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申请/专利权人：浙江省人民医院

摘要：本发明公开了一种TaqMan探针法检测问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的试剂盒，包括用于问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因检测的特异性引物对LA2582‑F和LA2582‑R、荧光探针LA2582‑P和阳性质控品。探针的两端分别进行修饰，5’端标记报告荧光素或荧光染料，3’端标记淬灭基团。阳性质控品为含有问号钩端螺旋体金属蛋白酶靶基因LA2582序列重组pET42a质粒溶液。本发明试剂盒具有快速准确、高特异性、高效率的特点，可以实现对问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的定性定量检测，具有广泛的临床检测应用价值和流行病学调查应用价值。

主权项：1.一种TaqMan探针法检测问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的试剂盒，其特征在于包括用于问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因检测的特异性引物对正向引物LA2582‑F和反向引物LA2582‑R、荧光探针LA2582‑P和阳性质控品pET42a‑LA2582重组质粒，所述正向引物LA2582‑F和反向引物LA2582‑R、荧光探针LA2582‑P和阳性质控品pET42a‑LA2582重组质粒的序列如下：正向引物LA2582‑F：5’‑CAAATCAAAACGTGGAACTGCAT‑3’；反向引物LA2582‑R：5’‑GGAAATGAGTCCGTCAGGAACT‑3’；荧光探针LA2582‑P：5’‑CATAAACTCGGAAATATAG‑3’；阳性质控品重组质粒pET42a‑LA2582：

全文数据：一种TaqMan探针法检测问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的试剂盒技术领域本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种TaqMan探针法检测问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的TaqMan探针、引物、试剂盒及检测方法，适用于问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的定性定量检测。背景技术由致病性钩端螺旋体感染引起的钩体病是全球流行的自然疫源性人兽共患传染病，我国也是钩体病流行的主要疫区。致病性钩体基因种中，以问号钩端螺旋体流行最广且致病性最强。问号钩端螺旋体可在数分钟内穿越黏膜或破损皮肤侵入人体，然后迅速侵入血流引起中毒性败血症，5～7天后血流中钩体穿越小血管播散至肺、肝、肾及脑脊液，引起肺出血型、黄疸出血型、肾型、脑膜脑炎型钩体病，病死率高达20～50％。因此，早期快速准确检测和诊断分析问号钩体感染对指导临床治疗和控制疫情爆发具有积极意义。问号钩体的毒力因子有溶血素、金属蛋白酶、脂多糖、鞭毛蛋白及外膜蛋白等与其致病性密切相关。各毒力因子在创伤弧菌感染过程的致病机制已有广泛的研究和报道。金属蛋白酶Metalloprotease是一组主要为锌依赖、少数为钙依赖的蛋白水解酶，问号钩体可将其分泌到胞外发挥侵袭作用，是一种较强的毒力因子。对宿主体内的胶原蛋白和弹性蛋白等胞外基质分子具有广泛的蛋白酶活性，导致组织坏死、血管壁破损和皮肤损害等。因此，快速准确地分析问号钩体金属蛋白酶基因的水平对问号钩端螺旋体的快速鉴定及基因分型、流行病学调查和制定防控策略具有积极意义。实时荧光PCR检测技术Real-timeFluorescentQuantitativePCR,qPCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好、快速准确，并可对核酸进行定量分析等优点。具有以下优点：1闭管操作，避免PCR产物污染；2快速，没有扩增后处理，直接读取检测结果；3实时监控，数据更真实，有效避免了传统终点法的弊端；4自动化程度高，荧光检测过程和结果分析全自动。实时荧光PCR检测技术目前主要包括TaqMan探针法和SYBRGreen法。TaqMan探针法，在靶序列的特异性探针5’端和3’端分别标记一个荧光报告基团和一个淬灭基团。通过靶序列特异性PCR引物、DNA聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性水解探针释放荧光报告基团，实时检测从游离荧光基团上释放的荧光信号，从而对靶序列进行定性定量分析。SYBRGreen法，是在反应体系中加入一种荧光染料，该染料可在497nm光源照射下发出荧光，只与DNA双链结合光源照射发出荧光，DNA变成单链后游离出去光源照射不发出荧光。从而荧光的强弱与双链DNA数量相关，从而对靶序列进行定性定量分析。TaqMan探针法较SYBRGreen法具有更高的特异性，因靶序列特异性探针避免了SYBRGreen等荧光染料的非特异性荧光信号。目前对问号钩端螺旋体的检测主要基于免疫球蛋白样蛋白B、外膜蛋白基因LigB，LipL32，OmpL1等属特异性蛋白基因的qPCR检测方法，且大部分采用SYBRGreen法检测，目前尚无基于钩端螺旋体毒力因子金属蛋白酶基因的TaqMan探针法检测报道。发明内容本发明旨在提出一种TaqMan探针法检测问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的TaqMan探针、引物、试剂盒及qPCR检测方法，以提供一种特异、敏感和准确的问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的定性定量检测方法。本发明通过以下技术方案加以实现：用于问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的特异性荧光探针LA2582-P，其荧光探针序列为：5’-CATAAACTCGGAAATATAG-3’；所述问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因荧光探针的两端分别进行修饰，5’端标记报告荧光素或荧光染料，3’端标记淬灭基团；标记的报告荧光素或荧光染料为FAM或其它任何可以作为探针标记的荧光素或荧光染料，例如HEX、TET、JOE、YakimaYellow、Cy3、Cy3.5、Cy5、NED、VIC、PET、ROX、LIZ、RED、TexasRed；淬灭基团为TAMRA或ECLIPSE或BHQ或其它任何可以作为淬灭基团的化学物质，例如Dabcyl、BHQ1、MGB。用于问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因检测的特异性引物对LA2582-F和LA2582-R，所述引物对的序列为：LA2582-F：5’-CAAATCAAAACGTGGAACTGCAT-3’；LA2582-R：5’-GGAAATGAGTCCGTCAGGAACT-3’。进一步地，本发明一种用于问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因检测的试剂盒，还包括PCR反应液和阴性质控品。进一步地，所述的阴性质控品为灭菌超纯水ddH20，所述的阳性质控品为含有问号钩端螺旋体金属蛋白酶靶基因LA2582序列质粒溶液，所述靶基因LA2582序列为：5’-GCGCCAATCGCCTACGGAAATTTAGGTTCGGAGGTGGATTTTATCGATTTTGGTAGATGGACCACAACACCTTTTAGTTATTCCGTATCATCCTCCTTTTCCGCTGAATACGGAGGATTTAATCTTTTTGATTCGGATCCAAATACACATTGGTATTCTGTCAATCGTTCCGACTCTGAATGGGTCATTGTAGACTTCGGTTCTAAAAGACTGATCAACGGTTTAGAAATTACAGTCCCTATTTTTAAAAAAGAAAGAGCCGTAAAAAAATACGAAATCCAAGTTTTAATCCGGGACGACTGGAGAACCATTCTTACAAATCAAAACGTGGAACTGCATAATTTTATGCGTCCGTTTTGAGAATTTATTTTCCCGATTCCACAAATCGTGAAGTTGTAATTAGTGACCTTAAACTTTTTCTGAATCAAAAACTTTTAAACGGAATTGAACCTAGACTTAGAGGTTATTCGTTTCCAGTTCCTGACGGACTCATTTCCAGTTTTGATTCCCAACTTCCAAATGCTCCTAGAACCTATCGAAACGGAGTCCATAAGGGAATTGATATATACAAAAAAAAAGAACTAGATGGCCAGATTCGGAACTTAAATTTCCAAGACGAAATAATCTCACCCGCAGACGGAATTGTGATTCGAGCAGATCATTCCTATTCTCCCATGACTCTGTCAGATTATGAATATCACACTACCCAATCCCAAAAAGGAACCGTGACTTATGTTGAAAAAGATTTTGGAGGAAGACAAGTTTGGATCGATCACGGTCACGGTGTAATGACTAGCTTCAACCATCTTTCTTCGATTCATAAAAACATAAAAGTAGGCGAAAAAGTTAAACAAGGAGAATCAATCGGAACCGTTGGAAACTCAGGTTTATTAGAAGAAGCGAAAAATATCTCAGACAATATTCATCTTCATTTTGAAATCTGGGTAGACGGTGAATTTTTAGGAAACGGTCTCCCTCCCGCTCAAGTTCGCAAATTACTTCAATTCTTTTTCAAAAGAAACGGAGTGGAT-3’。进一步地，所述的问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因阳性质控品是通过在pET42a质粒载体中插入所述靶基因LA2582序列即包含问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因特异性引物对扩增产物片段的序列重组制得。所述的问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因阳性质控品所含的重组质粒pET42a-LA2582浓度为1ngμL。进一步地，所述PCR反应液包括Taq酶、dNTP、缓冲液等成分。根据本发明，所述检测问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的TaqMan探针法的反应体系为20μL，包括qPCRMixProbe反应液2x10μL，正向引物LA2582-F0.8μL10μM，反向引物LA2582-R0.8μL10μM，荧光探针LA2582-P0.8μL10μM，参比荧光ROXReferenceDyeII50x0.4μL，被检测样本DNA提取物2-5μL，ddH2O补至20μL。根据本发明，所述试剂盒的实时荧光PCR扩增的反应时间和温度为：95℃，5min，1个循环；95℃，10s，60℃，50s，40个循环并收集荧光信号。本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：目前尚无基于钩端螺旋体毒力因子金属蛋白酶基因的检测报道。本发明根据问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因LA2582序列设计特异性引物和探针，建立了TaqMan探针法检测问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的荧光定量PCR检测方法。附图说明图1为问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因实时荧光PCR检测的TaqMan荧光探针LA2582-P的质检HPLC图；图2为问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因实时荧光PCR检测的特异性上游引物LA2582-F的质检HPLC图；图3为问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因实时荧光PCR检测的特异性下游引物LA2582-R的质检HPLC图；图4为问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因靶基因LA2582的重组质粒pET42a-LA2582构成示意图；图5为问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的阳性质控品的实时荧光PCR检测图；图中从左至右的曲线分别对应问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因阳性质控品的浓度从高到低1ngμL、10-1ngμL、10-2ngμL、10-3ngμL、10-4ngμL、10-5ngμL、10-6ngμL；图6为图5对应的标准曲线图；图7为问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的阳性质控品实时荧光PCR扩增后的产物凝胶电泳图；M：DL500DNAMarker；B：阴性对照扩增结果；7-1：阳性质控品的浓度从高到低1ngμL、10-1ngμL、10-2ngμL、10-3ngμL、10-4ngμL、10-5ngμL、10-6ngμL的扩增结果。具体实施方式以下结合说明书附图对本发明做进一步详细说明，并给出具体实施方式。实施例1：目标片段、引物和探针的设计通过NCBI数据库查找问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因LA2582序列，使用PrimerExpress3.0软件，对问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因LA2582靶序列分别设计了特异性引物对和其特异性的探针。所述探针5’端标记报告荧光素或荧光染料本例标记FAM，3’端标记淬灭基团本例标记MGB。靶基因序列、引物和探针均由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成，引物和探针均为HPLC纯化，冻干粉-80℃保存。对特异性引物对和探针进行质检分析，结果如图1、2和3所示。采用ddH20稀释至10μM用于常规使用。设计出的靶基因序列、探针和引物对分别为：LA2582靶基因序列：5’-GCGCCAATCGCCTACGGAAATTTAGGTTCGGAGGTGGATTTTATCGATTTTGGTAGATGGACCACAACACCTTTTAGTTATTCCGTATCATCCTCCTTTTCCGCTGAATACGGAGGATTTAATCTTTTTGATTCGGATCCAAATACACATTGGTATTCTGTCAATCGTTCCGACTCTGAATGGGTCATTGTAGACTTCGGTTCTAAAAGACTGATCAACGGTTTAGAAATTACAGTCCCTATTTTTAAAAAAGAAAGAGCCGTAAAAAAATACGAAATCCAAGTTTTAATCCGGGACGACTGGAGAACCATTCTTACAAATCAAAACGTGGAACTGCATAATTTATGCGTCCGTTTTGAGAATTTATTTTCCCGATTCCACAAATCGTGAAGTTGTAATTAGTGACCTTAAACTTTTTCTGAATCAAAAACTTTTAAACGGAATTGAACCTAGACTTAGAGGTTATTCGTTTCCAGTTCCTGACGGACTCATTTCCAGTTTTGATTCCCAACTTCCAAATGCTCCTAGAACCTATCGAAACGGAGTCCATAAGGGAATTGATATATACAAAAAAAAAGAACTAGATGGCCAGATTCGGAACTTAAATTTCCAAGACGAAATAATCTCACCCGCAGACGGAATTGTGATTCGAGCAGATCATTCCTATTCTCCCATGACTCTGTCAGATTATGAATATCACACTACCCAATCCCAAAAAGGAACCGTGACTTATGTTGAAAAAGATTTTGGAGGAAGACAAGTTTGGATCGATCACGGTCACGGTGTAATGACTAGCTTCAACCATCTTTCTTCGATTCATAAAAACATAAAAGTAGGCGAAAAAGTTAAACAAGGAGAATCAATCGGAACCGTTGGAAACTCAGGTTTATTAGAAGAAGCGAAAAATATCTCAGACAATATTCATCTTCATTTTGAAATCTGGGTAGACGGTGAATTTTTAGGAAACGGTCTCCCTCCCGCTCAAGTTCGCAAATTACTTCAATTCTTTTTCAAAAGAAACGGAGTGGAT-3’SEQIDNO.1荧光探针LA2582-P：5’-CATAAACTCGGAAATATAG-3’SEQIDNO.2正向引物LA2582-F：5’-CAAATCAAAACGTGGAACTGCAT-3’SEQIDNO.3反向引物LA2582-R：5’-GGAAATGAGTCCGTCAGGAACT-3’SEQIDNO.4。实施例2：PCR反应液，问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因阳性质控品和阴性质控品PCR反应液包括Taq酶、dNTP、缓冲液等成分，可以使用购自杭州擎科梓熙生物技术有限公司的PCR反应液，例如TSE3012xT5FastqPCRMixProbe。问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因阳性质控品的制备：采用问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因特异性引物对扩增人工合成的靶基因序列SEQIDNO.1，通过基因工程方法构建pET42a-LA2582重组质粒，转导至DH10B菌进行质粒扩增和提取质粒，此质粒溶液即为问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因阳性质控品。阳性质控品中的pET42a-LA2582重组质粒示意图如图4所示。阴性质控品为ddH20。本发明试剂盒应包括前述探针和引物、PCR反应液，问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因阳性质控品和阴性质控品。实施例3：检测方法模板DNA制备：取1ml问号钩端螺旋体培养物转至1.5mL离心管，12000rpm离心5min；去上清，收集沉淀，采用Axygen细菌基因组提取试剂盒提取问号钩端螺旋体基因组。标准曲线制作：问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因阳性质控品，稀释浓度至1ngμL，然后10倍梯度稀释获得7个浓度梯度S7-1，即1ngμL、10-1ngμL、10-2ngμL、10-3ngμL、10-4ngμL、10-5ngμL、10-6ngμL。采用LA2582-P、LA2582-F和LA2582-R对S7-1在ABI7500进行实时荧光PCR检测并生成标准曲线，并将扩增产物进行凝胶电泳分析，结果如图5、图6和图7所示。线性关系良好R2＝0.991；反应效率高Eff％＝99.884％。PCR扩增：反应体系组分如表1所示，反应程序如表2所示。表1问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因实时荧光PCR检测的扩增体系组成PCR反应液2xT5FastqPCRMixProbe10μL上游引物LA2582-F10μM0.8μL下游引物LA2582-R10μM0.8μL荧光探针LA2582-P10μM0.8μL参比荧光ROXReferenceDyeII50x0.4μLDNA提取物Template2-5μL灭菌超纯水ddH2OUpto20μL表2问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因实时荧光PCR检测的反应程序结果分析：反应结束后，基线的选取设置为“自动”。阈值threshold设定原则是阈值线刚好超过阴性质控品扩增曲线无规则的噪音线的最高点。质量控制：阴性质控品和空白对照的Ct值均为40或“Undetermined”，阳性质控品Ct值≤35，否则本次实验无效，全部实验应重新进行。待测样本的检测结果分析如表3所示。表3问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因实时荧光PCR检测结果的解释结果判定扩增结果阴性-无明显S型扩增曲线或Ct值≧40或“Undetermined”阳性+典型的S型扩增曲线或Ct值40应用实施例1：收集淋球菌、梅毒螺旋体、沙眼衣原体、结核分枝杆菌、肺炎支原体、白色念珠菌、大肠杆菌的阳性临床标本各5例、问号钩端螺旋体感染小鼠尿液标本10例，并提取的DNA溶液作为本发明试剂盒的模板进行问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因实时荧光PCR检测。本试验检测结果分析如表4所示。表4应用实施例检测结果

权利要求：1.一种TaqMan探针法检测问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的试剂盒，其特征在于包括用于问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因检测的特异性引物对正向引物LA2582-F和反向引物LA2582-R、荧光探针LA2582-P和阳性质控品pET42a-LA2582重组质粒，所述正向引物LA2582-F和反向引物LA2582-R、荧光探针LA2582-P和阳性质控品pET42a-LA2582重组质粒的序列如下：正向引物LA2582-F：5’-CAAATCAAAACGTGGAACTGCAT-3’；反向引物LA2582-R：5’-GGAAATGAGTCCGTCAGGAACT-3’；荧光探针LA2582-P：5’-CATAAACTCGGAAATATAG-3’；阳性质控品重组质粒pET42a-LA2582：2.如权利要求1所述的一种TaqMan探针法检测问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的试剂盒，其特征在于所述问号钩端螺旋体金属蛋白酶荧光探针的两端分别进行修饰，5’端标记报告荧光素或荧光染料，3’端标记淬灭基团。3.如权利要求2所述的一种TaqMan探针法检测问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的试剂盒，其特征在于所述的报告荧光素或荧光染料为FAM或其它任何可以作为探针标记的荧光素或荧光染料；淬灭基团为MGB或其它任何可以作为淬灭基团的化学物质。4.如权利要求1所述的一种TaqMan探针法检测问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括PCR反应液和阴性质控品。5.如权利要求1所述的一种TaqMan探针法检测问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的试剂盒，其特征在于所述的问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因阳性质控品含人工合成序列，所述人工合成序列为人工合成含所述问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因特异性引物对LA2582-F和LA2582-R扩增产物片段和荧光探针LA2582-P结合区的序列。6.如权利要求4所述的一种TaqMan探针法检测问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的试剂盒，其特征在于所述阴性质控品为灭菌超纯水ddH20。7.一种用于问号钩端螺旋体金属蛋白酶基因的检测方法，其特征在于采用权利要求1-6中任一项权利要求所述的TaqMan探针或引物或试剂盒进行检测。

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