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申请/专利权人：博奥生物集团有限公司;深圳市第三人民医院

摘要：本发明属于分子生物学领域，本发明提供了一种杂交缓冲液、寡核苷酸比较基因组杂交芯片的试剂盒以及检测染色体拷贝数量变异的方法。本发明所述杂交缓冲液由缓冲液Mix、甲酰胺、十二烷基硫酸锂和Cot‑1DNA组成，可明显改善杂交漏液、杂交信号弱、杂交不均匀、特异性差的问题，提高已知变异CNV的检出的准确性。

主权项：一种杂交缓冲液，其特征在于，由缓冲液Mix、甲酰胺、十二烷基硫酸锂和Cot‑1DNA组成。

全文数据：一种杂交缓冲液、寡核苷酸aCGH芯片的试剂盒以及检测染色体拷贝数量变异方法技术领域[0001]本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种杂交缓冲液、寡核苷酸比较基因组杂交芯片寡核苷酸aCGH芯片）的试剂盒以及检测染色体拷贝数量变异的方法。背景技术[0002]染色体异常遗传病在自发性流产、死胎、早夭中占50%以上，新生儿中发病率约占1%，是性发育异常及男女不孕症、不育症的重要原因，也是先天性心脏病、智能发育不全等的重要原因之一。随着染色体分带技术、PCR技术、DNA检测技术等的发展，对染色体畸变与疾病关系的认识日益加深，染色体病日趋增多。综合许多国家的资料，大约有15%的妊娠发生流产，而其中一半为染色体异常所致，即约为5%-8%的胚胎有染色体异常。不过在出生前，90%以上已有自然流产或死产。流产愈早，有染色体异常的频率愈高。《中国出生缺陷防治报告2012》指出我国每年约有1600万新生儿出生，出生缺陷或先天缺陷的新生儿数量达90万，约占所有新生儿的5.6%。近年来新生儿的出生缺陷率呈逐年上升的趋势，是导致早期流产、死胎、围产儿死亡、婴幼儿死亡和先天残疾的主要原因，不但严重危害儿童生存和生活质量，影响家庭幸福和谐，也会造成巨大的潜在寿命损失和社会经济负担。[0003]在过去的30余年间，用于诊断染色体异常的金标准方法基于G显带的核型分析技术，但自从2003年之后，细胞遗传学基因芯片技术开始在不同的国家的不同实验室被用于检测染色体的异常情况。染色体基因芯片技术aCGH和SNP芯片技术较之于目前临床上主流的细胞遗传学诊断技术如核型分析、FISH技术等），在染色体异常检出率一般高出4〜5倍）、分辨率（比核型分析的分辨率高1000倍以上）、全基因组的覆盖度（即可一次全面检出染色体异常及较短的检测周期等方面都有明显的优势。[0004]基于芯片的比较基因组杂交技术（简称aCGH是全基因组覆盖度范围内检测染色体拷贝数量变异的方法，通常是采用Cy5和Cy3荧光染料分别标记待检样本和正常样本，标记混合物和正常人的间期染色体微阵列芯片进行杂交，快速检测分辨待检样本相对于正常样本的DNA拷贝数变异。[0005]寡核苷酸aCGH芯片主要包括四个基本要点：芯片方阵的构建、样品的制备、生物分子杂交反应和信号的检测。杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程，是芯片检测的关键一步。通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中（如杂交温度，杂交时间，杂交液的组成成分等），减少生物分子之间的错配比率，提高寡核苷酸aCGH芯片检测灵敏度和特异性。[0006]典型的杂交缓冲液中主要包括以下几种成分：1一定浓度的盐离子，其正离子可中和DNA链磷酸基团的负电荷，消除其间的静电斥力，有利于杂交分子的形成，同时含单价阳离子的盐，如SSPE、SSC能使杂交缓冲液的pH维持在6.8-8.5之间；2表面活性剂如SDS、Triton，可以通过破坏水分子间的氢键作用而降低表面张力调节杂交缓冲液的流动性;3其他添加物如鲑精DNA，通常用来降低杂交背景和非特异性杂交。芯片杂交体系还需要根据探针的类型、长度、GC含量以及研究目的来选择优化杂交条件。[0007]此外，针对同一平台的芯片，对mRNA表达、DNA突变和CNV等不同检测需求，也需开发或优化配套的杂交缓冲液，以达到最优性能。目前，市场上对于商品化的寡核苷酸aCGH芯片产品，大部分厂商都有其配套的芯片杂交缓冲液。Affymetrix公司C’ytoScan®Dx芯片、Illumina公司HumanCytoSNP-12、以及Agilent公司ISCACGH+SNP芯片都有其配套商品化杂交缓冲液。[0008]生物芯片的合成方式主要包括原位合成法和点样法两种。原位合成方法将多个寡核苷酸片段用单核苷酸底物直接合成到载体的特定位置上制备的芯片，其合成方法比较复杂，合成的基因芯片探针密度高，是高密度芯片的主要合成方法。Affymetrix公司将光平版印刷技术photolithographicapproach运用到DNA合成化学中，利用固相化学、光敏保护基及光刻技术得到位置确定、高度多样性的化合物集合，可合成任意序列15-25个碱基长度的片段。美国Agilent公司通过机械手臂直接将碱基合成试剂氨基膦酸酯点样到芯片适当的位置上，不断循环合成预计的寡核苷酸。这种方法灵活性高，能合成任意寡核苷酸片段。[0009]点样法是将合成好的oligo、PCR产物等通过特定型号的芯片点样仪直接点在芯片上。为使探针能够稳定的固定在载体表面上，需要对载体表面进行适当的化学预处理。比如进行氨基修饰载体、环氧基修饰载体、醛基修饰等。也可在其表面包被多聚赖氨酸或氨基硅烷等，使其表面能够带上正电荷以便吸附带有负电荷的探针分子。这些方法使这些生物大分子紧密附着于基片表面上，与生物分子的活性基团如羟基、氨基等通过共价键连接或非共价键连接的方法将生物分子有效的固定在玻璃表面。不同的玻片修饰对固定不同的生物分子具有不同的特点和用途。[0010]原位合成法和点样法合成原理不同，使用基片类型不同，其结合上的探针具有不同的空间结构。比如原位合成的基因芯片面积小，探针密度大，杂交信号较弱。而点样法合成基因芯片，将合成特定的oligo或PCR产物通过特定型号的芯片点样仪点制在基片上，通过基片表面修饰的活性集团与生物分子的活性基团如羟基、氨基等通过共价键连接或非共价键连接固定在基片表面。其探针密度小，杂交信号较强。因此，原位合成法和点样法由于其合成方法，基片类型不同，探针具有不同的空间结构，从而表现出不同的杂交动力学。[0011]申请人在开发点制法高分子氨基化三维聚合物修饰的aCGH芯片过程中，采用原位合成8〇6!1芯片代表性公司48；[16111:商品化的办131^1丨231:;[〇11131^€61'，与申请人开发的3〇6!1芯片配套使用时，对已知的拷贝数变异CNV检出率为0%，采用同为点制法制备的mRNA表达谱芯片配套杂交缓冲液时，可对拷贝数变异进行检测，但存在漏液、杂交信号弱、杂交不均匀的问题，已知变异CNV的检出率为仅为40%。发明内容[0012]有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中存在的问题，提供一种杂交缓冲液，以适合于高分子氨基化三维聚合物修饰的aCGH芯片配套使用，改善杂交漏液、杂交信号弱、杂交不均匀的问题，提高对已知变异CNV的检出率。[0013]为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：[0014]一种杂交缓冲液，由缓冲液Mix、甲酰胺、十二烷基硫酸锂和Cot-IDNA组成。[0015]其中，所述缓冲液Mix由LiCl、Li-MES、MEDTA、Triton-100、TEG0WET260和水组成。[0016]作为优选，所述缓冲液Mix中LiCl的终浓度为612.5mM、Li-MES的终浓度为150mM、MEDTA的终浓度为6mM、Triton-100的终浓度为1.0vv%和TEGOWET260的终浓度为1.5vV%〇[0017]作为优选，所述甲酰胺的终浓度为40vv%，所述十二烷基硫酸锂的终浓度为1·5vv%，所述Cot-IDNA的终浓度为0·15ygyL-0·25ygyL之间。[0018]本发明还提供了一种寡核苷酸比较基因组杂交芯片的试剂盒，包括本发明所述杂交缓冲液。[0019]本领域技术人员可以理解，所述缓冲液Mix可以以母液的形式存在，使用时按比例进行稀释。母液浓度为3X缓冲液Mix至10X缓冲液Mix之间任意浓度。[0020]在一些实施方案中所述杂交缓冲液中的缓冲液Mix以3X缓冲液Mix形式存在，其中包括1.8MLiCl、0.45mMLi-MES、18mMEDTA、3vv%Triton-100、4.5vv%TEG0WET260，余量为水。[0021]作为优选，所述的试剂盒还包括寡核苷酸比较基因组杂交芯片。[0022]在一些实施方案中，所述寡核苷酸比较基因组杂交芯片为高分子氨基化三维聚合物修饰的寡核苷酸aCGH芯片。[0023]本发明还提供了一种检测基因组DNA染色体拷贝数量变异的方法，经荧光标记的待测样品和正常样品的合成产物与本发明所述杂交缓冲液混合后在杂交盖片的作用下平铺于寡核苷酸比较基因组杂交芯片表面，置于杂交炉内杂交12-14小时，取出芯片清洗后，在扫描仪上进行芯片扫描，根据杂交信号值进行CNV分析。[0024]作为优选，所述荧光标记为待检样品和正常样本gDNA在高盐、高温条件下片段化，然后与荧光修饰引物、dNTP及聚合酶混合进行合成反应。所述高盐、高温条件下具体为12.5mMMg+离子，以及98°C高温条件下。所述荧光修饰引物终浓度为0.4ygyL、dNTP终浓度为ImM、聚合酶的终浓度为lUyL。[0025]进一步的，所述经荧光标记的待测样品和正常样品的合成产物与所述杂交缓冲液混合的过程中杂交缓冲液中各组分的加样顺序依次为缓冲液Mix、甲酰胺、十二烷基硫酸锂、Cot-IDNA、荧光标记的待测样品和正常样品的合成产物的混合物。[0026]作为优选，所述经荧光标记的待测样品和正常样品合成产物的混合物终浓度为95.0%。本发明实施例3所述杂交缓冲液可检出100%已知变异，而商品化杂交缓冲液未能检出已知变异。表明本发明所述杂交缓冲液的杂交特异性高。

权利要求：1.一种杂交缓冲液，其特征在于，由缓冲液Mix、甲酰胺、十二烷基硫酸锂和Cot-IDNA组成。2.根据权利要求1所述的杂交缓冲液，其特征在于，所述缓冲液Mix由LiCl、Li-MES、MEDTA、Triton-100、TEG0WET260和水组成。3.根据权利要求2所述的杂交缓冲液，其特征在于，所述缓冲液Mix中LiCl的终浓度为612.5111]\1、1^-]\^5的终浓度为150111]\^0了4的终浓度为6111]\1、1^切11-100的终浓度为1.^八％和TEGOWET260的终浓度为1·5νν%。4.根据权利要求1所述的杂交缓冲液，其特征在于，所述甲酰胺的终浓度为40νν%，所述十二烷基硫酸锂的终浓度为1.5νν%，所述Cot-IDNA的终浓度为0.15ygyL-0.25ygyL。5.—种寡核苷酸比较基因组杂交芯片的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述杂交缓冲液。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括寡核苷酸比较基因组杂交芯片；所述寡核苷酸比较基因组杂交芯片为高分子氨基化三维聚合物修饰的寡核苷酸aCGH芯片。7.—种检测染色体拷贝数量变异的方法，其特征在于，经荧光标记的待测样品和正常样品的合成产物与权利要求1所述杂交缓冲液混合后在杂交盖片的作用下平铺于寡核苷酸比较基因组杂交芯片表面，置于杂交炉内杂交12-14小时，取出芯片清洗后，在扫描仪上进行芯片扫描，根据杂交信号值进行CNV分析。8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述荧光标记为待测样品和正常样品gDNA在高盐、高温条件下片段化，然后与荧光修饰引物、dNTP及聚合酶混合进行合成反应。9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述经荧光标记的待测样品和正常样品与所述杂交缓冲液混合的过程中杂交缓冲液中各组分的加样顺序依次为缓冲液Mix、甲酰胺、十二烷基硫酸锂、Cot-IDNA、荧光标记的待测样品和正常样品的合成产物。10.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述经荧光标记的待测和正常样品的合成产物终浓度为d〇ygyL。

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