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申请/专利权人：中国水稻研究所

摘要：本发明公开了一种水稻CSP41b基因突变体lgl1及应用，属于基因工程技术领域。该基因位于水稻第12染色体上，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因表现为叶色变淡和叶绿体形态改变等表型。相对于CSP41a蛋白，在光合生物中CSP41b蛋白的保守性较高。

主权项：一种水稻CSP41b基因突变体lgl1，其特征在于，该基因位于水稻第12染色体上，其为水稻CSP41b基因第四外显子782位处缺失39个碱基，所缺失的碱基为AGACTTTGATTTCGTTAAGACAAGCCTTGCGGCAAAGGG。

全文数据：水稻CSP41b基因突变体Ig11及应用技术领域[0001]本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种水稻CSP41b基因突变体Igl1及应用。背景技术[0002]叶绿素是光合作用中最为重要的分子，它捕获来自太阳的光能，并将其转换为化学能，赋予光合植物绿颜色。叶绿素主要位于叶绿体的类囊体膜上。叶绿素代谢的精细调控是叶绿体的发育和维持其正常功能所必须的。叶色突变体在许多不同植物中被发现，并广泛用于探索叶绿素代谢和叶绿体发育。[0003]到目前为止，水稻中已克隆了10多个黄绿叶突变相关基因。OsCAOl编码叶绿素a氧化酶，在叶绿素b合成中扮演主要角色。Ygll编码叶绿素合成酶，它催化叶绿素酸酯转化为叶绿素，是叶绿素合成的最后一步。Cdelt编码谷氨酰tRNA合成酶，谷氨酰tRNA是叶绿素合成必需中间产物。OsDVR基因编码一个联乙烯还原酶，催化联乙烯叶绿素酸酯转换为单乙烯叶绿素酸酯KVyl编码叶绿体酪蛋白酶P6亚基。ygl2编码血红素加氧酶1，催化血红素降解。YGL138⑴，编码一个信号识别颗粒蛋白，可能参与叶绿体蛋白转运。ChllYgl3YGL7和Chl9分别编码Mg-原卟啉IX螯合酶的ChlD和ChlI亚基，它催化原卟啉IX转换到Mg-原卟啉IXJgie编码一个假定的3-β-羟类固醇脱氢酶异构酶家族蛋白，可能在油菜素内酯的合成中发挥作用。YGL8编码UMP激酶，催化UMP磷酸化为UDP。此外，0SHAP3A和OsNOAl的RNA干涉转基因植株均显示为黄绿叶表型。0sHAP3A编码一个CCAAT-box结合复合体的ΗΑΡ3亚基，具有调节叶绿体发育的功能。OsNOAl编码一个环状排列的GTP酶，参与叶绿体核糖体装配。上述这些基因中，只有Ygl6位于12号染色体上。发明内容[0004]有鉴于此，本发明提供了一种水稻CSP41b基因突变体Igll及应用，本发明从一个水稻转基因株系中发现了一个新的淡绿叶突变体，被命名为lgll。通过图位克隆，Igll基因定位于第12染色体分子标记L5和L6之间的76.5kb区域内。测序和互补分析表明Igll表型是由CSP41b基因突变引起的。[0005]为了解决上述技术问题，本发明公开了一种水稻CSP41b基因突变体Igll，该基因位于水稻第12染色体上，其为水稻CSP41b基因第四外显子782位处缺失39个碱基，所缺失的碱基为AGACTTTGATTTCGTTAAGACAAGCCTTGCGGCAAAGGG〇[0006]进一步地，水稻CSP41b基因突变体Igll的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。[0007]本发明还公开了一种含水稻CSP41b基因突变体Igll的表达载体。[0008]本发明还公开了一种含上述的表达载体的宿主细胞。[0009]本发明还公开了一种上述淡绿叶突变体Igll基因在控制水稻叶色和叶绿体形态发育中的应用。[0010]本发明还公开了一种使水稻叶色变淡的方法，所述方法包括通过RNAi、Anti-senseRNA、基因敲除或基因失活的方法降低具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列对应的多肽的表达或活性。[0011]与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：[0012]1本发明从一个水稻转基因株系发现一个淡绿叶突变体Igll。通过精细定位本发明将Igll基因定位于第12染色体MC克隆OSJNBa0037L20INDEL分子标记L5和L6之间76.5kb的区间。在这个区域迄今未报道过叶色相关基因。测序分析和互补实验显示Igll基因编码一个41kDa叶绿体茎环结合蛋白（CSP41b。[0013]2叶绿体茎环结合蛋白CSP41a和CSP41b起源于蓝藻，所有光合生物都发现了这两个紧密相关的蛋白。同时缺失CSP41a和CSP41b的拟南芥突变体不能存活，而只缺失其中一个基因仍能存活，因此CSP41a和CSP41b至少部分功能冗余。然而，CSP41b在体内的作用比CSP41a更重要，因为拟南芥csp41a突变体没有明显表型变化，而csp41b突变导致叶色，叶绿体形态，光合作用和生物钟等一系列形态生理变化。水稻和拟南芥的CSP41b蛋白高度保守，和CSP41b蛋白的保守性一致，水稻csp41b突变体也表现为叶色变淡和叶绿体形态改变等表型。相对于CSP41a蛋白，在光合生物中CSP41b蛋白的保守性较高。[0014]3本发明研究显示大量的叶绿素生物合成和光合作用相关基因在csp41b突变体中是上调的，暗示在水稻中CSP41b蛋白可能仅仅结合和稳定一小部分参与叶绿素合成和光合作用基因的mRNAs。[0015]4与野生型植株相比，苗期Igll突变体有更低的叶绿素a叶绿素b比值，也有更少的类胡萝卜素（图1E，然而在成熟期Igll突变体的叶绿素a叶绿素b比值比野生型更高，类胡萝卜素含量要高于野生型（图1G。叶绿素a释放化学能，是包括水稻在内的大部分光合生物所必须的，而叶绿素b和类胡箩卜素是辅助色素，叶绿素b和类胡萝卜素含量有更大的弹性以适应不同环境条件。[0016]当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明[0017]此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：[0018]图1是本发明Igll突变体的表型和色素含量;其中，野生型水稻品种日本晴（左边）和Igll突变体右边在苗期的表型；⑶日本晴（左边和Igll突变体右边在分蘖期的表型；（C，D日本晴C和Igll突变体⑶在成熟期的表型；（E野生型和Igll突变体在苗期的色素含量；（F野生型和Igll突变体在分蘖期的色素含量；（G野生型和Igll突变体在成熟期的色素含量;chl，叶绿素;car，类胡萝卜素。数值是6个生物学重复的平均值；[0019]图2是本发明Igll突变体苗期叶绿体的超微结构；（A-D野生型水稻品种日本晴A，C和Igl1突变体B，D叶绿体的电子显微图像;S，淀粉粒;T，类囊体膜系统；[0020]图3是本发明Igll基因的精细定位和突变位点分析;其中，Igll基因定位于第12染色体MC克隆0SJNBa0037L20分子标记L5和L6之间76.5kb的区间；椭圆形代表Igll基因TIGR位点0sl2g23180;白盒和黑盒是外显子；白盒为非编码区域；黑盒为编码区域;两个黑盒之间的线段为内含子;虚线为Igll突变体核苷酸缺失部分；[0021]图4是本发明转基因互补实验使Igll突变体恢复正常表型；其中，（AIgll突变体左），导入野生型CSP41b基因的Igll突变体⑶I中），野生型品种日本晴；⑶COl转基因植株突变位点检测；[0022]图5是本发明Igll及其同源蛋白的系统进化树；[0023]图6是本发明CSP41b-GFP融合蛋白在水稻原生质体的亚细胞定位，其中，（A-H35S:GFP和35S:CSP41b-GFP分别转入水稻原生质体;叶绿素荧光A，E，GFP荧光B，F和微分干涉差显图像C，G分别由激光共聚焦显微镜拍摄获得，然后再将3幅图像合并融合D，H;标尺为5μηι;[0024]图7是本发明RealTimePCR分析Igll基因在不同器官的表达水平；[0025]图8是本发明比较Igll突变体和野生型植株中叶绿素合成和光合作用相关基因的表达水平；[0026]图9是本发明SI不同生物CSP41b蛋白的序列联配;氨基酸序列联配揭示CSP41b蛋白在不同物种中高度保守;信号显示不同生物具有相同的氨基酸。具体实施方式[0027]以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。[0028]实施例1:突变体的分离与遗传分析[0029]1、材料和方法：[0030]1.1、植物材料[0031]Igll突变体的遗传背景为粳稻品种日本晴。突变体和野生型日本晴的杂交Fi和F2代个体用于遗传和表型分析。Igll突变体和籼稻品种龙特普的杂交FdPF3代突变个体用于Igll基因的精细定位。取突变体和日本晴苗期2个星期）、分蘖期5个星期和成熟期（12个星期）的最新的完全伸展叶用于色素分析，每个样品设6次重复。本研究的所有材料均种植于位于杭州市富阳区的中国水稻研究所的试验田（119°57’E，30°03’N。[0032]1.2、色素含量测定[0033]将新鲜叶片浸泡于80%的丙酮中，浸泡液用分光光度计测量在470，645和663nm下的光密度（DU800UVVisSpectrophotometer,BeckmanCoulter,CA,USA。参照Arnon的方法根据光密度计算总叶绿素含量，叶绿素a含量和叶绿素b含量（D.I.Arnon，CopperEnzymesInIsolatedChloroplasts.PolyphenoloxidaseInBetaVulgaris，Plantphysiol.2419491-15.。类胡萝卜素含量的计算参照Wellbum的方法A.R.Wellbum，Thespectraldeterminationofchlorophyllsaandb，aswellastotalcarotenoids,usingvarioussolventswithspectrophotometersofdifferentresolution,J.Plantphysiol.1441994307-313.〇[0034]1.3、电镜观察[0035]取2周大植株的完全伸展叶，先用2.5%戊二醛固定，然后用I%的锇酸进行后固定。用梯度酒精脱水，脱水后样品从100%的乙醇转移到纯丙酮中。样品包埋于树脂，然后用超薄切片机切片。样本经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，在透射电子显微镜下观察JEM-1230,JEOL,Tokyo,JapanD[0036]淡绿叶突变体Igll发现于以日本晴为遗传背景的一个水稻转基因株系中。和野生型植株明显不同，Igll突变体在整个生长周期中均表现为淡绿叶表型（图1A-D。测量不同时期最新完全伸展叶的叶绿素和类胡萝卜素含量，结果显示，突变体叶片在不同生长时期的叶绿素a和叶绿素b含量都明显少于野生型（图1E-G。在苗期突变体的叶绿素a和叶绿素b的比值以及类胡萝卜素含量也少于野生型植株图1E。然而在成熟期突变体的叶绿素a和叶绿素b的比值以及类胡萝卜素含量却高于野生型植株图1G。[0037]取生长30天的野生型和突变体的完全生长叶，制片后进行透射电镜观察。结果显示，突变体叶绿体的大小和野生型植株没有显著差别。然而和野生型比较，突变体的小淀粉粒数量明显增多（图2A-B，突变体叶绿体的类囊体膜明显扭曲变形（图2C-D。[0038]Igl1突变体和它的亲本日本晴杂交获得的Fl代植株为野生型表型。Fl植株自交产生的F2代植株野生型和突变体的比率为3:1x2=0.59〈x20.05=3.84，因此Igll表型受单隐性核基因控制。[0039]实施例2:突变基因的精细定位[0040]根据粳稻品种日本晴和籼稻品种9311的序列差异设计新的InDel分子标记。新设计的InDel分子标记引物序列（SEQIDNO.2-SEQIDNO.13见表1。用于定位的PCR反应依照11^11等人进行（¥丄;[11，¥.卩11，6.!111，!1.3;[，1^.21111，0.¥11，2.31111，116111:1;1^01:;[011已111finemappingofathermo-sensitivechlorophylldeficientmutantinriceOryzasativaL.,Planta2262007785-795.40?产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析参照0·Panaud等人进行（0·Panaud，X·Chen，S·R·McCouch，Developmentofmicrosate11itemarkersandcharacterizationofsimplesequencelengthpolymorphismSSLPinriceOryzasativaL.，Mol.Gen.Genet.2521996597-607·。[0041]表I用于Igll基因精细定位新设计的分子标记[0042][0043]Sizebp1以日本晴为模板相应分子标记PCR产物的碱基数。[0044]Sizebp2以9311为模板相应分子标记PCR产物的碱基数。[0045]将Iyll基因定位于76.5kb的区域后，通过RocheFastStart高保真PCR系统扩增突变体目标区域的特异片段。这些片段被克隆到PMD18-T载体，然后送上海生工生物工程有限公司测序。[0046]为了获悉Igll基因在染色体的大致位置，本发明观察21个来源于突变体和龙特普杂交获得的F2代突变体的基因型，结果显示Igll基因和第12染色体的RMlOl48.2cM和RMl24665.3cM连锁。为了进一步缩小Igll基因所在位置，本发明新设计了6个新的InDe1分子标记表1。利用新设计的分子标记和1984个F2和F3突变个体最终将Igll基因定位于BAC克隆0SJNBa0037L20内分子标记L5和L6之间76.5kb的区间（图3。对目标区域测序后发现，突变体在CSP41b基因（TIGRlocusL0C_0sl2g23180的第4外显子有一个39bp的缺失图3XSP41b基因编码一个叶绿体41kDa的莖环结合蛋白（chloroplaststemloopbindingproteinof41kDa，该蛋白在叶绿体的正常运行中起重要作用。因此，CSP41b基因最可能为Igll基因的候选基因。[0047]实施例30SJNBa0037L20基因功能互补验证[0048]利用带酶切位点的引物5'-GAATTCGTTCTTGCCCATTTCGGAT-3'EcoRISEQIDNO.14和5LAAGCTTACTCGTAGTGAAGCACACGC-3'HindIIISEQIDNO.15扩增包含CSP41b基因的5.7kb野生型基因组片段，扩增产物连接到pMDIS-T载体上。目的片段经测序后，连接至IJpCAMBIA1300载体上。然后通过农杆菌介导的遗传转化方法将该载体转化到Igll突变体中。转基因植株利用位于突变位点两端的一对引物MUlj^GCAGGGCTACTATGGTGGTT-S'SEQIDN0·16，MU2:5-AAGTTCAGTGAGATGGCGTTAA-3SEQIDN0·17进行检测。[0049]为了进一步证实CSP41b基因的突变导致Igll表型，本发明构建了一个包含野生型CSP41b基因的双元载体。通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法，本发明将该载体导入到Igll突变体中。转基因植株用MUl引物对进行PCR检测。突变体中由于该区段含有一个39bp的缺失，扩增产物小于野生型植株，而转基因植株COl的PCR产物既有野生型的扩增条带也有突变体的条带，因此，野生型CSP41b基因成功导入到突变体中（图4BWCR检测显示，本发明一共获得了15个独立转化植株，这些植株的突变表型均恢复为野生型（图4A。互补实验进一步证实CSP41b基因突变导致Igll表型。[0050]实施例4CSP41b及其同源蛋白的系统进化分析[0051]利用BLASTP工具搜索Igl1蛋白的同源蛋白。用DNAMN软件对搜索到的蛋白序列与Igll蛋白进行全局联配。利用第4版MEGA软件通过邻接法neighbor-joiningmethod构建系统进化树。各分支上的数字为自引导值1000次重复抽样检验）。[0052]通过BLASTP搜索CSP41b蛋白的同源蛋白，结果显示，CSP41b蛋白广泛存在于光合生物中，不仅在高等植物中，低等的藻类和苔藓植物也有CSP41b蛋白，说明CSP41b蛋白在光合生物诞生之初就出现了。所有的这些生物中，CSP41b蛋白仅有一个拷贝。系统进化分析显示水稻CSP41b蛋白和玉米、高粱等单子叶植物的同源蛋白亲缘关系较近（图5。水稻CSP41b蛋白和莱茵衣藻Chlamydomonasreinhardtii的同源蛋白同源性也非常高，324个氨基酸残基中有221个氨基酸相同（identity68%，221324。比对结果说明CSP41b蛋白在光合生物的进化过程中非常保守（图9。[0053]实施例5亚细胞定位分析[0054]为了探析CSP41b蛋白在亚细胞水平的分布，本发明构建了由CaMV35S启动子驱动的CSP41b-GFP融合蛋白表达载体。以野生型cDNA为模板，利用含酶切位点的特异引物对57-GGATCCAGATGGCAGCAACAGCCTC-37BamHISEQIDNO.18,57-TCTAGAGACGCTGACGAGCTTCTT-37XbaISEQIDNO.19扩增获得Igll基因的编码序列，扩增产物导入PMD18-T载体后进行测序，测序正确后通过酶切连接将CSP41bgene和GFP基因融合。融合基因载体导入水稻原生质体，将原生质体置于载玻片上，用激光共聚焦显微镜观察拍照（CarlZeiss,Inc.,Thornwood，NY,USA〇[0055]亚细胞定位分析软件TargetP预测CSP41b蛋白定位于叶绿体。通过载体构建，将CSP41b蛋白和GFP蛋白融合，并由35S启动子驱动表达，将融合表达载体导入水稻原生质体。转化原生质体的GFP荧光和叶绿素自发荧光共定位，而无对照CSP41b蛋白的GFP蛋白在细胞核和细胞质中均有分布图6A-D;结果进一步证实Igll蛋白定位叶绿体定位图6E-H。[0056]实施例6实时定量PCR分析[0057]利用Qiagen公司的植物RNA提取试剂盒和DNA酶提取和纯化水稻总RNAQiagen，Hilden,Germany·利用Roche公司的高保真cDNA合成试剂盒合成第一链cDNAsRoche，IndianapoIis，USA。利用美国应用生物系统公司的SYBRGreen试剂在该公司的定量PCR仪7900HT上进行定量PCR分析。每个转录本的表达水平以OsACTl为对照基因利用比较CT值法获得。PCR反应程序如下：95°C预加热10min;95°C变性15s，60°C退火延伸lmin，共40个循环。定量PCR的引物序列（SEQIDNO.20-SEQIDNO.45列在表2中。[0058]表2用于RealTimePCR分析的引物[0059][0060]提取成熟期的野生型植株（12周）的根、穗、叶片、叶鞘和茎的mRNA，然后利用RealTimePCR分析Igll基因在各组织的表达情况，结果显示，Igll基因在所有检测组织中均有表达，但在叶中表达量明显高于其它组织（图7。[0061]实施例81gll基因调节叶绿素合成和光合作用相关基因的表达[0062]叶色突变影响叶绿素合成和光合作用相关基因的表达。取成熟期（12周）叶片提取RNA，然后利用RealTimePCR分析叶绿素合成基因ChlD编码镁离子螯合酶亚基ChlD，ChlI，ChlH，Hemal编码谷氨酰tRNA还原酶），Ygll编码叶绿素合成酶），P0R编码NADPH依赖的原叶绿素酸酯氧化还原酶和光合作用相关基因CablR，Cab2R编码光系统II捕光叶绿素ab结合蛋白），PsaA编码光系统I反应中心多肽），PsbA编码光系统II反应中心多肽），rbcL编码RuBisCO大亚基在突变体和野生型植株中的表达变化。结果显示，Igll基因的功能缺失导致ChlD，ChlI,Hemal,Ygll，P0R,CablR，Cab2R和PsaA的表达显著增加Fig.8。然而rbcL在突变体中表达量减少。ChlH和PsbA在突变体和野生型中的表达没有明显差异（图8。以上结果显示Igll突变不仅影响叶绿素的生物合成也干扰植株的光合作用。[0063]上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

权利要求：1.一种水稻CSP41b基因突变体Igll，其特征在于，该基因位于水稻第12染色体上，其为水稻CSP4Ib基因第四外显子782位处缺失39个碱基，所缺失的碱基为AGACTTTGATTTCGTTAAGACAAGCCTTGCGGCAAAGGGo2.根据权利要求1所述的水稻CSP41b基因突变体Igl1，其特征在于，所述水稻CSP41b基因突变体Igll的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.含权利要求1或2所述的水稻CSP41b基因突变体Igll的表达载体。4.含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。5.权利要求1所述的淡绿叶突变体Igll基因在控制水稻叶色和叶绿体形态发育中的应用。6.—种使水稻叶色变淡的方法，其特征在于，所述方法包括通过RNAi、Anti-senseRNA、基因敲除或基因失活的方法降低具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列对应的多肽的表达或活性。

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