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申请/专利权人：中国医学科学院病原生物学研究所

摘要：本发明公开了博卡病毒HBoV共有的特异性表位肽、其应用及其抗体。具体地，所述特异性表位肽为MSDTDIQDQQPDTVDAPQNT或EHAYPNASHPWDEDVMPDL。

主权项：在HBoV1‑4中通用的博卡病毒特异性抗原表位肽，其序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。

全文数据：博卡病毒HBoV共有的特异性表位、其应用及其抗体技术领域[0001]本发明涉及博卡病毒，特别是可用于该病毒所致疾病诊断的表位，其应用及其抗体。背景技术[0002]人博卡病毒huamnbocavirus，HBoV是近年新发现的病毒，是目前已知的感染人类的第二种细小病毒。HBoV已发现四种基因型HBoVl-4，HBoVl于2005年在瑞典一位急性呼吸道感染儿童的鼻咽样本中发现。随后，又有三种博卡病毒HB〇V2-4于2009〜2010年在粪便样本中陆续被发现。[0003]人博卡病毒的感染呈世界性分布，病毒不仅可以在呼吸道、粪便样本中检出，而且在血清、扁桃体、唾液和尿液中均有检出。对呼吸道样本的PCR检测结果分析显示，根据国家、地区、检测方法和人群的不同，HBoVl的检出率约为2-19%，其中在6个月〜2岁的婴幼儿中检出率最高，而在其他年龄组儿童和成人中检出率较低。因为HBoVl经常在上下呼吸道感染的样本中检出，被认为是与呼吸道感染有关的潜在的致病因子。与HBoVl不同，HBoV2-4经常在粪便标本中检出，极少会在呼吸道感染样本中检出，因此HB〇V2和HB〇V3可能与胃肠炎有关。在儿童肠道样本中，HBoV2检出率达26%，其次是HBoV35%和HBoV42%。[0004]博卡病毒经常与其它病毒共检出，而且可以在鼻咽部持续存在，因此博卡病毒与疾病的关系一直受到争议。近年来，严重和致死性的博卡病毒感染陆续被报道。Mitui等在2009-2010年四例严重脑炎患者（其中两例死亡）的脑脊液和血清样本中检测到HBoVl和HB〇V2的核酸，而在脑脊液中没有检测到其它任何病原体[参见：MituiMT，TabibSM，MatsumotoT，etal.Detectionofhumanbocavirusinthecerebrospinalfluidofchildrenwithencephalitis.ClinInfectDis，2012,54:964_7·];2010年，斯洛维尼亚一位20岁急性呼吸道感染患者发展为急性呼吸衰竭和气胸，在支气管抽吸物、鼻咽拭子和血浆样本中均检出高拷贝的HBoVIDNA，博卡病毒被证明为该患者唯一的病原体（参见：UrsicT?SteyerA?KoprivaS，etal.HumanbocavirusasthecauseofaIife-threateninginfection.JClinMicrobiol，2011，49:1179_81;2011年，德国一位严重呼吸道感染的婴儿也被证明为急性HBoVl的感染参见::KiirnerRW，SMerluiid-Veiierm〇M，vanKoningsbruggen-RietschelS，etal.Severehumanbocavirusinfection，Germany.EmergInfectDis，2011，17:2303-5.D这些证据强烈支持博卡病毒可以单独作为致病因子。此外，荷兰的一项对从婴幼儿到青春期健康儿童的纵向研究也进一步证明HBoVl的感染与急性呼吸道疾病和耳炎具有高度相关性（参见：MeriluotoM，HedmanL，TannerL，etal.AssociationofhumanbocavirusIinfectionwithrespiratorydiseaseinchildhoodfollow-upstudy?Finland.EmergInfectDis.2012?18：264-71.。[0005]博卡病毒属线性单股DNA病毒，其基因组大小约为5kb，含有三个开放阅读框，分别编码非结构蛋白NS1、NP1和两个有重叠的衣壳蛋白VPl和VP2AS1基因最早被转录、翻译，与病毒DNA的复制相关;VPl和VP2蛋白是病毒的结构蛋白，具有良好的抗原性，而非结构蛋白NPl的功能目前尚不清楚。VP2蛋白含有博卡病毒的主要抗原并可以形成病毒样颗粒VLP，博卡病毒VLP具有和病毒体相似的形态和抗原性，已经作为抗原成功地用于博卡病毒抗体的检测。[0006]对HBoVl-4的主要结构蛋白VP2的氨基酸序列比对结果显示，几种不同的博卡病毒VP2蛋白序列之间存在较高的同源性，例如，HBoVlVP2与HBoV2-4VP2的序列同源性约为77-78%，HBoV2VP2与HBoV3-4VP2的序列同源性约为88-90%，HBoV3VP2与HBoV4VP2的序列同源性约为90.7%。近来的研究也证明耶〇¥1-4¥?2¥1^8之间存在血清学交叉反应参见11^〇1K,HedmanL,ArthurJ，etal.Seroepidemiologyofhumanbocaviruses1-4.JInfectDis,2011,204：1403-12；GuoL，WangY，ZhouH，etal.Differentialseroprevalenceofhumanbocavirusspeciesl_4inBeijing,China.PLoS0ne，2012,7:e39644〇这说明在HB〇Vl-4VP2之间可能存在共同的抗原表位。[0007]目前，对博卡病毒的血清学诊断主要是利用VLP作为抗原进行ELISA分析，但是VLP的制备需要细胞培养过程，相对费力，而且耗时较长，制备不方便，不适合于大规模研究。而来源于博卡病毒主要结构蛋白VP2的抗原表位具有高度保守性和特异性。因此源于表位基础的ELISA方法可以对博卡病毒进行快速而简单的血清学诊断。然而，对于博卡病毒VP2蛋白的抗原表位研究没有相关报导。[0008]在本研究中，我们成功鉴定了两个在HBoVl-4中高度保守的特异性表位。在此基础上，我们建立了基于所述特异性表位的博卡病毒IgMELISA检测方法，该方法与基于VLP的博卡病毒IgMELISA检测方法具有良好的相关性。发明内容[0009]在本研究中，我们利用博卡病毒VP2基因片段噬菌体库对HBOV1-3VP2蛋白的抗体及博卡病毒阳性人血清进行筛选，获得四簇反应性较强的抗原表位，结合序列分析，合成2条优势抗原表位多肽，与KLH偶联后免疫小鼠，获得抗血清。通过酶联免疫吸附法和免疫印迹鉴定、序列比对等方法，确定了2条在HBoVl-4中通用的博卡病毒特异性抗原表位，并建立了基于所述特异性表位的博卡病毒IgM检测方法。[0010]本发明第一方面提供HBoVl-4中通用的博卡病毒特异性抗原表位肽，其序列为SEQIDNO:1或SEQIDNO:2。[0011]本发明第二方面提供一种检测博卡病毒抗体的非诊断方法，包括：[0012]1使样本与本发明第一方面所述的博卡病毒特异性抗原表位肽接触；[0013]2检测抗原-抗体反应，结果为阳性说明存在博卡病毒抗体。[00M]在一个实施方案中，所述样本是人血清。[0015]在另一个实施方案中，所述检测抗原-抗体反应的过程为:先加入辣根过氧化物酶山羊抗人IgM孵育，再加入TMB显色，最后检测吸光值。[0016]在又一个实施方案中，上述要检测的吸光值是0D450。[0017]本发明第三方面提供一种博卡病毒检测试剂盒，其包含本发明第一方面所述的博卡病毒特异性抗原表位肽。[0018]在一个实施方案中，所述试剂盒还包含辣根过氧化物酶山羊抗人IgM和TMB。[0019]本发明第四方面提供本发明第一方面所述的博卡病毒特异性抗原表位肽用于检测博卡病毒抗体的非诊断用途。[0020]本发明第五方面提供针对本发明第一方面所述的特异性抗原表位肽的博卡病毒抗体。[0021]在一个实施方案中，所述博卡病毒抗体是通过将本发明第一方面所述的特异性抗原表位肽与KLH偶联再免疫小鼠而制备的。附图说明[0022]图1为博卡病毒VP2蛋白免疫优势表位筛选图。其中图最上面所示543个氨基酸的序列是HBoVl111^07株^enBank号JQ240469VP2蛋白的氨基酸序列。[0023]图2为合成肽抗血清anti-Pl、anti-P2的滴度A及其与HB〇Vl-4、人细小病毒B19和PARV4的VLP的反应⑶。[0024]图3为表位Pl和P2关键氨基酸分析。其中“肽抑制物”是指实施例3中所述的各合成短肽。具体实施方式[0025]下面结合优选实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体的实验方法，通常按照常规实验条件和方法，如分子克隆实验室手册（Sambrook，etal.NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989中所述方法或试剂制造商提供的方法。[0026]实施例1.博卡病毒VP2蛋白免疫优势表位的鉴定[0027]本文中所用的HB〇Vl-3VP2基因源自博卡病毒阳性腹泻粪便样本111-BJ07,211-BJ07和46-BJ07Genbank号分别为：JQ240469，JQ240470和HMl32056。依据文献公开的方法分别构建HB〇Vl_3VP2基因的随机噬菌体库，分别命名为库HBoVl-VP2，HBoV2-VP2和HBoV3-VP2。然后分别利用申请人制备的鼠抗HB〇Vl-3VP2抗体和博卡病毒阳性人血清对HBoVl-3VP2基因随机噬菌体库进行亲和筛选随机噬菌体库制备方法及筛选方法参见KhuranaS，SuguitanALJr,RiveraY,etal.AntigenicfingerprintingofH5Nlavianinfluenzausingconvalescentseraandmonoclonalantibodiesrevealspotentialvaccineanddiagnostictargets.PLoSMed，20096:el000049。图I所示为分别用鼠抗HBoVl-3VP2抗体和博卡病毒阳性人血清通过亲和筛选获得的阳性克隆的表位分布情况，筛选出的抗原表位可以进一步分为四个簇（I，II，III，IV。由图中所示结果可以看出，在l-20aa和162-180aa附近存在优势表位。[0028]实施例2.免疫优势表位的免疫原性和抗原特征[0029]2.1肽与KLH的偶联[0030]根据博卡病毒抗原表位分布情况和HB〇VlVP2蛋白序列分析，合成Pl和P2两条优势抗原表位肽序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDN0:2所示），并分别与KLH偶联以增加多肽的免疫原性表1，用于免疫小鼠。肽的合成及与KLH的偶联委托上海生物工程技术有限公司完成。[0031]表1.免疫所用肽-KLH偶联物的序列[0033]a表示多肽在HBoVl111-BJ07株（GenBank号JQ240469VP2蛋白（序列如SEQIDNO:3所示）中的相应位置[0034]2.2免疫方案[0035]用上述KLH偶联多肽对6-8周龄的雌性Balbc小鼠进行免疫。免疫方案如下：共进行3次免疫，每次间隔14天。首次免疫时，将等体积肽-KLH偶联物与弗氏完全佐剂混合，每只小鼠皮下注射IOOyg肽-KLH偶联物。加强免疫时，将等体积肽-KLH偶联物与弗氏不完全佐剂混合，每只小鼠皮下注射50yg肽-KLH偶联物。在最后一次免疫14天后眼球采血。分离血清置于-20°C保存备用。[0036]2.3免疫血清滴度测定[0037]分别将Pl和P2用包被液pH9.6的碳酸盐缓冲液:碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，加水稀释至IOOOmL进行稀释终浓度Iyg孔后包被酶标板Costar公司产品），置4°C过夜，加入封闭液（I^BSAA3BS置37°C孵育2小时，用0.1%PBST缓冲液洗涤5次，甩干洗涤液。每孔加入1〇〇μ1系列稀释从1:2,500开始进行倍比稀释至1:160,000的相应小鼠免疫血清，同时设立未免疫小鼠血清作为对照，置37°C孵育1小时，甩掉液体，用0.1%PBST缓冲液洗涤5次。然后每孔加入ΙΟΟμΙ1:40,000稀释的辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgGSigma公司产品），置37°C孵育1小时，甩掉液体，用0.1%I3BST缓冲液洗涤5次。每孔加入100μ13，3'，5，5'-四甲基联苯胺TMB底物避光显色15分钟，加入50μ12ΜH2SO4终止反应，测定450nm处的吸光值。结果见图2A，显示Pl和P2均诱导出较强的抗体，以免疫前小鼠血清0D450nm的2.1倍作为cut-off值，抗体滴度均达1:160,000,提示Pl和P2均具有较强的免疫原性。[0038]2.4免疫血清与HB〇Vl-4的VLP反应性及反应的特异性[0039]按照文献公开的方法制备HBoVl-4、细小病毒B19和PARV4VLPS，并进行超离纯化[参见GuoL，WangY，ZhouH，etal.Differentialseroprevalenceofhumanbocavirusspeciesl-4inBeijing,China.PLoS0ne.2012；76：e39644]〇[0040]将IOOng超离纯化的HBoVl-4、细小病毒B19和PARV4VLP，以及细胞对照分别进行12%SDS-PAGE后转至硝酸纤维素膜Pal1公司产品）。用5%脱脂奶室温封闭2小时，与1:1，〇〇〇稀释的免疫小鼠血清孵育过夜。膜经〇.1%PBST洗涤5次，加入1:10,000稀释的mBye®Fluor800标记的山羊抗小鼠IgG二抗Li-Cor公司）。用0·I%PBST充分洗膜后，用Odyssey®近红外成像系统Li-Cor公司）扫膜，用Odyssey软件进行分析。结果见图2B，免疫小鼠血清在进行1:1000稀释时，Pl和P2免疫小鼠血清与HB〇Vl-4VLP均进行特异性反应，而与细小病毒B19和PARV4VLP没有反应，这说明Pl和P2是HB〇Vl-4中共有的、特异性的抗原表位。[0041]实施例3.Pl和P2合成肽表位的精细定位[0042]为了进一步确定Pl和P2肽中起关键作用的氨基酸残基，我们合成了一系列肽段，结果见表2和表3。[0043]表2用于Pl肽精细定位的肽段[0045]表3用于P2肽精细定位的肽段[0047]竞争ELISA检测：分别将Pl和P2用包被液pH9.6的碳酸盐缓冲液:碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，加水稀释至IOOOmL进行稀释（lyg孔后包被酶标板Costar公司产品），置4°C过夜，加入封闭液（I^BSAA3BS置37°C孵育2小时，用0.1%PBST缓冲液洗涤5次，甩干洗涤液。同时将不同浓度3QXIOpmol孔，S1XIOpmol孔，32XIOpmol孔，33XIOpmol孔，34XIOpmol孔，35XIOpmol孔，36XIOpmol孔，37XIOpmol孔的上述合成肽在竞争ELISA中作为全长肽的抑制物与1:1000稀释的P1、P2小鼠抗血清实施例2制备混合，并设立未加合成肽的P1、P2小鼠抗血清作为对照，置4tC孵育2小时。将孵育后的肽-抗体混合物及对照以ΙΟΟμΙ孔的量加入上述包被好的酶标板中，37°C孵育1小时，甩掉液体，用0.1%PBST缓冲液洗涤5次。然后向每孔加入ΙΟΟμΙ1:40，000稀释的辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgGSigma公司产品），置37°C孵育1小时，甩掉液体，用0.1%I3BST缓冲液洗涤5次。再向每孔加入100μ13，3'，5，5'-四甲基联苯胺TMB底物避光显色15分钟，再加入50μ12ΜH2SO4终止反应，测定450nm处的吸光值。以不加合成短肽的孔（对照）在450nm处的吸光值为标准值100%，得到不同浓度的各合成短肽的抗体结合百分比。[0048]根据不同肽段分别与P1、P2小鼠抗血清的ELISA反应结果（图3，可以推断，Pl的关键肽段为6iqdqqpdtvd15,关键氨基酸位点为Q7和P11;P2的关键肽段为161NASHP171和176VMPDL18t3，关键氨基酸位点为N167，Hm，P178，和L18t3。[0049]实施例4.基于表位的博卡病毒IgM抗体检测方法的建立及与基于病毒样颗粒VLPIgM检测方法的比较[0050]分别将P1、P2、P1+P2或博卡病毒VLP用包被液（PH9.6的碳酸盐缓冲液：碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，加水稀释至IOOOmL进行稀释肽：Iyg孔，VLP:50ng孔后包被酶标板Costar公司产品），置4°C过夜，加入封闭液（I%BSAPBS置37°C孵育2小时，用0.1%I3BST缓冲液洗涤5次。加入1:200稀释的博卡病毒阳性人血清来自北京儿童医院），置37°C孵育1小时，甩掉液体，用〇.I%PBST缓冲液洗涤5次。然后每孔加入ΙΟΟμΙ1:40，000稀释的辣根过氧化物酶山羊抗人IgMSigma公司产品），置37°C孵育1小时，甩掉液体，用0.1%PBST缓冲液洗涤5次。每孔加入ΙΟΟμΙ3，3、5，5^四甲基联苯胺TMB底物避光显色15分钟，加入50μ12ΜH2S〇4终止反应，测定450nm处的吸光值。[0051]根据文献报道的方法（参见KahnJS，KesebirD，CotmoreSF，etal..Seroepidemiologyofhumanbocavirusdefinedusingrecombinantvirus-likeparticles.JInfectDis.2008，198:41_50;HustedtJW，ChristieC，HustedtMM，etal.SeroepidemiologyofhumanbocavirusinfectioninJamaica.PLoSOne.2012?7：e38206.确定cut-off值，首先以0.2作为假定的cut-off值，将所有低于0.2的吸光度值计算其均数和标准误，然后以均数+3倍标准误作为cut-off值。对于基于病毒样颗粒的博卡病毒IgM检测方法，所述吸光值在0.18以上视为阳性，以下则视为阴性，对于基于表位的博卡病毒IgM抗体检测方法，所述吸光值在0.15以上视为阳性，以下则视为阴性。[0052]PlIgMELISA、P2IgMELISA、Pl+P2IgMELISA与VLPIgMELISA的比较见表4a，b，c，结果显示基于表位肽的IgM检测方法具有较好的敏感性和特异性，PlIgMELISA特异性和敏感性分别为:97.4%和72.7%，P2IgMELISA特异性和敏感性分别为:98.7%和72.7%，Pl+P2IgMELISA特异性和敏感性分别为:97.4%和90.9%，统计学分析显示两种方法具有较好的相关性，且利用两条肽的检测效果优于单条肽的检测效果。[0053]表4合成肽IgM抗体检测方法与VLPIgM检测方法的比较a[0055]敏感性=72·7%，特异性=97·4%;[0056]X2=40.8，P0.01，两种方法具有相关性[0057]b[0059]敏感性=72·7%，特异性=98·7%;[0060]Χ2=46·6，Ρ0·01，两种方法具有相关性[0061]c[0063]敏感性=90·9%，特异性=97·4%;[0064]χ2=51·2，Ρ0·01，两种方法具有相关性。

权利要求：1.在HBoVl-4中通用的博卡病毒特异性抗原表位肽，其序列为SEQIDNO:1或SEQIDN0:2〇2.—种检测博卡病毒抗体的非诊断方法，包括：1使样本与权利要求1的博卡病毒特异性抗原表位肽接触；2检测抗原-抗体反应，结果为阳性说明存在博卡病毒抗体。3.权利要求2的方法，其中所述样本是人血清。4.权利要求2或3的方法，其中所述检测抗原-抗体反应的过程为:先加入辣根过氧化物酶山羊抗人IgM孵育，再加入TMB显色，最后检测吸光值。5.权利要求4的方法，其中所述吸光值是0D450。6.—种博卡病毒检测试剂盒，其包含权利要求1所述的博卡病毒特异性抗原表位肽。7.权利要求6所述的试剂盒，还包含辣根过氧化物酶山羊抗人IgM和TMB。8.权利要求1所述的博卡病毒特异性抗原表位肽用于检测博卡病毒抗体的非诊断用途。9.针对权利要求1所述的特异性抗原表位肽的博卡病毒抗体。10.权利要求9的博卡病毒抗体，其是通过将权利要求1所述的特异性抗原表位肽与KLH偶联再免疫小鼠而制备的。

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