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申请/专利权人：江西省林业科学院

摘要：本发明公开了丝栗栲和米槠微卫星标记的特异性引物及检测方法。本发明通过利用公共数据库中现有的丝栗栲核苷酸序列，应用生物信息学方法并进行实验验证，开发出8对适用于米槠的丝栗栲微卫星分子标记的特异性引物，其碱基序列如SEQ ID NO.1‑16所示。本发明还提供了丝栗栲和米槠的EST‑SSR分子标记的检测方法，具有快速、简单、稳定和低成本的优点，为其它栲属植物EST‑SSR分子标记的开发提供了参考，本发明的特异性引物及微卫星标记检测方法为丝栗栲和米槠等栲属植物的群体遗传分化与结构、群体的遗传多样性水平、群体间的基因流及交配系统等研究以及栲属植物的分子辅助育种研究提供了新的工具。

主权项：一种丝栗栲微卫星标记和米槠微卫星标记的特异性引物，其特征在于，所述的微卫星标记的特异性引物如下所示：特异性引物Slk4‑2：F：TCCTGTTCAAGGCCATCT，R：ATCCACATTTCGGACACC；特异性引物Slk5‑1：F：GGTAATCGGTTTAGGACA，R：5'‑TATTCCGCTATCGCAGTC；特异性引物Slk8‑1：F：AGTTTGCTGCCTGCCACAT，R：5'‑TTTGCCCACTTGCTCCCT；特异性引物Slk9‑1：F：AAATGCTTGGTGGGAGCG，R：GAGATTGGCACGATGGAC；特异性引物Slk10‑2：F：AGTCTCAGATAAAATCCCAATA，R：CTTTCCATCACCTTAGTCCA；特异性引物Slk11‑1：F：AGCAAACCAGCCAACAAG，R：GGGCCACAAATGATAACACTAA；特异性引物Slk12‑2：F：ACACTGACAGCCACCACT，R：CTCACGCAACCTTCTTCT；特异性引物Slk13‑1：F：GCCCGTCCCTTTCTTCTC，R：TGGGTGGATCACAGTTTT。

全文数据：丝栗栲和米槠微卫星标记的特异性引物及检测方法技术领域[0001]本发明属于植物基因组DNA分子标记技术领域，具体涉及丝栗栲和米槠微卫星标记的特异性引物及检测方法。背景技术[0002]微卫星microsatellite，又称简单重复序列（simplesequencerepeat，SSR，是指以1〜6个核苷酸为单位，多次串联重复的DNA序列，其普遍存在于真核生物和原核生物的基因组中，甚至在病毒基因组中亦有存在。SSR分子标记具有以下特点：重复单元和重复次数高度可变，多态性信息容量高;呈共显性，遵循孟德尔法则遗传;侧翼序列相对保守;选择中性等。[0003]基于以上特点，微卫星分子标记被广泛应用于物种的指纹鉴定、遗传图谱构建、群体遗传结构分析、比较基因组及进化研究等诸多研究领域。根据建立SSR标记的序列性质不同，SSR标记可分为基因组SSRgSSR和表达序列标签SSREST-SSR。随着新一代测序技术的发展，物种的EST序列增长迅速，基于EST序列来开发植物的SSR分子标记已成为一种经济有效的途径。[0004]丝栗栲（CastanopsisfargesiiFranch与米槠（CastanopsiscarIesiiHemsl·Hayata同属壳斗科Fagaceae拷属（苦木拷属）CastanopsisD.DonSpach，该属植物种类繁多，且分布较广。丝栗栲又名大丝栗栲、丝栗树，为常绿乔木，具适应广、萌芽更新容易、生长快、用途广等特点，主要分布在亚洲热带、亚热带地区，是中亚热带常绿阔叶林中十分重要的群系。中亚热带丝栗栲次生林群落物种组成丰富，生态服务价值较高，对改善中亚热带用材林的景观结构、提高人工林生境多样性和生态系统稳定性具有重要意义。而米槠是南方常绿阔叶林重要组成树种之一，也是优良的观赏树种，是当今生态建设和绿化、美化城乡的主要树种，其涵养水源、保持水土、防灾减灾等生态功能很强，是重要的工业原料和食用菌生产原料。[0005]目前，多采用植物生理学和生态学的方法来研究丝栗栲和米槠等栲属植物，而以分子标记的手段研究丝栗栲和米槠的群体遗传多样性、遗传分化和结构等研究相对滞后，严重影响了栲属群体的开发和利用。相对于栲属植物的重要地位来说，栲属中所能使用的SSR引物至今为止仍然很少，Huang等通过构建富集文库筛选到中华栲（Castanopsischinensis的12对SSR引物;Shi等获得苦槠栲C.sclerophyIla的10对SSR引物;Ueno等开发了尖叶栲C.cuspidata的13对SSR引物和日本栲C.sieboldii的16对SSR引物。除此之夕卜，对于丝栗栲和米槠的SSR标记开发鲜有报道，徐立安等曾采用通用性检测的方法开发了适用于栲树群体遗传结构研究的6对SSR引物，而未见丝栗栲和米槠EST-SSR和基因组SSR的开发报道。因此，需要进行丝栗栲和米槠SSR分子标记的开发，以增加位点数，更好的为丝栗栲和米槠等栲属植物的群体遗传分化与结构、群体的遗传多样性水平、群体间的基因流及交配系统等方面的研究服务。此外，米槠及其它部分栲属植物由于EST序列数量的限制，现阶段难以开发EST-SSR分子标记，因此，需要从同属植物中开发EST-SSR应用于米槠的遗传多样性检测。发明内容[0006]本发明针对目前丝栗栲和米槠SSR标记开发难度大、SSR标记数量少的不足提供丝栗栲和米槠微卫星标记的特异性引物及检测方法。[0007]本发明的第一个目的是提供一种丝栗栲微卫星标记的特异性引物，其特征在于，所述的微卫星标记的特异性引物如下所示：[0008]特异性引物Slk4-2:F:TCCTGTTCAAGGCCATCT如SEQIDNO.1所示），R:ATCCACATTTCGGACACC如SEQID从.2所示）；[0009]特异性引物Slk5-1:F:GGTAATCGGTTTAGGACA如SEQIDN0.3所示），R:5’_TATTCCGCTATCGCAGTC如SEQID从.4所示）；[0010]特异性引物Slk8-1:F:AGTTTGCTGCCTGCCACAT如SEQIDN0.5所示），R:5’-TTTGCCCACTTGCTCCCT如SEQID从.6所示）；[0011]特异性引物Slk9-1:F:AAATGCTTGGTGGGAGCG如SEQIDN0.7所示），R:GAGATTGGCACGATGGAC如SEQID从.8所示）；[0012]特异性引物Slkl〇-2:F:AGTCTCAGATAAAATCCCAATA如SEQIDN0.9所示），R:CTTTCCATCACCTTAGTCCA如SEQID从.10所示）；[0013]特异性引物Slkll-I:F:AGCAAACCAGCCAACAAG如SEQIDNO.11所示），R:GGGCCACAAATGATAACACTAA如SEQID从.12所示）；[0014]特异性引物Slkl2-2:F:ACACTGACAGCCACCACT如SEQIDNO.13所示），R:CTCACGCAACCTTCTTCT如SEQID从.14所示）；[0015]特异性引物Slkl3-1:F:GCCCGTCCCTTTCTTCTC如SEQIDNO.15所示），R:TGGGTGGATCACAGTTTT如SEQID从.16所示）。[0016]本发明丝栗栲微卫星标记的特异性引物，是通过以下方法获得的：[0017]1丝栗栲DNA序列的获得:用丝栗栲的拉丁文学名Castanopsisfargesii作为关键词，在美国国立卫生研究院维护的基因序列数据库GenBank中检索并下载获得丝栗栲DNA序列；[0018]⑵序列处理和含有微卫星DNA序列的筛选:用在线拼接和去冗余程序对下载的序列进行拼接处理，然后用Perl语言编制的微卫星分析程序和在线微卫星位点分析软件，对拼接处理后的序列进行微卫星位点的筛选，获得含有微卫星位点的丝栗栲DNA序列；[0019]3引物设计：用批量引物设计软件设计扩增含有微卫星位点的DNA聚合酶链式反应引物，引物碱基数为18-22个，同一位点的两个引物退火温度差小于4°C，扩增得到的DNA片段大小在400个碱基以内；[0020]⑷引物筛选：以丝栗栲基因组DNA为模板，利用上述设计的引物分别进行DNA聚合酶链式反应扩增，得到的PCR扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、显色后拍照，根据谱带信息进行分析，筛选得到丝栗栲卫星标记的特异性引物。[0021]本发明的第二个目的是提供一种丝栗栲微卫星标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：[0022]1提取丝栗栲基因组DNA;[0023]2以步骤（1提取的基因组DNA为模板，利用所述的丝栗栲微卫星标记的特异性引物中的每个引物对分别进行PCR扩增；[0024]3利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物进行分型。[0025]所述步骤⑵中的PCR扩增，其扩增体系优选为：10Xbufferlμl，25mmolLMgCl2O·6μ1，10mmolLdNTP0·6μ1，DNA聚合酶（5UyL0·Ιμΐ，DNA模板50-100ng，引物25mmolLF和R各0.5μ1，双蒸水定容至10μ1。[0026]所述步骤⑵中的PCR扩增，其扩增反应程序优选为：94°C预变性5min;94°C变性40sec，各微卫星引物对退火温度下复性60sec，72°C延伸60sec，34个循环；最后70°C延伸5min，4°C保存;丝栗栲微卫星标记的特异性引物的退火温度分别为:Slk4-2:55°C;Slk5-l:54°C;Slk8-1:54°C;Slk9-1:57°C;Slkl〇-2:54°C;Slkl1-1:55°C;Slkl2-2:57°C;Slkl3-1:56Γ。[0027]所述步骤⑶中的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳优选使用8%的凝胶浓度。[0028]本发明的第三个目的是提供一种米槠微卫星标记的特异性引物，其特征在于，其序列与上述的丝栗栲微卫星标记的特异性引物序列相同。[0029]本发明的第四个目的是提供一种米槠微卫星标记的检测方法，其特征在于，是将上述的检测方法中的丝栗栲基因组DNA替换为米槠基因组DNA，其余步骤均相同。[0030]本发明利用公共数据库中现有的丝栗栲核苷酸序列，应用生物信息学方法，开发出适用于米槠的丝栗栲微卫星分子标记，并应用于丝栗栲和米槠的遗传多样性检测。[0031]本发明的有益效果是：[0032]1.本发明建立了丝栗栲和米槠的EST-SSR分子标记开发方法，相对于其它丝栗栲和米槠微卫星的开发方法，本方法具有快速、简单、稳定和低成本的优点，对栲属植物的分子标记开发具有重要的实用价值。[0033]2.米槠及其它部分栲属植物由于EST序列数量的限制，现阶段难以开发EST-SSR分子标记，本发明开发的丝栗栲SSR分子标记适用于米槠的遗传多样性检测，解决了米槠的这一问题，为米槠开发了新一批的EST-SSR分子标记的同时，也为其它栲属植物EST-SSR分子标记的开发提供参考。[0034]3.本发明开发的丝栗栲微卫星分子标记，可应用于丝栗栲和米槠的群体遗传多样性检测，为栲属植物提供了新一批的微卫星分子标记，增加了位点数，也为丝栗栲和米槠等栲属植物的群体遗传分化与结构、群体的遗传多样性水平、群体间的基因流及交配系统等研究提供了新的工具。附图说明[0035]图1是引物Slk4-2在丝栗栲中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。[0036]图2是引物Slk5-1在丝栗栲中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。[0037]图3是引物Slk8-1在丝栗栲中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。[0038]图4是引物Slk9-1在丝栗栲中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。[0039]图5是引物Slkl〇-2在丝栗栲中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。[0040]图6是引物Slkl1-1在丝栗栲中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。[0041]图7是引物Slkl2-2在丝栗栲中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。[0042]图8是引物Slkl3-1在丝栗栲中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。[0043]图9是引物Slk4-2在米槠中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。[0044]图10是引物Slk5-1在米槠中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。[0045]图11是引物Slk8-1在米槠中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。[0046]图12是引物Slk9-1在米槠中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。[0047]图13是引物Slkl〇-2在米槠中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。[0048]图14是引物Slkll-I在米槠中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。[0049]图15是引物Slkl2-2在米槠中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。[0050]图16是引物Slkl3-1在米槠中的DNA聚合酶链式反应扩增结果。具体实施方式[0051]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。[0052]实施例1[0053]本发明丝栗栲微卫星分子标记的开发及其应用经过下列步骤：[0054]1.丝栗栲DNA序列的获得[0055]用丝栗栲的拉丁文学名Castanopsisfargesii作为关键词，在美国国立卫生研究院维护的基因序列数据库GenBank:http:www.ncbi·nlm.nih.gov进行检索，下载已登录的丝栗栲核苷酸序列，并以fasta文件形式进行保存。[0056]2.丝栗栲DNA序列处理和含有微卫星DNA序列的筛选[0057]用在线拼接CAP3和去冗余程序（CD-HIT对下载的序列进行拼接处理，然后用Perl语言编制的微卫星分析程序MISA和在线微卫星位点分析软件MicrosatelliteRepeatsFinder，对处理后的序列进行微卫星位点的筛选，获得含有微卫星位点的丝栗栲DNA序列。[0058]3.引物设计[0059]用批量引物设计软件Primer3.0设计DNA聚合酶链式反应扩增引物，引物大小在18-22个碱基，扩增片段长度在400个碱基以内，两条引物退火温度相差不超过4°C。当一条DNA序列中含有两个微卫星位点，且两个微卫星位点相距100个碱基以上时，对两个微卫星位点分别设计引物；当两个微卫星位点在同一序列中相距100个碱基以内时，引物设计时放弃将两个位点放在一对引物的扩增范围内。[0060]4.丝栗栲微卫星标记特异性引物的获得[0061]IDNA聚合酶链式反应扩增[0062]通过PCR方法用设计好的微卫星标记引物扩增丝栗栲基因组DNA，扩增体系和条件如下：反应体系为1〇μ1，其中包括：10XbufferΙμΐ，MgCh25mmolL0·6μ1，dNTPIOmmolL0·6μ1，DNA聚合酶5υμ10·Ιμΐ，DNA模板50-100ng，两引物（25mmolLF和R各0·5μ1，用双蒸水定容至1〇μ1。聚合酶链式反应程序为:94°C预变性5min，34个循环94°C变性40sec，各微卫星引物对退火温度下复性60sec，72°C延伸60sec，最后70°C延伸5min后4°C保存，从而获得扩增产物。[0063]2电泳分离和银染检测[0064]扩增产物中加变性缓冲液包含98%甲酰胺，IOmmo1LpH8.0的EDTA，0.25%溴酚蓝和0.2%二甲苯氰），用8%质量含量变性聚丙烯酰胺凝胶厚度I.O毫米左右和IXTBE电泳缓冲液，上样20ng，恒压120V电泳90min后银染检测。银染方法主要过程如下：电泳完毕后，将粘有凝胶的玻璃板置入用于银染的塑料盆中；加入固定液含10%无水乙醇和0.5%的乙酸），在摇床上轻微震荡15min进行固定，然后去离子水漂洗2次，每次2min;放入0.1%硝酸银染色液中摇床上轻微震荡IOmin染色，然后用去离子水漂洗2次，每次5sec;将凝胶置入显色液中（含有1.5%氢氧化钠，0.014%的四硼酸钠），在摇床上轻微震荡直至条带清晰且条带数不再增加为止;加入固定液，终止显色反应，用蒸馏水漂洗几分钟；去除凝胶和玻璃板上的水珠。放在白光灯下观察并用数码相机拍照。[0065]5.微卫星分子标记在丝栗栲群体遗传多样性检测中的应用[0066]将引物对Slk4-2F和R、Slk5-lF和R、Slk8-lF和R、Slk9-lF和R、Slkl〇-2F和R、Slkll-lF和R、Slkl2-2F和R和Slkl3-1F和R分别按照上述步骤4的DNA聚合酶链式反应扩增、电泳分离和银染检测的方法，对20个丝栗栲个体基因组DNA进行遗传多样性检测。各引物的序列如SEQIDNO.1-16所示，退火温度详见表1。[0067]表1丝栗栲微卫星分子标记DNA聚合酶链式反应扩增引物及其退火温度[0068][0069]米用NTSYS_pcversion2·11软件处理数据，米用PopgeneI·32YehandBoyle，1997分析基因型数据及基因频率，计算丝栗栲观测杂合度和期望杂合度，并进行哈迪-温伯格Hardy-Weinbergequilibrium，HWE及连锁不平衡检验，以此来描述8个丝栗栲DNA多态位点的特征。本发明用上述方法获得8个微卫星标记，特异性引物Slk4-2来源于微卫星标记序列如SEQIDNO.17所示，特异性引物Slk5-1来源于微卫星标记序列如SEQIDNO.18所示，特异性引物SlkS-I来源于微卫星标记序列如SEQIDNO.19所示，特异性引物Slk9-1来源于微卫星标记序列如SEQIDNO.20所示，特异性引物Slkl〇-2来源于微卫星标记序列如SEQIDNO.21所示，特异性引物Slkll-I来源于微卫星标记序列如SEQIDNO.22所示，特异性引物Slkl2-2来源于微卫星标记序列如SEQID勵.23所示，特异性引物511^13-1来源于微卫星标记序列如SEQIDNO.24所示。各微卫星位点的遗传学参数如表2所示，扩增检测结果分别如图1-8所示，上述的8个微卫星标记在供试的20个丝栗栲个体中都表现出多态性，并且都符合哈迪-温伯格平衡P〇.05。结合后续分析结果表明，上述的8个引物对能用于分析丝栗栲的遗传多样性和遗传结构，是一种有效可靠的丝栗栲微卫星标记特异性引物。[0070]表2微卫星位点在丝栗栲群体中的遗传学参数[0071][0072]6.微卫星分子标记在米槠中的通用性检测[0073]将上述获得的8个丝栗栲微卫星标记的特异性引物对参照上述丝栗栲群体遗传多样性检测方法，对20个米槠个体基因组DNA进行遗传多样性检测，检测其在米槠中的通用性。丝栗栲微卫星标记的特异性引物对Slk4-2F和R、Slk5-lF和R、Slk8-lF和R、Slk9-1F和R、Slkl〇-2F和R、Slkll-lF和R、Slkl2-2F和R和Slkl3-1F和R扩增米槠基因组DNA的检测结果分别如图9-16所示，各微卫星位点在米槠群体中的遗传学参数如表3所示，由图9-16和表3可以看出，在供试的20个米槠个体中8个微卫星序列的长度均表现出多样性，并且都符合哈迪-温伯格平衡PX.05，由此可见，上述的8个微卫星标记在米槠中通用，也能用于分析米槠的遗传多样性和遗传结构，具有很高的重复性。[0074]表3微卫星位点在米槠群体中的遗传学参数[0075]

权利要求：1.一种丝栗栲微卫星标记和米槠微卫星标记的特异性引物，其特征在于，所述的微卫星标记的特异性引物如下所示：特异性引物Slk4-2:F:TCCTGTTCAAGGCCATCT，R:ATCCACATTTCGGACACC;特异性引物Slk5-1:F:GGTAATCGGTTTAGGACA，R:5’-TATTCCGCTATCGCAGTC;特异性引物Slk8-1:F:AGTTTGCTGCCTGCCACAT，R:5’-TTTGCCCACTTGCTCCCT;特异性引物Slk9-1:F:AAATGCTTGGTGGGAGCG，R:GAGATTGGCACGATGGAC;特异性引物Slkl1-1:F:AGCAAACCAGCCAACAAG，R:GGGCCACAAATGATAACACTAA;特异性引物31让13-1:卩:6〇0^1^0：1'1'1'：1'1'：1'：，1?:丁666丁66八1^八〇八61'1'1'1'。2.—种丝栗栲微卫星标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1提取丝栗栲基因组DNA;⑵以步骤（1提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物中的每个引物对分别进行PCR扩增；⑶利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物进行分型。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤（2中的PCR扩增的体系为：10Xbufferlyl，25mmolLMgCl20.6yl，10mmolLdNTP0·6μ1，5υμ1DNA聚合酶0.141，0嫩模板50-100]^，251111]1〇1凡引物?和1?各0.5以1，双蒸水定容至1^1。4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤⑵中的PCR扩增，其扩增反应程序为:94°C预变性5min;94°C变性40sec，各微卫星引物对退火温度下复性60sec，72°C延伸60sec，34个循环；最后70°C延伸5min，4°C保存;丝栗栲微卫星标记的特异性引物的退火温度分别为：Slk4-2:55°C;Slk5-1:54°C;Slk8-1:54°C;Slk9-1:57°C;Slkl〇-2:54°C;Slkll-1:55°C;Slkl2-2:57°C;Slkl3-1:56°C。5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤3中的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳使用8%的凝胶浓度。6.—种米槠微卫星标记的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1提取米槠基因组DNA;⑵以步骤（1提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物中的每个引物对分别进行PCR扩增；⑶利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物进行分型。7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤（2中的PCR扩增的体系为：10Xbufferlyl，25mmolLMgCl20.6yl，10mmolLdNTP0·6μ1，5υμ1DNA聚合酶0.141，0嫩模板50-100]^，251111]1〇1凡引物?和1?各0.5以1，双蒸水定容至1^1。8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤2中的PCR扩增，其扩增反应程序为:94°C预变性5min;94°C变性40sec，各微卫星引物对退火温度下复性60sec，72°C延伸60sec，34个循环；最后70°C延伸5min，4°C保存;米槠微卫星标记的特异性引物的退火温度分别为：Slk4-2:55Γ;Slk5-1:54Γ;Slk8-1:54Γ;Slk9-1:57Γ;Slkl〇-2:54Γ;Slkll-1:55°C;Slkl2-2:57°C;Slkl3-1:56°C。9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤3中的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳使用8%的凝胶浓度。

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