实验。具体实施方式[0031]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。[0032]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。[0033]实施例1N0P14的表达受mTORCl的调控1.实验材料1药物:mTORCl抑制剂雷帕霉素rapamyc:[n，化学式为:C5lH79N013，CAS号为:53123-88-9，S6K的抑制剂PF-4708671化学式为：C19H21F3N6，CAS号为：1255517-76-0，mTORCl和mTORC2的共同抑制剂AZD8055化学式为：C25H：uN504，CAS号为：1009298-09-2，以及？131抑制剂LY_294002化学式为:CigHnNOs，CAS号为：154447-36-62癌细胞:鼻咽癌细胞系。[0034]2•免疫印迹实验分析N0P14受PI3K-mT0R通路的调控情况在贴壁的细胞中分别加入终浓度为1UM的mTORCl抑制剂雷帕霉素，终浓度为1〇uM的S6K的抑制剂PF-4708671，终浓度为0.1uM的mTORCl和mT0RC2的共同抑制剂AZD8055，以及终浓度为10UM的PI3K抑制剂LY-294002,处理24小时时间。[0035]用1XSDS上样缓冲液收集蛋白样品，置于金属浴中99。：1〇分钟使蛋白充分变性。将凝胶固定于电泳装置上，按顺序加蛋白marker和等量蛋白样品;浓缩胶稳压80V电泳30分钟，分离胶100V，电泳至溴酚蓝达分离胶底部时，关闭电源。350mA恒流持续转膜90分钟，使分离的蛋白质转移至PVDF膜上。PVDF膜用5%的脱脂奶粉，室温封闭1小时。一抗孵育相对应的PVDF膜，室温2小时或4°C孵育过夜。一抗孵育结束后，用1XPBST洗膜三次，每次10分钟;HRP偶联的二抗用5%的脱脂奶粉按1:10000的比例稀释，摇床上缓慢摇动，室温孵育1小时。1XPBST洗膜三次，每次10分钟后，暗房内显色，X光片显影、定影，分析结果。[0036]3•实验结果如附图1所示，用mTORCl抑制剂雷帕霉素、S6K的抑制剂PF-4708671、mT0RCl和mT0RC2的共同抑制剂AZD8055,以及PI3K抑制剂LY_294002间接抑制mTORCl都能降低外源和内源N0P14的表达水平。[0037]实施例2免疫印迹法分析N0P14对Akt激活的影响1.实验材料1试剂:pLVX-puro空载体质粒和PLVX-N0P14质粒；pLKO•1质粒，对照shRNA序列为5-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG-3’，靶向N0P14的1号shRNA序列为5’-CGGGAATGGTCTGTGTGTTAT-3’，2号shRNA序列为5’-GCTATTTCCAACTTCCGACTT-3’；转染试剂PEI;opti-MEM培养基；嘌呤霉素。[0038]⑵癌细胞:CNEUHNE1细胞系2.免疫印迹实验分析N0P14的表达量对Akt活性的影响1构建N0P14过表达和敲低的细胞系在1毫升〇Pti-MEM培养基中加入7-8微克的pLVX-puro空载体质粒、pLVX-NOP14质粒或含有对照shRNA序列、靶向NOP14的1号和2号shRNA序列的pLKO•1质粒，与21微克PEr混合，室温孵育15分钟;将上述混合物加入到10厘米培养皿的CNE1或HNE1细胞中，培养48小时;加入终浓度为2微克微升的嘌呤霉素2〜3天，用免疫印迹法分析N0P14过表达或敲低的细胞。[0039]⑵免疫印迹法分析N0P14过表达或敲低的细胞用1XSDS上样缓冲液收集蛋白样品，置于金属浴中99°C10分钟使蛋白充分变性。将凝胶固定于电泳装置上，按顺序加蛋白marker和等量蛋白样品；浓缩胶稳压S0V电泳30分钟，分离胶100V，电泳至溴酚蓝达分离胶底部时，关闭电源。350mA恒流持续转膜90分钟，使分离的蛋白质转移至PVDF膜上。PVDF膜用5%的脱脂奶粉，室温封闭1小时。一抗孵育相对应的PVDF膜，室温2小时或4°C孵育过夜。一抗孵育结束后，用1XPBST洗膜三次，每次10分钟;HRP偶联的二抗用5%的脱脂奶粉按1:10000的比例稀释，摇床上缓慢摇动，室温孵育1小时。1XPBST洗膜三次，每次10分钟后，暗房内显色，X光片显影、定影，分析结果。[0040]3.实验结果如图2所示Akt的总蛋白水平和S473磷酸化水平随N0P14过表达而显著升高;N0P14的敲低造成Akt总蛋白水平以及三个位点的磷酸化水平下降，进一步的，已知mT0RC2通过维持FoxO乙酰化以促进c-Myc的转录，在N0P14敲低细胞中的确观察到FoxOl的乙酰化下降和c-Myc表达的大幅降低。[0041]以上证据显示N0P14对mT0RC2的活性有极大影响。[0042]实施例3裸鼠成瘤实验中过度表达N0P14的肿瘤细胞对mTOR抑制剂敏感1.实验材料1药物:mTORC1和mT0RC2的共同抑制剂AZD8055、二甲基亚砜DMS02癌细胞:实施例2中转染了pLVX-puro空载体质粒或pLVX-N0P14质粒的CNE1细胞系3市购的裸鼠2.实验分组1空载体对照组:空白对照，使用DMS0处理转染了pLVX-puro空载体质粒的CNE1细胞Vector细胞）。[0043]2空载体AZD8055组：使用AZD8055处理Vector细胞。[0044]3过表达对照组：使用DMS0处理转染了pLVX-N0P14质粒的CNE1细胞N0P14细胞。[0045]⑷过表达AZD8055组：使用AZD8055处理N0P14细胞。[0046]3•裸鼠皮下成瘤实验检测过度表达N0P14的CNE1细胞移植瘤对mTOR抑制剂的敏感性分别以5X105数值的CNE1细胞Vector细胞或N0P14细胞植入3〜4周龄裸鼠腋窝皮下，每组10只，分为四组:空载体对照组，空载体AZD8055组，过表达对照组，过表达AZD8055组。连续饲养一周，皮下见明显成瘤时：采用隔天灌胃给药方式给予每只裸鼠15mgkgAZD8055或相同体积的DMS0。每2天检测一次肿瘤大小，比较各组间肿瘤形成差异。1〇天后用断颈法处死裸鼠，切除皮下肿瘤，称重并拍照记录。[0047]4.实验结果如图3所示N0P14能够显著地促进癌细胞CNE1的皮下成瘤能力，使用AZD8055处理后能够显著抑制NOP14过表达引起的成瘤能力。以上体内证据说明NOP14的促癌作用依赖于mTOR通路。[0048]实施例4免疫印迹法分析N0P14在各肿瘤细胞系中的表达情况1.实验材料癌细胞:CNE1、HNE1等肿瘤细胞系2.免疫印迹实验分析N0P14在各个肿瘤细胞系中的表达情况用1XSDS上样缓冲液收集蛋白样品，置于金属浴中99°C10分钟使蛋白充分变性。将凝胶固定于电泳装置上，按顺序加蛋白marker和等量蛋白样品；浓缩胶稳压80V电泳30分钟，分离胶100V，电泳至溴酚蓝达分离胶底部时，关闭电源。350mA恒流持续转膜90分钟，使分离的蛋白质转移至PVDF膜上。PVDF膜用5%的脱脂奶粉，室温封闭1小时。一抗孵育相对应的PVDF膜，室温2小时或4°C孵育过夜。一抗孵育结束后，用1XPBST洗膜三次，每次10分钟;HRP偶联的二抗用5%的脱脂奶粉按1:10000的比例稀释，摇床上缓慢摇动，室温孵育1小时。1XPBST洗膜三次，每次10分钟后，暗房内显色，X光片显影、定影，分析结果。[0049]3.实验结果如图4所示通过对11株肿瘤细胞系的检测，发现两株细胞5-8F和6-10B表达高水平的N0P14，同时伴随mTOR-Akt的过度活化。[0050]实施例5免疫印迹法分析N0P14高低表达的肿瘤细胞在mTOR抑制剂处理后Akt的反馈激活情况1.实验材料1药物:mTORC1抑制剂雷帕霉素，mTORC1和mT0RC2的共同抑制剂AZD8055，以及P13K抑制剂LY-294002⑵癌细胞:5-8F、6-10B、CNE2、S262.免疫印迹实验分析N0P14高低表达的肿瘤细胞对mTOR抑制剂处理后Akt的反馈激活情况在贴壁的细胞中分别加入终浓度为1yM的mTORCl抑制剂雷帕霉素，终浓度为0.1UM的ATP竞争性mT0RCl2激酶抑制剂AZD8055,以及终浓度为10yM的PI3K抑制剂LY-294002,处理54小时。[0051]用IXSDS上样缓冲液收集蛋白样品，置于金属浴中99°C10分钟使蛋白充分变性。将凝胶固定于电泳装置上，按顺序加蛋白marker和等量蛋白样品；浓缩胶稳压80V电泳30分钟，分离胶100V，电泳至溴酚蓝达分离胶底部时，关闭电源。350mA恒流持续转膜90分钟，使分离的蛋白质转移至PVDF膜上。PVDF膜用5%的脱脂奶粉，室温封闭1小时。一抗孵育相对应的PVDF膜，室温2小时或4°C孵育过夜。一抗孵育结束后，用1XPBST洗膜三次，每次10分钟;HRP偶联的二抗用5%的脱脂奶粉按1:10000的比例稀释，摇床上缓慢摇动，室温孵育1小时。1XPBST洗膜三次，每次10分钟后，暗房内显色，X光片显影、定影，分析结果。[0052]3.实验结果如图5所示我们对N0P14表达高的5-8F和6-10B细胞系进行了雷帕霉素及PI3K抑制剂处理，发现PI3K抑制剂LY-294002和mTOR抑制剂雷帕霉素可以降低N0P14的表达水平和mTOR-Akt激活水平，没有造成Akt的反馈激活表现为p_AktS473没有升高）；同时，对N0P14表达低的细胞系CNE2、S26进行相同的处理，发现N0P14表达水平没有明显变化，Akt的反馈激活非常显著表现为P-AktS473大幅升高）。[0053]实施例6克隆形成实验和CCK8细胞增殖实验分析N0P14高低表达的肿瘤细胞对mTOR抑制剂的敏感性1.实验材料1药物及试剂:mTORCl抑制剂雷帕霉素，mTORCl和mT0RC2的共同抑制剂AZD8055,以及PI：3K抑制剂LY_2940〇2;4%多聚甲醛;结晶紫染液;磷酸盐缓冲液PBS;CCK8细胞增殖实验试剂盒2癌细胞：5-8F、6-10B、CNE2、S263仪器:酶联免疫检测仪2•平板克隆实验分析N0P14高低表达的肿瘤细胞对mTOR抑制剂的敏感性在6孔板的每个孔中铺1000个细胞，过夜培养，待贴壁后分别加入终浓度为20nM或400nM的mTORCl抑制剂雷帕霉素，终浓度为50nM或100nM的mTORCl和mT0RC2的共同抑制剂AZD8055,以及终浓度为5uM或10uM的PI3K抑制剂LY-294002,连续处理7天。[0054]弃掉培养基后用PBS洗3遍，加入4%多聚甲醛室温固定1〇分钟，PBS洗3遍，加入结晶紫染液室温染色30分钟，PBS洗3遍，烘箱烘干后拍照并进行克隆数量的统计。[0055]3.CCK8细胞增殖实验分析N0P14高低表达的肿瘤细胞对mT〇R抑制剂的敏感性在96孔板中每孔铺1000个细胞，每组3个复孔，置于37°C、5%C02培养箱中孵育过夜。第二天待细胞贴壁后加入相应浓度的抑制剂处理72小时。除去原培养基，每孔加入110uLCCK8稀释液CCK8:培养基=1:10，置于细胞培养箱中孵育2小时。在酶联免疫检测仪上选择㈤=45〇nm测量吸光值，吸光度代表细胞数量，最后计算mT〇R抑制剂对细胞增殖的影响。[0056]4.实验结果如图6所示上图）克隆形成实验证明N0P14高表达的肿瘤细胞对雷帕霉素非常敏感，N0P14低表达的肿瘤细胞对雷帕霉素不敏感；（下图）CCK8实验显示雷帕霉素显著抑制N0P14高表达的肿瘤细胞的增殖，而对N0P14低表达的肿瘤细胞基本无效。[0057]综上，我们可以得出如下结论:N0P14在不同肿瘤细胞中的表达水平不同，其表达受mTORCl通路的正调控。N0P14表达量高的肿瘤细胞更加依赖mT〇R通路激活Akt，因此表现出对mTOR抑制剂如雷帕霉素及其衍生物的敏感性，不出现价⑽抑制剂长期处理造成Akt的反馈激活。而在N0P14表达水平较低的肿瘤细胞里，Akt更加依赖PI3K-PDK1通路实现活化，mTOR抑制剂由于抑制了mTORCl下游的S6K导致H3K通路的过度活化，从而引起Akt激酶的反馈激活和药物耐受。以上结果预示N0P14的表达水平是预示mT〇R抑制剂如雷帕霉素和其衍生物依维莫司等在肿瘤治疗中的分子标志物，可用于指导肿瘤患者对mT0R抑制剂的个体化治疗。[0058]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.N0P14基因及其蛋白在作为肿瘤对mTOR抑制剂敏感性的标志物方面的应用。2.N0P14基因及其蛋白在制备检测肿瘤对mTOR抑制剂敏感性的试剂方面的应用。3.N0P14基因及其蛋白在制备检测或筛选mTOR抑制剂敏感人群的试剂方面的应用。4.根据权利要求1〜3任一所述的应用，其特征在于，所述mTOR抑制剂为雷帕霉素及其衍生物。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，雷帕霉素的衍生物为依维莫司。6.PWKmTOR通路的抑制剂在制备肿瘤防治药物中的应用。7.PI3KmT0R通路的抑制剂在制备抑制肿瘤细胞克隆形成能力的药物中的应用。8.PI3KmT0R通路的抑制剂在制备抑制肿瘤细胞移植瘤的生长的药物中的应用。9.根据权利要求6〜8任一所述应用，其特征在于，所述肿瘤是指N0P14高表达的肿瘤细胞。

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