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申请/专利权人：徐州医科大学

摘要：本发明涉及一种AURKA‑CKO1‑N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，通过先构建重组打靶载体，线性化后转染胚胎干细胞，筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆，扩增后注入供体小鼠囊胚生产出嵌合体小鼠；嵌合体小鼠与flp小鼠交配获得阳性F1代小鼠；阳性F1代小鼠与组织特异性表达Cre重组酶的小鼠交配后，后代中获得具有AURKA‑CKO1‑N条件性基因敲除的小鼠模型。本发明所述的AURKA‑CKO1‑N条件性基因敲除小鼠模型，AURKA基因在特定组织和细胞类型中功能性缺失，为研究Aurora‑A在特定肿瘤发生发展中的作用机制提供理想模型。

主权项：1.一种AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1构建AURKA条件性基因敲除的重组打靶载体；2所述重组打靶载体经线性化后，转染胚胎干细胞；3筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆；4将筛选出的发生同源重组的阳性胚胎干细胞克隆经扩增后，注入供体小鼠的囊胚；5将含有阳性胚胎干细胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宫，生产出嵌合体小鼠；6嵌合体小鼠与flp小鼠交配获得阳性F1代去Neo杂合子小鼠；7阳性F1代去Neo杂合子小鼠与组织特异性表达Cre重组酶的小鼠交配后，获得双杂合的小鼠；8雌性与雄性双杂合小鼠互交，后代中获得具有AURKA-CKO1-N条件性基因敲除的小鼠模型；采用Infusion方法构建所述重组打靶载体，具体操作如下：使用细菌人工染色体BAC打靶，将2个loxP位点分别插入到内含子2和内含子3，当Cre表达时敲除小鼠AURKA基因第3号外显子，并用Neo基因替换、造成移码突变，使蛋白翻译提前终止在第3号外显子；上游臂4.2kb，下游臂4.0kb，下游臂侧翼接磷酸甘油酸激酶启动子介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶负筛选标记基因基因表达框，最终得到AURKA-CKO同源重组打靶载体；所述重组打靶载体包含4.2kb5’同源臂、0.6kb两侧引入重组酶Loxp位点区域、磷酸甘油酸激酶新霉素抗性正筛选标记基因、4.0kb3’同源臂和单纯疱疹病毒胸苷激酶负筛选标记基因。

全文数据：AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法技术领域本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法。背景技术基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术。基因敲除的定义是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。Aurora-A是参与调控细胞有丝分裂的一类重要的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，其编码基因定位于易位、缺失、扩增活跃的20q13.2染色体区域。意味着其表达模式具有天然的不稳定性。Aurora-A异常表达会引起细胞有丝分裂异常，进而导致基因组不稳定而诱发肿瘤形成。越来越多的研究显示，Aurora-A在结直肠癌、神经胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌中异常高表达；此外，该区域扩增也被认为与患者预后不良有关。然而，Aurora-A参与肿瘤发生、发展的机制有待进一步阐明。然而，由于Aurora-A全身敲除小鼠容易造成小鼠胚胎致死。因此，构建条件性基因敲除小鼠模型为研究Aurora-A在肿瘤形成中的作用至关重要。发明内容为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法。本发明的构建方法，通过利用Aurka基因flox小鼠与组织特异性表达Cre重组酶的小鼠交配后，其后代flox纯合、Cre阳性小鼠的flox区域被敲除，导致Aurka基因在特定组织和细胞类型中功能性缺失，为有目的的研究Aurora-A在特定肿瘤发生发展中的作用机制提供理想的模型。本发明所采用的技术方案为：一种AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：1构建AURKA条件性基因敲除的重组打靶载体；2所述重组打靶载体经线性化后，转染胚胎干细胞；3筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆；4将筛选出的发生同源重组的阳性胚胎干细胞克隆经扩增后，注入供体小鼠的囊胚；5将含有阳性胚胎干细胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宫，生产出嵌合体小鼠；6嵌合体小鼠与flp小鼠交配获得阳性F1代去Neo杂合子小鼠；7阳性F1代去Neo杂合子小鼠与组织特异性表达Cre重组酶的小鼠交配后，获得双杂合的小鼠；8雌性与雄性双杂合小鼠互交，后代中获得具有AURKA-CKO1-N条件性基因敲除的小鼠模型。采用Infusion方法构建所述重组打靶载体，具体操作如下：使用细菌人工染色体BAC打靶，使2个loxP位点分别插入到内含子2和内含子3，当Cre表达时可敲除小鼠AURKA基因第3号外显子，并用Neo基因替换、造成移码突变，使蛋白翻译提前终止在第3号外显子；上游臂4.2kbDNA千碱基对，下游臂4.0kb，下游臂侧翼接磷酸甘油酸激酶启动子介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶负筛选基因基因表达框，最终得到AURKA-CKO同源重组打靶载体。所述重组打靶载体进行线性化的具体操作为：100μgAURKA-CKO同源重组打靶载体用NotI酶用量：300IU线性化，酶切体系为250μL，37℃消化过夜；等体积苯酚-三氯甲烷、三氯甲烷处理后，无水乙醇沉淀，100μL无菌PBS重悬备用。所述转染为电转染。所述电转染的具体操作条件为：ES细胞用胰酶消化后重悬于PBS中，取35μg载体DNA与0.8ml细胞混匀后加入电穿孔槽中，将电击后的细胞分入已铺好滋养层细胞的培养皿中，置于CO2孵箱培养；ES细胞在电穿孔24h和48h后分别换含有选择药物G418终浓为250mgL和2μMGancyclovir培养液进行选择性培养，第7-8天挑取ES细胞克隆，即完成所述转染。步骤2中，筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆的具体操作为：抽提抗性克隆的基因组DNA，进行跨5’臂或3’臂和插入片段的长链PCR鉴定。PCR鉴定时，5’臂的引物序列分别为P1：5’-GCAGGTCCTACTGGCAGATG-3’，P2：5’-CGTGCCTCTCCTTTCTGGAG-3’，目的片段为4.6kb，PCR反应条件为：95℃3min，98℃15s，61℃15s，68℃3min，68℃5min，共32个循环这里PCR的循环是指中间的“3个环节”的循环。PCR鉴定时，3’臂的引物序列分别为P3：5’-AAGCTTGATATCGAATTCCGAA-3’，P4：5’-GCACTCGCAAGAAAAGGGTG-3’，目的片段为6.1kb，PCR反应条件为：95℃3min，98℃15s，61℃15s，68℃3min，68℃5min，共32个循环。所述供体小鼠为C57BL6供体小鼠。本发明的有益效果为：本发明所述的AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，通过先构建AURKA条件性基因敲除的重组打靶载体，所述重组打靶载体经线性化后，转染胚胎干细胞，筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆，并将筛选出的发生同源重组的阳性胚胎干细胞克隆经扩增后，注入供体小鼠的囊胚；将含有阳性胚胎干细胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宫，生产出嵌合体小鼠；嵌合体小鼠与flp小鼠交配获得阳性F1代去Neo杂合子小鼠；阳性F1代去Neo杂合子小鼠与组织特异性表达Cre重组酶的小鼠交配后，获得双杂合的小鼠；雌性与雄性双杂合小鼠互交，后代中获得具有AURKA-CKO1-N条件性基因敲除的小鼠模型。本发明的构建方法，通过利用AURKA基因flox小鼠即阳性F1代去Neo杂合子小鼠与组织特异性表达Cre重组酶的小鼠交配后，其后代flox纯合、Cre阳性小鼠的flox区域被敲除，导致AURKA基因在特定组织和细胞类型中功能性缺失，为有目的的研究Aurora-A在特定肿瘤发生发展中的作用机制提供理想的模型。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是ES细胞同源重组阳性克隆PCR鉴定策略示意图；图2是ES细胞阳性克隆5’臂PCR鉴定电泳图；图3是ES细胞阳性克隆3’臂PCR鉴定电泳图；图4是阳性F1代去Neo杂合子小鼠的鉴定策略示意图；图5是阳性F1代去Neo杂合子小鼠5’同源臂的PCR鉴定电泳图；图6是阳性F1代去Neo杂合子小鼠3’同源臂的PCR鉴定电泳图；图7是F1代小鼠5’同源臂PCR鉴定测序比对结果1#图；图8是F1代小鼠5’同源臂PCR鉴定测序比对结果2#图；图9是F1代小鼠3’同源臂PCR鉴定测序比对结果1#图；图10是F1代小鼠3’同源臂PCR鉴定测序比对结果2#图。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。目的基因名称MGI号：AurkaMGI:894678方案针对的转录本Ensembl号：Aurka-202ENSMUST00000109139.7Flox针对的exon：exon3。实施例1本实施例提供一种AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：1构建AURKA条件性基因敲除的重组打靶载体使用ES细胞JM8A3ES细胞，来源于C57BL6N品系载体打靶AURKA基因，打靶使用细菌人工染色体BAC，使2个loxP位点分别插入到内含子2和内含子3，当Cre表达时可敲除小鼠AURKA基因第3号外显子，并用Neo基因替换、造成移码突变，使蛋白翻译提前终止在第3号外显子；上游臂4.2kbDNA千碱基对，下游臂4.0kb，下游臂侧翼接磷酸甘油酸激酶启动子介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶负筛选标记基因基因表达框，最终得到得到AURKA条件性基因敲除的重组打靶载体；所述重组打靶载体包含4.2kb5’同源臂、0.6kb两侧引入重组酶Loxp位点区域、磷酸甘油酸激酶新霉素抗性正筛选标记基因、4.0kb3’同源臂和单纯疱疹病毒胸苷激酶负筛选标记基因2先对所述重组打靶载体进行线性化处理，再使用线性化后的重组打靶载体进行细胞转染；所述线性化处理的具体操作如下：100μgAURKA-CKO同源重组打靶载体用酶用量300IU的NotI线性化，酶切体系为250μL，37℃消化过夜；之后用等体积的苯酚-三氯甲烷和三氯甲烷处理，无水乙醇沉淀，100μL无菌PBS重悬；使用线性化后的重组打靶载体进行细胞电转染，具体操作如下：ES细胞用胰酶消化后重悬于PBS中，ES细胞浓度为1.5X107ml；取35μg载体DNA与0.8ml细胞混匀后加入电穿孔槽中，以240V、500μF的电参数进行电穿孔，将电击后的细胞分入已铺好滋养层细胞的培养皿中，置于CO2孵箱培养；3筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆，克隆筛选条件为：ES细胞在电穿孔24h和48h后分别换含有250mgL选择药物G418和2μMGancyclovir培养液进行选择性培养，第7-8天挑取ES细胞克隆的基因组DNA，进行跨5’臂或3’臂和插入片段的长链PCR鉴定；5’臂的臂引物为P1和P2其中P2引物位于neo重组区域，目的片段为4.6kb，PCR反应条件为：95℃3min，98℃15s，61℃15s，68℃3min，68℃5min，共32个循环；3’臂的臂引物为P3和P4其中P3引物位于neo重组区域，目的片段为6.1kb，PCR反应条件为：95℃3min，98℃15s，61℃15s，68℃3min，68℃5min，共32个循环；P1、P2、P3、P4的PCR鉴定引物序列如表1所示。挑取抗性克隆和提供DNA样本共144份。PCR鉴定药物抗性ES细胞克隆144个，其中11个正确同源重组的阳性ES细胞克隆，如图2和图3所示分别为5’臂、3’臂的PCR鉴定电泳图，其中1A4，1D10，1E1，1E11，1F1，1F11，1G3，2A3，2B4，2D3，2D4为阳性克隆，M为1kb的DNA分子量标准。ES细胞克隆鉴定如图1所示。同源重组阳性克隆PCR鉴定方案：5’臂同源重组阳性克隆应扩增出4.6kb片段，阴性克隆应扩增出6.7kb片段；3’臂同源重组阳性克隆应扩增出6.1kb片段，阴性克隆应无产物。表1-PCR鉴定引物序列PrimerSequenceP15’-GCAGGTCCTACTGGCAGATG-3’P25’-CGTGCCTCTCCTTTCTGGAG-3’P35’-AAGCTTGATATCGAATTCCGAA-3’P45’-GCACTCGCAAGAAAAGGGTG-3’4将筛选出的发生同源重组的阳性胚胎干细胞克隆经扩增后，注入C57BL6供体小鼠的囊胚，共注射130个囊胚；5将含有阳性胚胎干细胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宫，生产出嵌合体小鼠；6将嵌合率大于50％的19只成熟雄性小鼠与野生型C57BL6J雌性小鼠flp小鼠交配，后代灰色小鼠经提取尾基因组DNA进行PCR鉴定，共获得6只阳性F1代去Neo杂合子小鼠；阳性F1代去Neo杂合子小鼠的PCR鉴定策略如图4所示，阳性F1代小鼠5’臂同源重组阳性克隆应扩增出4.6kb片段，阴性克隆应扩增出6.7kb片段；3’臂同源重组阳性克隆应扩增出4.4kb片段，阴性克隆应无产物。如图5和图6所示分别为阳性F1代去Neo杂合子小鼠的5’同源臂和3’同源臂的PCR鉴定电泳图。其中，数字代表“阳性F1代小鼠编号”，WT代表“野生型C57BL6J”对照，M代表1kbDNA分子量标准；阳性F1代小鼠PCR鉴定产物测序，共进行了4个测序反应。测序反应对应的区域，如图7、8、9、10所示。其中，5’同源臂鉴定，PCR产物测序共进行了2个测序反应，分别标注为：1#、2#，图7、图8分别为1#、2#的测序反应比对结果。3’同源臂鉴定，PCR产物测序共进行了2个测序反应，分别标注为：3#、4#，图9、图10分别为3#、4#的测序反应比对结果。图7-10中，Query为目的序列Aurka-CKO1-NrecombinatedgenomicDNAsequenceDeleteNeo，Subject为测序结果，可见，测序结果与目的序列完全符合；7阳性F1代去Neo杂合子小鼠与组织特异性表达Cre重组酶的小鼠交配后，获得双杂合的小鼠；8雌性与雄性双杂合小鼠互交，后代中获得具有AURKA-CKO1-N条件性基因敲除的小鼠模型。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

权利要求：1.一种AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1构建AURKA条件性基因敲除的重组打靶载体；2所述重组打靶载体经线性化后，转染胚胎干细胞；3筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆；4将筛选出的发生同源重组的阳性胚胎干细胞克隆经扩增后，注入供体小鼠的囊胚；5将含有阳性胚胎干细胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宫，生产出嵌合体小鼠；6嵌合体小鼠与flp小鼠交配获得阳性F1代去Neo杂合子小鼠；7阳性F1代去Neo杂合子小鼠与组织特异性表达Cre重组酶的小鼠交配后，获得双杂合的小鼠；8雌性与雄性双杂合小鼠互交，后代中获得具有AURKA-CKO1-N条件性基因敲除的小鼠模型。2.根据权利要求1所述的AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，采用Infusion方法构建所述重组打靶载体，具体操作如下：使用细菌人工染色体BAC打靶，将2个loxP位点分别插入到内含子2和内含子3，当Cre表达时敲除小鼠AURKA基因第3号外显子，并用Neo基因替换、造成移码突变，使蛋白翻译提前终止在第3号外显子；上游臂4.2kb，下游臂4.0kb，下游臂侧翼接磷酸甘油酸激酶启动子介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶负筛选标记基因基因表达框，最终得到AURKA-CKO同源重组打靶载体。3.根据权利要求1所述的AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述重组打靶载体包含4.2kb5’同源臂、0.6kb两侧引入重组酶Loxp位点区域、磷酸甘油酸激酶新霉素抗性正筛选标记基因、4.0kb3’同源臂和单纯疱疹病毒胸苷激酶负筛选标记基因。4.根据权利要求1所述的AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述重组打靶载体进行线性化的具体操作为：100μgAURKA-CKO同源重组打靶载体用酶用量300IU的NotI线性化，酶切体系为250μL，37℃消化过夜；之后用等体积的苯酚-三氯甲烷和三氯甲烷处理，无水乙醇沉淀，100μL无菌PBS重悬。5.根据权利要求1所述的AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述转染为电转染。6.根据权利要求5所述的AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述电转染的具体操作为：ES细胞用胰酶消化后重悬于PBS中，取35μg载体DNA与0.8ml细胞混匀后加入电穿孔槽中，将电击后的细胞分入已铺好滋养层细胞的培养皿中，置于CO2孵箱培养。7.根据权利要求1所述的AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤2中，筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆的具体操作为：ES细胞在电穿孔24h和48h后分别换含有250mgL选择药物G418和2μMGancyclovir培养液进行选择性培养，第7-8天挑取ES细胞克隆的基因组DNA，进行跨5’臂或3’臂和插入片段的长链PCR鉴定。8.根据权利要求7所述的AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，PCR鉴定时，5’臂的引物序列分别为P1：5’-GCAGGTCCTACTGGCAGATG-3’，P2：5’-CGTGCCTCTCCTTTCTGGAG-3’，目的片段为4.6kb，PCR反应条件为：95℃3min，98℃15s，61℃15s，68℃3min，68℃5min，共32个循环。9.根据权利要求7所述的AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，PCR鉴定时，3’臂的引物序列分别为P3：5’-AAGCTTGATATCGAATTCCGAA-3’，P4：5’-GCACTCGCAAGAAAAGGGTG-3’，目的片段为6.1kb，PCR反应条件为：95℃3min，98℃15s，61℃15s，68℃3min，68℃5min，共32个循环。10.根据权利要求1所述的AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述供体小鼠为C57BL6供体小鼠。

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