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申请/专利权人：浙江大学

摘要：本发明公开了一种抑制Bid蛋白表达的miR‑29a模拟物及其应用。所述抑制Bid蛋白表达的miR‑29a模拟物的基因序列为：5’‑UAGC‑ACC‑‑AUCUGAAAUCGGUUAUAACCGAUUUCAGAGGUGC‑UA‑3’，基因序列的5’端带有胆固醇修饰，基因序列中的所有核糖均带有2’‑OMe修饰。本发明首次发现细胞中miR‑29a水平与促凋亡因子Bid mRNA水平呈负相关，表明Bid mRNA是miR‑29a的结合靶点；根据该发现设计合成了miR‑29a模拟物，用于抑制促凋亡因子Bid mRNA的表达，进而抑制CD4+T细胞自身的凋亡、以及HIV诱导的CD4+T细胞的凋亡。

主权项：一种抑制Bid蛋白表达的miR‑29a模拟物，其特征在于，基因序列为：5’‑UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUAUAACCGAUUUCAGAGGUGCUA‑3’，所述基因序列的5’端带有胆固醇修饰，基因序列中的所有核糖均带有2’‑OMe修饰。

全文数据：一种抑制Bid蛋白表达的miR-29a模拟物及其应用技术领域[0001]本发明属于基因治疗技术领域，具体涉及一种抑制Bid蛋白表达的miR-29a模拟物及其应用。背景技术[0002]HIV-I病毒感染可导致⑶4+T细胞中的miR-29水平严重下降，因此miR-29被认为是HIV-I进展性感染的生物标志（NucleicAcidsRes.2012;40:2181-2196,Retrovirology2012;9:5。研究发现miR-29能抑制HIV-I病毒在细胞内的复制和感染活性，其可能机制包括:miR-29能结合HIV-ImRNA的3’非编码区，促使mRNA革巴向至IjPbody进行降解，HIV3’UTR区中miR-29a的预测靶点如下式所示：[0009]此外，miR-29亦可下调HIVnef基因的转录，抑制nef蛋白表达，而nef蛋白是HIV-I病毒复制的必需成分Mol·Cel12009;34:696-709，Retrovirology2008;5:117。[0010]虽然miR-29能够通过促使HIV-ImRNA降解而抑制HIV-I病毒的复制，但miRNA通常能结合上百个基因而对其表达水平进行调节，因此miR-29作为细胞内重要的基因转录后调控机制，可能也会对CD4+T细胞自身产生的mRNA进行降解。目前针对miR-29a对CD4+T细胞自身功能的影响未见深入研究，CD4+T细胞被HIV-I感染后的凋亡机制不明确。[0011]由于HIV-I病毒能通过多种机制诱导⑶4+T细胞凋亡而导致免疫功能缺陷，因此观察miR-29对⑶4+T细胞凋亡的调控作用，具有重要的临床意义。发明内容[0012]本发明提供了一种抑制Bid蛋白表达的miR-29a模拟物，该miR-29a模拟物能够通过抑制Bid蛋白表达而抑制⑶4+T细胞活化后的凋亡以及HIV病毒诱导的⑶4+T细胞凋亡。[0013]—种抑制Bid蛋白表达的miR-29a模拟物，其基因序列为：5’-UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUAUAACCGAUUUCAGAGGUGCUA-3’，所述基因序列的5’端带有胆固醇修饰，基因序列中的所有核糖均带有2’-OMe修饰。[00M]由于人的T细胞是悬浮细胞，用转染试剂进行基因导入有困难。目前比较常用的方法有慢病毒载体和电穿孔法介导的基因导入，但慢病毒载体存在回复突变的可能，出于安全性考虑较少用于人的细胞;因此现有技术中常用电穿孔法介导基因导入。[0015]然而T淋巴细胞不容易被外源基因转染，并且电穿孔法介导的基因导入对细胞损伤比较严重，活化的T细胞对电穿孔法更为敏感，90%以上的T细胞均会发生凋亡，难以进行后续实验。[0016]因此，本发明对miR-29a人工合成序列（如SEQIDNo.1所示进行5’端胆固醇修饰和核糖的2’-OMe修饰，其中，5’端胆固醇修饰使得miR-29a模拟物无需转染试剂的帮助即可直接进入细胞内部;而对核糖进行2’-OMe修饰则有助于增加miR-29a模拟物的稳定性，并且这两种修饰对miR-29a模拟物本身的功能无影响，因此能够准确有效地评估miR-29a模拟物的功能。[0017]本发明首次发现，HIV感染患者⑶4+T细胞中的BidmRNA水平较健康人⑶4+T细胞中的BidmRNA水平要高，并且HIV感染能显著下调⑶4+T细胞内miR-29a水平;更为重要的是，对miR-29表达水平和BidmRNA水平进行相关性分析后发现，细胞中miR-29a水平与促凋亡因子BidmRNA水平呈负相关，具有统计学意义。这些发现表明BidmRNA是miR-29a的结合靶点，miR-29a能够抑制促凋亡因子BidmRNA的表达抑制率达55%，进而抑制CD4+T细胞自身的凋亡、以及HIV诱导的⑶4+T细胞的凋亡。而本发明的miR-29a模拟物验证了上述论断。[0018]因此，本发明还提供了所述miR-29a模拟物在制备Bid蛋白表达抑制剂中的作用。在包括CD4+T细胞在内的所有细胞中，只要细胞中miR-29a水平与促凋亡因子BidmRNA水平之间存在本发明所述的负相关性，均可采用本发明的miR_29a模拟物抑制Bid蛋白表达。[0019]本发明还提供了所述miR-29a模拟物在抑制⑶4+T细胞凋亡中的应用。[0020]本发明还提供了所述miR-29a模拟物在制备抑制⑶4+T细胞凋亡药物中的应用。[0021]由于HIV病毒不表达BidmRNA，在本发明的相关试验中BidmRNA均是由CD4+T细胞表达的，因此所述miR-29a模拟物能够用于抑制⑶4+T细胞自身发生的凋亡，抑制率达60%。[0022]本发明还提供了所述miR-29a模拟物在抑制HIV病毒诱导的⑶4+T细胞凋亡中的应用。[0023]本发明还提供了所述miR-29a模拟物在制备抑制HIV病毒诱导的⑶4+T细胞凋亡的药物中的作用。[0024]本发明首次发现，对于感染HIV的⑶4+T细胞，所述miR-29a模拟物不仅能够抑制细胞内HIV病毒的复制，而且能够抑制⑶4+T细胞中促凋亡因子BidmRNA的表达，通过两种抑制路径抑制HIV病毒诱导的⑶4+T细胞凋亡，抑制率达56%。[0025]与现有技术相比，本发明的有益效果为：[0026]本发明首次发现细胞中miR-29a水平与促凋亡因子BidmRNA水平呈负相关，表明BidmRNA是miR-29a的结合祀点；根据该发现设计合成了本发明的miR-29a模拟物，用于抑制促凋亡因子BidmRNA的表达（抑制率达55%，进而抑制⑶4+T细胞自身的凋亡（抑制率达60%、以及HIV诱导的⑶4+T细胞的凋亡抑制率达56%。附图说明[0027]图1为miR_29a模拟物、对照模拟物、miR_29a抑制物和对照抑制物基因序列和修饰位点；[0028]其中，miR_29amimic表不miR_29a模拟物，controlmimic表不对照模拟物，miR-29aantagomir表不miR_29a抑制物，controlantagomir表不对照抑制物，Chol表不胆固醇，Cy3为焚光标记，下同；[0029]图2a为miR_29amimic和controlmimic进入CD4+T细胞的效率；其中，CD4表不CD4+T细胞，Cy3表示被焚光标记Cy3染色的CD4+T细胞，notreatment表示未处理组（空白组），CtrImimic表示controImimic对照模拟物），下同；[0030]图213为11111?-291^8〇111；[1'和30111：1'011^80111；[1'进入004+1'细胞的效率；其中，Ctrlantagomir表不controlantagomir对照抑制物），下同；[0031]图3为miR-29amimic和controlmimic处理健康人⑶4+T细胞后对细胞凋亡的影响；其中，daysafteractivation表不活化后天数（即miR-29amimic和controlmimic处理后的天数），“5^111^;[11¥+”表示凋亡细胞占总细胞的百分比，“**”表示口〈0.01与对照模拟物组比较），下同；[0032]图4为miR_29aantagomir和3〇111：!'〇11^8〇111；[1'处理健康人004+1'细胞后对细胞凋亡的影响；[0033]图5a为HIV早期感染病人和健康人来源的⑶4+T细胞内miR-29a表达水平;其中，HD表示健康人组，HIV表示HIV早期感染病人组，miR-29afold表示miR-29a水平变化的倍数以健康人组为1，“***”表示P〈〇.001与健康人组比较），下同；[0034]图5b为HIV早期感染病人和健康人来源的⑶4+T细胞内miR-29b表达水平；其中，11^1?-2%化11表示1^1?-2%水平变化的倍数（以健康人组为1，“*”表示？〈0.05与健康人组比较）；[0035]图5c为HIV早期感染病人和健康人来源的⑶4+T细胞内miR-29c表达水平；其中，miR-29cfold表示miR-29c水平变化的倍数以健康人组为1;[0036]图6为健康人的CD4+T细胞感染HIV-lpNL4-3后培养上清中p24蛋白水平；其中，Daysafterinfection表示感染后天数，下同；[0037]图7a为!11¥-]^见4-3感染的健康人004+1'细胞经111丨1?-29111；[111；[3和30111：1'01111；[111；[3处理后细胞凋亡的变化;其中，AnnexinV表示能与AnnexinV结合的细胞（即凋亡细胞），7-AAD表示被7-AAD染色的细胞（即坏死细胞），511^|161、5311^|162、5311^|163分别表示样品1、样品2、样品3;[0038]图7b为图7a中AnnexinV阳性细胞所占比例的统计结果;其中，表示P〈0.01与Crtlmimic组相比）；[0039]图8为miR-29amimic对HIV-lpNL4-3感染后的CD4+T细胞培养上清中p24蛋白水平的影响;其中，表示P〈〇.05与对照模拟物组比较）；[0040]图9为健康人CD4+T细胞经miR-29amimic处理后可能靶基因mRNA水平的变化；其中，ReIativemRNAleve1表不mRNA相对表达水平；[0041]图IOa为HIV早期感染患者和健康人的⑶4+T细胞中促凋亡分子BidmRNA的表达水平;其中，bicKfold表示BidmRNA水平变化的倍数（以健康人组为1，“#”表示P〈0.01与健康人组相比）；[0042]图IOb为HIV早期感染患者和健康人的⑶4+T细胞中促凋亡分子BimmRNA的表达水平;其中，bimfold表示BimmRNA水平变化的倍数（以健康人组为1;[0043]图IOc为HIV早期感染患者和健康人的⑶4+T细胞中促凋亡分子pumamRNA的表达水平;其中，pumafold表示pumamRNA水平变化的倍数以健康人组为1;[0044]图IOd为HIV早期感染患者和健康人的⑶4+T细胞中促凋亡分子BmfmRNA的表达水平;其中，Bmffold表示BmfmRNA水平变化的倍数（以健康人组为1;[0045]图IOe为HIV早期感染患者和健康人的CD4+T细胞中促凋亡分子BaklmRNA的表达水平;其中，Baklfold表示BaklmRNA水平变化的倍数以健康人组为1;[0046]图IOf为HIV早期感染患者和健康人的⑶4+T细胞中促凋亡分子BaxmRNA的表达水平;其中，Baxfold表示BaxmRNA水平变化的倍数以健康人组为1;[0047]图Ila为HIV感染病人的⑶4+T细胞中miR-29a表达水平与BidmRNA水平的相关性；其中，deltaCtmiR-29a-U6表示miR-29aCt值与U6Ct值的相差数内，deltaCtBid-GAPDH表示BidCt值与GAPDHCt值的相差数，下同；[0048]图Ilb为HIV感染病人的⑶4+T细胞中miR-29b表达水平与BidmRNA水平的相关性；其中，deltaCtmiR-29b-U6表示miR-29bCt值与U6Ct值的相差数；[0049]图lie为HIV感染病人的⑶4+T细胞中miR-29c表达水平与BidmRNA水平的相关性；其中，deltaCtmiR-29c-U6表示miR-29cCt值与U6Ct值的相差数；[0050]图12为miR-29a结合BidmRNA的预测靶点；[0051]图13为HIV-lpNL4-3感染的健康人CD4+T细胞经miR-29amimic处理后Bid蛋白水平的变化;其中，HIV-Iinfection表示是否被HIV-lpNL4-3感染，Actin表示肌动蛋白含量，作为蛋白定量的内参；[0052]图14为电穿孔对初始T细胞和活化T细胞凋亡的影响；其中，naiveT表示初始T细胞，activatedT表示活化T细胞。具体实施方式[0053]下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的详细说明。[0054]本发明实施例中所使用的miR-29amimicmiR-29a模拟物）（如SEQIDNo.1所示）、controlmimic对照模拟物）（如SEQIDNo·2所不）、miR-29aantagomirmiR-29a抑制物）（如SEQIDNo.3所示）和controlantagomir对照抑制物）（如SEQIDNo.4所示）均由广州锐博生物科技有限公司代为合成，其他试剂和材料均为市售产品。[0055]四条基因序列的5’端均带有胆固醇修饰，3’端均带有Cy3荧光标记，且序列中所有核糖均带有2’-OMe修饰;并且，由于antagomir较短，不能形成发夹状结构，因此部分核苷酸还带有硫代磷酸修饰用跟在被修饰碱基后方的小写s表示），以增加其稳定性；四条基因序列的修饰位点见图1。[0056]实施例lmiR_29a模拟物对⑶4+T细胞凋亡的调控作用[0057]利用合成的miR-29amimic、miR-29aantagomir、controlmimic和controIantagomir分析以明确miR_29a对⑶4+T细胞的作用，具体包括：[0058]1分离人外周血来源的CD4+T细胞:取健康人外周血10ml，加等量I3BS稀释后，用Ficoll进行密度梯度离心，分离出外周血单个核细胞PBMC。然后用人CD4+T细胞阴性选择试剂盒Stemcell公司）从PBMC中分离出⑶4+T细胞。[0059]2将2X106CD4+T细胞放入预先包被人抗⑶3抗体和抗⑶28抗体的六孔板内，在完全培养基（1^]«11640添加10%?85和201]111111^-2中分别加入111丨1?-293111丨111丨3或1^1?-29aantagomir终浓度为50nM，培养24h后，观察miR-29amimic或miR-29aantagomir进入细胞内的效率;结果如图2a和图2b所示。[0060]由图2a和图2b可见，CD4+T细胞中约有50%细胞为Cy3阳性，表明miR-29amimiC和miR_29aantagomir均能有效进入CD4+T细胞。[0061]3在CD4+T细胞活化并经mimic或antagomir处理后的不同时间点（2、3、4天对细胞进行凋亡检测，同时设置controlmimic和controlantagomir作为实验对照，进一步观察11111?-293111；[111；[3或31^380111；[1'对04+1'细胞凋亡的影响，检测结果见图3和图40[0062]由图3可见，与controlmimic组相比，miR-29amimic处理能显著降低⑶4+T细胞活化后凋亡，凋亡率降低了60%左右；而由图4可见，与controlantagomir组相比，miR-29aantagomir处理则明显促进⑶4+T细胞活化后凋亡，凋亡率提高了70%左右；说明miR-29a在⑶4+T细胞中具有抗细胞凋亡作用。[0063]以上数据显示miR_29a表达水平的变化能直接调控健康人来源的⑶4+T细胞凋亡，表明miR-29a具有抗凋亡活性。[0064]实施例2miR-29amimic对HIV诱导CD4+T细胞凋亡的抑制作用[0065]随机选取10例HIV早期感染病人和10例健康人，分别分离外周血CD4+T细胞，并检测⑶4+T细胞内miR-29表达水平，检测结果见图5。[0066]由图5可见，HIV感染可导致miR-29a和miR-29b表达水平明显下调，尤其是miR-29a〇[0067]结合HIV感染能明显下调⑶4+T细胞中miR-29a的表达水平，以及miR-29的抗凋亡活性，申请人推测，在HIV感染的CD4+T细胞中恢复miR-29表达水平可能有助于促进CD4+T细胞的存活。[0068]为验证以上推测，首先在体外建立HIV-lpNL4-3HIV-1实验株的感染模型：[0069]从健康人外周血分离PBMC，加以下培养基在37°C+5%C02条件下培养48hRPMI1640培养基添加20%FBS、20UmlIL-2、人抗⑶3抗体和抗⑶28抗体）；然后用分选试剂盒分离出⑶4+T细胞，将IX106CD4+T细胞重悬于4ml完全培养基中，再加入lmlpNL4-3病毒存储液，在室温、1200Xg离心2小时;最后将细胞转入T75培养瓶培养;为了明确pNL4-3的感染效率，于感染后1、4、7天分别取培养上清检测HIVp24蛋白，检测结果如图6所示，pNL4-3能有效感染人外周血来源的⑶4+T细胞。[0070]在PNL4-3有效感染的基础上进一步观察胆固醇修饰的miR-29mimic对HIV诱导的⑶4+T细胞凋亡的影响。[0071]如上所述分离健康人外周血⑶4+T细胞并感染pNL4-3病毒，在感染后4天在培养基上清中加入miR_29mimic终浓度为50nM，同时设controlmimic组，于感染后7天检测⑶4+T细胞凋亡，检测结果见图7a和图7b。[0072]如图7a和图713所示，在未处理组和controlmimic处理组中，pNL4_3病毒能诱导约50%⑶4+T细胞发生凋亡，而miR-29mimic组的⑶4+T细胞凋亡率显著下降，凋亡率仅为约20%，证实了本发明的miR-29mimic能抑制HIV诱导的⑶4+T细胞凋亡。[0073]申请人同时观察了miR-29mimic对HIV复制的影响：同样用pNL4-3病毒感染健康人外周血⑶4+T细胞，感染4天后加入miR-29mimic，于感染后7天检测培养上清中p24蛋白浓度，检测结果见图8。[0074]如图8所示，与未处理组和controlmimic处理组相比，miR-29mimic组的培养上清中p24蛋白浓度明显降低，表明miR-29mimic能显著抑制培养上清中p24蛋白的合成，抑制HIV病毒复制。[0075]上述实验结果说明，在HIV感染的CD4+T细胞中，miR-29不仅能靶向到HIV-ImRNA的3’非编码区来促进HIV-I的降解，还能抑制HIV感染诱导的CD4+T细胞凋亡，因此miR-29amimic可通过这两方面的作用机制来发挥抗HIV感染的作用。[0076]实施例3miR-29amimic对⑶4+T细胞中促凋亡分子Bid表达的抑制作用[0077]为了明确miR-29a抑制⑶4+T细胞凋亡的具体机制，利用通过软件预测了miR-29靶基因，从中筛选与凋亡相关分子，发现促凋亡分子扮1、13;[111、口1111^、1311^、1^1^1以及1^1的1111?·均可结合miR-29如图9。[0078]由图9可见，与controlmimic处理组相比，在经miR-29mimic处理后的CD4+T细胞中，Bid、Bim、puma、Bmf、Bakl以及Bax的mRNA水平均出现不同程度地下调，其中Bid和BimmRNA水平下调较明显。[0079]同时，在收集的HIV早期感染者和健康人外周血的CD4+T细胞中分别检测这些可能靶基因的mRNA表达水平，发现HIV感染患者的⑶4+T细胞中BidmRNA水平较健康对照组显著升高，而其他凋亡相关蛋白的mRNA水平无明显改变（图10。更为重要的是，在对miR-29表达水平和BidmRNA水平进行相关性分析时发现，细胞中miR-29a水平与BidmRNA水平呈负相关，具有统计学意义（图11。结合图5所示HIV感染能显著下调⑶4+T细胞内miR-29a水平，这些数据有力地支持了Bid是miR-29a调节的靶点。[0080]图12显示了miR-29a与BidmRNA的可能结合位点（人BidmRNA开放阅读框序列如SEQIDNo.5所示）。[0081]为了进一步确认HIV感染细胞中miR-29a作用的靶点，我们取健康人外周血⑶4+T细胞并感染pNL4_3病毒，感染后4天加入miR-29amimic，感染后6天检测Bid、Bim、puma、Bmf、Bakl以及Bax的蛋白水平，检测结果见图13。[0082]如图13所示，miR-29amimic能明显抑制⑶4+T细胞中Bid蛋白水平，进而抑制细胞凋亡，而其他促凋亡蛋白的蛋白水平变化不明显。[0083]上述实验结果显示，miR-29amimic的导入能恢复HIV感染的CD4+T细胞中的miR-29水平，进而靶向到促凋亡分子BidmRNA，下调其表达，进而抑制⑶4+T细胞凋亡。[0084]实施例4向T细胞中导入miR-29amimic的有效方法[0085]由于人的T细胞是悬浮细胞，用转染试剂进行基因导入有困难。目前比较常用的方法有慢病毒载体和电穿孔法介导的基因导入，由于慢病毒载体存在回复突变的可能，出于安全性考虑较少用于人的细胞。因此我们分别合成带有5’端胆固醇修饰和2’-OMe修饰的miR-29amimic，以及不带5’端胆固醇修饰、仅带2’-OMe修饰的miR-29amimic。[0086]将健康人外周血来源的CD4+T细胞进行活化并感染pNL4-3病毒，然后用电穿孔法将不带5’端胆固醇修饰、仅带2’-OMe修饰的miR-29amimic分别导入初始T细胞和活化T细胞中，并设置controlmimic处理组作为对照，观察电穿孔法对T细胞凋亡的影响，观察结果见图14〇[0087]由图14可见，采用电穿孔法导入基因对初始T细胞产生了较大损伤，约50%的初始T细胞发生凋亡；而活化T细胞对电穿孔法更为敏感，约90%以上的活化T细胞发生凋亡，无法进行后续实验，因此我们放弃电穿孔法。[0088]而带有5’端胆固醇修饰和2’-OMe修饰的miR-29amimic则无需转染试剂的帮助，能直接、高效地进入T细胞。在pNL4_3病毒感染后4天，我们将miR-29amimic、controlmimic*别加入培养细胞，发现miR-29amimic和controlmimic均能有效进入T细胞（图2，而且与未处理组相比，controlmimic组对T细胞凋亡无明显影响（图3和图7b。由此可见，对microRNA的5’端进行胆固醇修饰、对microRNA的核糖进行2’-OMe修饰是目前比较适合T细胞的小RNA导入方法。

权利要求：1.一种抑制Bid蛋白表达的miR-29a模拟物，其特征在于，基因序列为：5’-UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUAUAACCGAUUUCAGAGGUGCUA-3’，所述基因序列的5’端带有胆固醇修饰，基因序列中的所有核糖均带有2’-OMe修饰。2.如权利要求1所述的miR-29a模拟物在制备Bid蛋白表达抑制剂中的作用。3.如权利要求1所述的miR-29a模拟物在制备抑制CD4+T细胞凋亡药物中的应用。4.如权利要求1所述的miR-29a模拟物在制备抑制HIV病毒诱导的CD4+T细胞凋亡的药物中的作用。

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