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申请/专利权人：肿瘤疗法科学股份有限公司

摘要：本发明提供了具有诱导细胞毒性T细胞的能力的CDCA1衍生的表位肽。本发明还提供编码所述肽的多核苷酸，呈递所述肽的抗原呈递细胞，和靶向所述肽的细胞毒性T细胞，以及诱导抗原呈递细胞或CTL的方法。本发明还提供了含有它们作为活性成分的组合物和药物组合物。此外，本发明提供了使用本发明的肽、多核苷酸、抗原呈递细胞、细胞毒性T细胞或药物组合物来治疗和或预防癌症，和或预防其手术后复发的方法。还提供了诱导针对癌症的免疫应答的方法。

主权项：1.具有细胞毒性T细胞CTL诱导能力的肽，其由SEQIDNO:7的氨基酸序列组成。

全文数据：CDCA1衍生的肽和含有它们的疫苗技术领域[0001]发明涉及生物科学领域，更具体的说涉及癌症治疗领域。具体而言，本发明涉及作为癌症疫苗有效的新肽，使用所述肽治疗和或预防肿瘤的方法，以及包含所述肽的药物组合物。[0002]本申请要求提交于2014年08月04日提交的日本专利申请（日本专利申请号2014-158922、2014-158923,和2014-158924的权益，其全部内容通过提述并入本文。[0003]发明背景[0004]已经显示细胞毒性T细胞CTLs可识别主要组织相容性复合物MHCI类分子上发现的肿瘤相关抗原TAA所衍生的表位肽，然后杀死肿瘤细胞。从发现黑素瘤抗原MAGE家族以来，已经通过免疫学方法发现了许多其它TAANPLl:BoonT，IntJCancer1993May8,542:177-80；NPL2:BoonTvanderBruggenP,JExpMed1996Mar1,1833:725-9。这些TAAs中的一些目前正在作为免疫治疗靶标进行临床开发。[0005]在这些TAAs中的数个中，鉴定了可以被CTLs识别的表位肽，并且预期它们在用于各种类型的癌症的免疫治疗中的应用（NPL3:HarrisCC，JNatlCancerInst19960ct16,8820:1442-55;NPL4:ButterfieldLH等人，CancerRes1999Jul1,5913:3134-42;NPL5:VissersJL等人，CancerRes1999Nov1,5921:5554_9;NPL6:vanderBurgSH等人JImmunol1996May1,156⑶3308-14;NPL7:TanakaF等人，CancerRes19970ct15,5720:4465-8;NPL8:FujieT等人，IntJCancer1999Jan18,802:169-72;NPL9:KikuchiM等人，IntJCancer1999May5,813:439-66;NPL10:0isoM等人，IntJCancer1999May5,813:387-94。到目前为止，已经报道了使用这些TAA衍生的CTL表位肽的几项临床试验。不幸的是，许多这些临床试验显示出低的客观反应率NPL11:Be11iF等人，JClinOncol20020ct15,2020:4169-80;NPL12:CouliePG等人，ImmunolRev20020ct，188:33-42;NPL13:RosenbergSA等人，NatMed2004Sep，109:909-15。因此，仍然需要鉴定可以用于癌症免疫治疗的新的CTL表位。[0006]CDCAl细胞分裂周期相关蛋白1;也描述为NUF2、NDC80动粒复合物组分NDC80kinetochorecomplexcomponent:Nuf2;参考序列：GeneBank登录号NM_145697SEQIDN0:81或GeneBank登录号NM_031423SEQIDN0:83，已被鉴定为与CDC2、细胞周期蛋白、拓扑异构酶II和其它细胞周期基因共表达的基因的成员（NPL14:Walker等人，CurrCancerDrugTargets2001May;l1:73-83。已经发现CDCAl与经历有丝分裂的HeLa细胞的着丝粒相关，并被认为是酵母Nuf2的功能同源物（NPL15:WiggePA等人，JCellBiol2001Jan22;1522:349-60。同时，通过使用包含23,040个基因的全基因组cDNA微阵列的基因表达谱分析，已经将⑶CA1鉴定为在非小细胞肺癌中上调的基因（NPL16:Hayama等人，CancerRes2006Nov1;6621:10339-48;PTL1:W02007013480;PTL2:W02005089735。⑶CAl表达在肿瘤和肿瘤细胞系中上调，并且在除睾丸外的正常器官中检测不到NPL16;PTL1。此外，siRNA介导的⑶CA1表达的下调引起表达⑶CA1的肺癌细胞系中细胞增殖的抑制。[0007]最近，已经鉴定了CDCAl衍生的HLA-A2限制性CTL表位肽（NPL17:Haraoetal.，IntJCancer.2008:12311:2616-25;PTL3:W02009025117和HLA-A24限制性CTL表位肽PTL4:W02009153992。这些肽在具有HLA-A2型或HLA-A24型的癌症患者中有效，但不能预期对不具有这些HLA型的癌症患者具有效果。[0008][引用列表][0009][专利文献][0010][PTL1]W02007013480[0011][PTL2]W02005089735[0012][PTL3]W02009025117[0013][PTL4]W02009153992[00M][非专利文献][0015][NPLl]BoonT，IntJCancerl993May8,54®:177-80[0016][NPL2]BoonTvanderBruggenP,JExpMed1996Mar1,1833:725-9[0017][NPL3]HarrisCCJNatlCancerInst19960ct16,8820:1442-55[0018][NPL4]ButterfieldLH等人，CancerRes1999Jul1,5913:3134-42[0019][NPL5]VissersJL等人，CancerRes1999Nov1,5921:5554-9[0020][NPL6]vanderBurgSH等人，JImmunol1996MayI，1569:3308-14[0021][NPL7]TanakaF等人，CancerRes19970ct15,5720:4465-8[0022][NPL8]FujieT等人，IntJCancer1999Jan18,802:169-72[0023][NPL9]KikuchiM等人，IntJCancer1999May5,813:459-66[0024][NPL10]OisoM等人，IntJCancer1999May5,813:387-94[0025][NPLll]BelliF等人JClinOncol20020ct15,2020:4169-80[0026][NPL12]CouliePG等人，ImmunolRev20020ct，188:33-42[0027][NPL13]RosenbergSA等人，NatMed2004Sep,109:909-15[0028][NPL14]Walker等人，CurrCancerDrugTargets2001May，II:73-83[0029][NPL15]WiggePA等人JCellBiol2001Jan22,1522:349-60[0030][NPL16]Hayama等人，CancerRes2006Nov1,6621:10339-48[0031][NPL17]Harao等人，IntJCancer2008Dec1,12311:2616-25[0032]发明概述[0033]本发明涉及肽，其可以诱导对表达CDCAl的细胞特异性的细胞毒性T细胞CTLs。当这些肽通过人白细胞抗原HLA呈递在抗原呈递细胞APCs上时，诱导显示出针对表达CDCAl的细胞的特异性细胞毒性活性的CTLs。迄今已经鉴定的具有CTL诱导能力（CTL诱导力）的CDCAl衍生肽是HLA-A2限制性肽或HLA-A24限制性肽，其不能诱导针对不表达这些HLAs的细胞的CTLs。因此，常规肽不适合在不具有这些HLA的受试者中进行免疫治疗。HLA-All和HLA-A33是亚洲人常见的等位基因（SetteA，SidneyJ.,Immunogenetics1999,50:201-12，而HLA-A03是在高加索人中常见的等位基因（Cao等人，HumImmunol2001;629:1009-30。期望对HLA-Al1阳性受试者施用HLA-Al1限制性肽，对HLA-A33阳性受试者施用HLA-A33限制性肽，和对HLA-A03阳性受试者施用HLA-A03限制性肽。因此，本发明涉及⑶CAl衍生肽，其具有对HLA-AlI,HLA-A33，或HLA-A03限制性的CTL诱导能力。基于本文公开的结果，已经证明本发明的肽是表位肽，其能够诱导针对表达⑶CAl和HLA-AlI，HLA-A33，或HLA-A03的细胞的强力和特异性的免疫应答。[0034]因此，本发明的目的之一是提供能够以HLA-A11-，HLA-A33-，或HLA-A03-限制性方式诱导CTL的⑶CAl衍生肽。这些肽可以用于体外、离体或体内诱导CTL，或可用于施用至受试者用于诱导针对表达CDCAl的癌细胞的免疫应答的目的。优选的肽是包含选自以下氨基酸序列的肽SEQIDNOs:3，5至7，9，10，12至14，17，19，21，30，35，38至40，45，53，56，58，27，60，28，67，69和47;更优选的肽是九肽或十肽;和甚至更优选的肽是选自由以下氨基酸序列组成的肽SEQIDNOs:3,5至7,9,10,12至14,17,19,21,30,35,38至40,45,53,56,58,27，60,28,67,69和47。[0035]本发明的肽包含以下肽，其中一个，两个或更多个氨基酸被取代，缺失，插入和或添加，只要所得修饰肽保留了原始肽的CTL诱导能力。[0036]本发明还提供了分离的多核苷酸，其编码本发明的任一种肽。与本发明的肽类似，这些多核苷酸可用于诱导具有CTL诱导能力的APC，并可施用至受试者用于诱导针对⑶CAl表达的癌细胞的免疫应答。[0037]本发明还提供了组合物，其包含本发明的一种或多种类型的肽，编码本发明的一种或多种类型的肽的一种一种或多种类型的多核苷酸，本发明的APCs，呈递本发明肽的外来体，和或本发明的CTLs。本发明的组合物优选是药物组合物。本发明的药物组合物可用于治疗和或预防癌症，以及防止其手术后复发。它们还可以用于诱导针对癌症的免疫应答。当施用于受试者时，本发明的肽呈递于APC的表面上，结果诱导了靶向肽的CTL。因此，本发明的另一个目的是提供用于诱导CTLs的组合物，其中组合物包含一种或多种类型的本发明的肽，编码一种或多种类型的本发明的肽的一种或多种类型的多核苷酸，本发明的APC，和或呈递本发明的肽的外来体。[0038]本发明的另一个目的是提供诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其中所述方法包括将本发明的一种或多种类型的肽与APC接触的步骤，或将编码本发明的任何一种肽的多核苷酸引入APC的步骤。[0039]本发明还提供了诱导CTL的方法，包括将⑶8-阳性T细胞与在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的APC共培养的步骤，将CD8-阳性T细胞与在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的外来体共培养的步骤，或将载体引入CD8-阳性T细胞的步骤，所述载体包含编码T细胞受体TCR的每个亚基的多核苷酸，所述TCR能够结合由细胞表面上的HLA抗原所呈递的本发明的肽。本发明中优选的HLA抗原是HLA-AlI，HLA-A33，或HLA-A03。[0040]本发明的另一个目的是提供分离的APC，在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物。本发明还提供靶向本发明肽的分离的CTLs。这些APCs和CTLs可以用于针对表达CDCAl的癌症的免疫治疗。在本发明中，经受免疫治疗的癌症是例如存在于具有HLA-All，HLA-A33,或HLA-A03的纯合子或杂合子患者中的癌症。也就是说，本发明提供了用于表达CDCAl和至少一种选自HLA-AlI，HLA-A33，和HLA-A03的HLA抗原的癌症的免疫治疗。[0041]本发明的另一个目的是提供在受试者中诱导针对癌症的免疫应答的方法，其中所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包含本发明的肽，或编码所述肽的多核苷酸，本发明的APC，呈递本发明肽的外来体，和或本发明的CTL的步骤。本发明的另一个目的是提供在受试者中治疗和或预防癌症以及预防其手术后复发的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的肽，编码所述肽的多核苷酸，本发明的APC，呈递本发明肽的外来体，和或本发明的CTL的步骤。[0042]除了上述之外，当结合附图和实施例阅读以下详细描述时，本发明的其它目的和特征将变得更加显而易见。然而，应当理解，本发明的前述概述和以下详细描述都是示例性实施方案，而对本发明或本发明的其它替代实施方案不是限制性的。特别地，尽管本文参照多个具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，该描述是本发明的说明，而不构成对本发明的限制。在不脱离如所附权利要求所描述的本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可以想到各种修改和应用。同样地，本发明的其它目的，特征，益处和优点将从该概述和下面描述的某些实施方案中变得明显，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。从上述结合所附实施例，数据，附图和从其中得出的所有合理推断，单独或与并入本文的参考文献一同考虑，此类目的，特征，益处和优点将是显而易见的。[0043]附图简述[0044]图1-1:图1由照片a至V组成，其显示了使用衍生自CDCAl的肽诱导的CTLs中的干扰素（IFN-gamma酶联免疫点ELISP0T测定的结果。与对照相比，具有⑶CA1-A11-9-123SEQIDN0:3的孔#7中（a，具有CDCA1-A11-9_105SEQIDN0:5的孔#8中（b;具有CDCA1-A11-9_419SEQIDN0:6的孔#1中（c，具有CDCA1-A11-9_219SEQIDN0:7的孔#4中（d，具有CDCA1-A11-9_439SEQIDN0:9的孔#2中（e，具有CDCA1-A11-9_343SEQIDN0:10的孔#2中（f，具有CDCA1-A11-9-21SEQIDN0:12的孔#8中（g，具有0«^1411-9-157SEQIDNO:13的孔#3中（h，具有CDCA1-A11-9-244SEQIDNO:14的孔#7中⑴，具有CDCA1-A11-9_213SEQIDN0:17的孔#6中（j，具有CDCA1-A11-9_335SEQIDNO:19的孔#7中（k，具有CDCA1-A11-9-25SEQIDN0:21的孔#4中（1，具有CDCA1-A11-10-339SEQIDN0:30的孔#3中（m，具有CDCA1-A11-10-452SEQIDN0:35的孔#2中（η，具有CDCA1-A11-10-400SEQIDΝ0:38的孔#7中（〇，具有CDCA1-A11-10-289SEQIDNO:39的孔#6中（p，具有CDCA1-A11-10-203SEQIDN0:40的孔#5中（q，具有CDCA1-A11-10-156SEQIDN0:45的孔#2中（r，具有CDCA1-A11-10-340SEQIDN0:53的孔#2中s，具有CDCAl-Al1-10-106SEQIDNO:56的孔#4中⑴，和具有CDCAl-Al1-10-358SEQIDNO:58的孔#2中（u的CTLs显示出强的IFN-gamma生产。在这些照片中，孔上的正方形显示繁殖来自相应孔的细胞用于建立CTL系。与此相反，CDCA1-A11-10-391SEQIDN0:33V显示为其中没有特异性IFN-gamma产生的典型阴性数据的实例。图中，“+”表示针对用合适的肽冲击pulsed的革El细胞的IFN-ga_a产生;和表示针对尚未用任何肽冲击的革巴细胞的IFN-ga_a产生。[0045]图1-2显示了图1-1的延续。[0046]图2-1:图2由一系列的线型图（a至（i组成，显示了IFN-gamma酶联免疫吸附测定ELISA的结果，证实了用以下刺激的按顺序的CTL系中的IFN-gamma产生90%和身份。将肽以2〇11^1111溶解在二甲基亚砜中并保存于-80°：。[0550]体外CTL诱导[0551]使用单核细胞衍生的树突细胞DC作为抗原呈递细胞来诱导针对呈递在人白细胞抗原（HLA上的肽的细胞毒性T淋巴细胞（CTL应答。如在其他部分所述，体外制备DCNakaharaS等人，CancerRes2003,6314:4112-8。具体地说，用Ficoll-PaquePlusPharmacia溶液从健康志愿者HLA-A*1101阳性分离的外周血单核细胞，通过粘附塑料组织培养盘90%和身份。将肽以2〇11^1111溶解在二甲基亚砜中并保存于-80°：。[0588]体外CTL诱导[0589]使用单核细胞衍生的树突细胞DC作为抗原呈递细胞来诱导针对呈递在人白细胞抗原（HLA上的肽的细胞毒性T淋巴细胞（CTL应答。如在其他部分所述，体外制备DCNakaharaS等人，CancerRes2003,6314:4112-8。具体地说，用Ficoll-PaquePlusPharmacia溶液从健康志愿者HLA-A*3303阳性分离的外周血单核细胞，通过粘附塑料组织培养盘90%和身份。将肽以2〇11^1111溶解在二甲基亚砜中并保存于-80°：。[0626]体外CTL诱导[0627]使用单核细胞衍生的树突细胞DC作为抗原呈递细胞来诱导针对呈递在人白细胞抗原（HLA上的肽的细胞毒性T淋巴细胞（CTL应答。如在其他部分所述，体外制备DCNakaharaS等人，CancerRes2003,6314:4112-8。具体地说，用Ficoll-PaquePlusPharmacia溶液从健康志愿者HLA-A*0301阳性分离的外周血单核细胞，通过粘附塑料组织培养盘3ectonDickinson加以分离，并作为单核细胞级分加以浓缩。将单核细胞富集的群体在含2%热灭活的自体血清AS的AM-V培养基（Invitrogen中，在1000IUml的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子RDSystem和1000IUml白介素（IL-4RDSystem的存在下培养。培养7天后，将经细胞因子诱导的DC在AM-V培养基中在3微克mli32-微球蛋白存在下用20微克ml每一种合成肽于37°C冲激3小时。所生成的细胞表观上在它们的细胞表面上表达DC相关分子，诸如⑶80、CD83、⑶86和HLAII类数据未显示）。接着，将这些经肽冲激的DC用X射线放射20Gy灭活，并以1:20比例与用⑶8阳性分离试剂盒Dynal通过阳性选择获得的自体⑶8+T细胞混合。将这些培养产物接种于48孔板Corning中。制备每个孔，以在0.5mlAIM-V2%AS培养基中含有1.5xIO4个经肽冲激的DC、3xl05个CD8+T细胞和10ngmlIL-7RDSystem。3天后，向这些培养物添加终浓度为20IUml的IL-2CHIRON。在第7天和第14天，将这些T细胞用经肽冲激的自体DC进一步刺激。DC每次通过与上文所述相同的方式来制备。在第21天在第三次肽刺激后，通过人干扰素（IFN-gamma酶联免疫斑点ELISP0T测定法来检测针对经肽冲激的C1R-A03细胞的CTLsTanakaH等人，BrJCancer2001,841:94-9;UmanoY等人，BrJCancer2001,848:1052-7;UchidaN等人，ClinCancerRes2004,1024:8577-86;SudaT等人，CancerSci2006,975:411-9;WatanabeT等人，CancerSci2005,968:498-506。[0628]CTL扩增程序[0629]使用与Riddell等人WalterEA等人，NEnglJMed19950ct19,33316:1038-44;RiddellSR等人，NatMed1996Feb，22:216-23公开的方法相似的方法在培养中扩增CTL。将CTLs与两种类型的经丝裂霉素C处理的人B淋巴母细胞系在总共25ml的AM-V培养基中共培养5xIO6细胞烧瓶），所述培养基含有含5%ASA頂-V5%AS和40ngml抗-CD3抗体。开始培养后一天，向培养物添加120IUmlIL-2。在第5天、第8天和第11天，向培养物中添加含有30IUmlIL-2的新鲜A頂-V5%AS培养基TanakaH等人，BrJCancer2001，84l:94_9;UmanoY等人，BrJCancer2001,848:1052_7;UchidaN等人，ClinCancerRes2004,1024:8577-86;SudaT等人，CancerSci2006,975:411-9;WatanabeT等人，CancerSci2005,968:498-506。[0630]CTL克隆的建立[0631]在96圆底微量滴定板NalgeNuncInternational中进行CTLs稀释以制成0·3、1和3个细胞孔。在含有30ngml的抗CD3抗体和125IUml的IL-2的总共150微升孔的AM-V5%AS培养基中，将CTLs与两种类型的经丝裂霉素C处理的人B淋巴母细胞系共培养（lxIO4细胞孔）。1〇天后向培养基中加入50微升孔的IL-2以达到125IUml的终浓度。在第14天测试CTL活性，并使用如上所述的相同方法扩增CTL克隆（UchidaN等人,ClinCancerRes2004,1024:8577-86;SudaT等人，CancerSci2006,975:411-9;WatanabeT等人，CancerSci2005,968:498-506〇[0632]特异性CTL活性[0633]为了检查特异性CTL活性，实施了IFN-gammaELISP0T测定法和IFN-gamma酶联免疫吸附测定法ELISA。具体地，制备经肽冲激的C1R-A03IxlO4细胞孔作为刺激细胞。使用诱导的CTLsS卩CTL系和CTL克隆）用作应答细胞。根据制造商的说明实施IFN-gammaELISP0T测定法和IFN-gammaELISA。[0634]强迫表达靶基因和HLA_A*0301的靶细胞的建立[0635]通过PCR来扩增编码靶基因或HLA-A*0301的开放阅读框的cDNA。将PCR扩增产物克隆入表达载体。使用Lipofectamine2000Invitrogen依照制造商的说明将表达革El基因的载体和表达HLA-A*0301的载体之一或两者转染入⑶S7其是靶基因和HLA阴性的细胞系）。转染两天后，用VerseneInvitrogen收获经转染的细胞，并用作CTL活性测定法的祀细胞5xIO4细胞孔。[0636]结果[0637]CDCAl衍生的HLA_A*0301结合肽的预测[0638]表3a和3b以结合亲和力的降序显示了已预测结合HLA-A*0301的⑶CAl衍生的9聚体肽和10聚体肽。选择并检查了总共24种潜在具有HLA-A*0301结合能力的肽以确定表位肽。[0639][表3a][0640]衍生自CDCAl的HLA-A03结合9聚体肽[0645]起始位置指示从CDCAl的N端起的氨基酸残基的数目，解离常数[KdnM]来源于〃NetMHC3.2〃。[0646]通过预测的⑶CAl衍生的HLA-A*0301限制性肽来诱导CTLs[0647]依照如“材料和方法”中描述的方案生成针对CDCAl衍生的肽的CTLs。通过IFN-gammaELISP0T测定法测量肽特异性CTL活性（图9。与对照相比，具有CDCA1-A03-9-219SEQIDN0:7的孔#3a，具有CDCA1-A03-10-400SEQIDN0:38的孔#lb，和具有CDCA1-A03-10-257SEQIDN0:47的孔#2c显示出强的IFN-gamma生成。与此同时，尽管示于表3a和3b中的其他肽潜在具有HLA-A*0301结合活性，未检测到作为这些肽的刺激的结果的特异性CTL活性。典型阴性数据的实例是从用CDCA1-A03-9-343SEQIDNO:10刺激的CTLs中未观察到特异性IFN-ga_a产生d。结果，选择三种类型的⑶CAl衍生肽作为能够诱导有效CTL的肽。[0648]针对CDCAl衍生的HLA-A*0301限制性肽的CTL系和克隆的建立[0649]通过增殖具有CDCA1-A03-9-219SEQIDN0:7的孔#3a，具有〇»^1-厶03-10-400SEQIDN0:38的孔#lb，具有CDCAl-A03-10-257SEQIDN0:47的孔#2c中的CTLs来建立CTL系，其在IFN-gammaELISP0T测定法中显示出肽特异性CTL活性。通过IFN-gammaELISA测量这些CTL系的CTL活性（图10。与没有用肽冲击的靶细胞相比，这些CTL系表现出针对用相应肽冲击的革G细胞的强的IFN-gamma生成。此外，通过从如以上“材料和方法”部分中描述的CTL系的有限稀释建立CTL克隆，并通过IFN-ga_aELISA测量针对肽冲击的C1R-A03的来自CTL克隆的IFN-gamma生成。在用CDCAl-A03-9-219SEQIDN0:7a,CDCA1-A03-10-400SEQIDN0:38b,和CDCA1-A03-10-257SEQIDN0:47c刺激的CTL克隆中观察到强的IFN-gamma生成（图11。[0650]针对表达CDCAl和HLA-A*0301的靶细胞的特异性CTL活性[0651]研究针对CDCAl-A03-9-219SEQIDN0:7a和CDCA1-A03-10-400SEQIDNO:38⑻建立的CTL克隆识别表达⑶CAl和HLA-A*0301分子的靶细胞的能力。制备用全长的CDCAl和HLA-A*0301基因两者转染的C0S7细胞表达CDCAl和HLA-A*0301基因的靶细胞的特定模型）作为靶细胞。制备用全长CDCAl或HLA-A*0301转染的⑶S7细胞作为对照。000八1-A03-9-219SEQIDN0:7a或CDCA1-A03-10-400SEQIDN0:38b刺激的CTL克隆显示针对表达⑶CAl和HLA-A*0301两者的⑶S7细胞的强的CTL活性（图12。另一方面，针对对照没有检出显著的特异性CTL活性。这些数据清楚证明CDCAl-A03-9-219SEQIDN0:7和CDCA1-A03-10-400SEQIDN0:38是产生自CDCAl内源性加工的肽，并与HLA-A*0301分子呈递在靶细胞上，并被CTLs识别。这些结果表明了以下可能性，即CDCA1-A03-9-219SEQIDN0:7和CDCA1-A03-10-400SEQIDN0:38作为癌症疫苗用于患有表达CDCAl的癌症的患者可以是合适。[0652]抗原肽的同源性分析[0653]用CDCA1-A03-9-219SEQIDN0:7,CDCA卜A03-10-400SEQIDN0:38，或CDCA1-A03-10-257SEQIDN0:47刺激的CTLs显示出显著的特异性CTL活性。这些结果可能是因为CDCAl-A03-9-219SEQIDN0:7，CDCA1-A03-10-400SEQIDN0:38和CDCAl-A03-10-257SEQIDN0:47序列与衍生自已知敏化人免疫系统的其它分子的肽同源。为了排除此可能性，通过使用BLAST算法blast.ncbi.nlm.nih·govBlast.cgi查询这些肽的序列来进行同源性分析。这一结果显示出没有与CDCAl-A03-9-219SEQIDN0:7,CDCAl-A03-10-400SEQIDN0:38和CDCA1-A03-10-257SEQIDN0:47序列具有显著同源性的序列。因此，根据本发明人的知识，这些肽几乎不可能引发针对其他不相关分子的非预期免疫应答。总之，鉴定了新的⑶CAl衍生的HLA-A03限制性表位肽。证明了⑶CAl衍生的表位肽适用于癌症免疫治疗。[0654][实施例4][0655]乳液制剂的制备[0656]将肽溶解在注射用溶剂或无菌生理盐水中，使其为I.Omgml至10.0mgml，并收集到注射器中。这经由连接器连接至装有与注射溶剂或无菌生理盐水等量的IFA的注射器，然后通过交替地推动两个连接的注射器的注射器柱塞来混合。混合几分钟后，通过滴落试验法droptestmethod评价乳液的完成。滴落试验法可以通过将一滴混合样品滴在水上进行。当滴在水上的样品不立即在水中扩散时，评估乳液完成;并且当滴在水上的样品立即在水中扩散时，该乳液被评估为未完成。当乳液被评估为不完全时，进行进一步混合以完成乳液。可以通过皮下注射将完成的乳剂施用于癌症患者。经受施用的癌症患者可以选自受以下癌症影响的患者:膀胱癌，乳腺癌，宫颈癌，胆管细胞癌，慢性髓性白血病CML，食管癌，胃癌，非小细胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，前列腺癌，肾癌，小细胞肺癌，头颈部癌，软组织肿瘤，大肠癌等。[0657]冷冻干燥制剂的制备[0658]将肽溶解在注射用溶剂中，使其为1.0mgml至10.0mgml，并过滤灭菌。将其装入灭菌的小瓶中，并用无菌橡胶塞半封闭。将该小瓶冷冻干燥后，将其完全封闭并用铝盖缝合以产生冷冻干燥的制剂。当使用时，将注射溶剂或无菌生理盐水注入小瓶中以重新溶解冷冻干燥的粉末。使用注射器收集小瓶中的再溶解溶液，并且通过连接器将注射器与填充有与收集的再溶解溶液的量相同量的IFA的注射器连接。通过交替地推动两个连接的注射器的注射器柱塞来混合重新溶解的溶液和IFA。混合几分钟后，通过滴落试验法（droptestmethod评价乳液的完成。可以通过皮下注射将完成的乳剂施用于癌症患者。经受施用的癌症患者可以选自受以下癌症影响的患者:膀胱癌，乳腺癌，宫颈癌，胆管细胞癌，慢性髓性白血病CML，食管癌，胃癌，非小细胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，前列腺癌，肾癌，小细胞肺癌，头颈部癌，软组织肿瘤，大肠癌等。[0659]工业应用性[0660]本发明提供了CDCAl衍生的新型HLA-Al1限制性，HLA-A33限制性，和HLA-A03限制性表位肽，其诱导强而特异性的抗肿瘤免疫应答，并且因此具有广泛的癌症类型的可用性。本发明的肽，组合物，APCs和CTLs可用作针对表达CDCAl癌症的肽疫苗，例如膀胱癌，乳腺癌，宫颈癌，胆管细胞癌，慢性髓性白血病CML，食管癌，胃癌，非小细胞肺癌，淋巴瘤，骨肉瘤，前列腺癌，肾癌，小细胞肺癌，头颈部癌，软组织肿瘤，大肠癌。[0661]尽管本文详细地并且关于其具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，前述描述本质上是示例性和解释性的，而且意图例示本发明及其优选实施方案。经由常规实验，本领域技术人员会容易地认识到，可以对本发明进行各种变化和修饰，而不偏离本发明的精神和范围，本发明的边界和范围由所附权利要求来限定。

权利要求：1.具有细胞毒性T细胞CTL诱导能力的少于15个氨基酸的肽，其包含选自以下组的氨基酸序列：a选自下组的氨基酸序列：SEQIDNOs:3，5-7,9,10,12-14,17,19,21，30,35,38-40，45，53，56，58，27，60，28，67，69和47;以及b选自下组的氨基酸序列中取代、缺失、插入和或添加了一个、两个或数个氨基酸的氨基酸序列：SEQIDNOs:3，5-7，9，10，12-14，17，19，21，30，35，38-40，45，53，56，58，27，60,28,67,69和47。2.权利要求1的肽，其选自下组⑴至（iii:i包含氨基酸序列的肽，其中将选自下组a至d的一个或多个取代引入选自下组的氨基酸序列中：SEQIDNOs:3，5-7，9，10，12-14，17，19，21，30，35，38-40，45，53，56和58:a用选自由苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个氨基酸；b用选自由亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸和丙氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第三个氨基酸；c用选自由亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第七个氨基酸;和d用选自由赖氨酸和精氨酸组成的组的氨基酸取代C端的氨基酸；ii包含氨基酸序列的肽，其中将选自下组a至c的一个或多个取代引入选自下组的氨基酸序列中：SEQIDNOs:27,3,60,28,5,67和69:a用选自由天冬氨酸和谷氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第一个氨基酸；b用选自由苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个氨基酸；c用选自由精氨酸和赖氨酸组成的组的氨基酸取代C端的氨基酸;和iii包含氨基酸序列的肽，其中将选自下组a至b的一个或多个取代引入选自下组的氨基酸序列中：SEQIDNOs:7,38和47:a用选自由亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和苏氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个氨基酸;和b用选自由精氨酸、赖氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸组成的组的氨基酸取代C端的氨基酸。3.权利要求1的肽，其由选自下组的氨基酸序列组成：SEQIDN0s:3,5-7,9，10，12-14，17，19，21，30，35，38-40，45，53，56，58，27，60，28，67，69和47。4.多核苷酸，其编码权利要求1至3中任一项的肽。5.组合物，其包含药学上可接受的载体和选自下组a至e的至少一种成分：a—种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；b—种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1至3中任一项的肽；c抗原呈递细胞APC，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；d外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和eCTL，其靶向权利要求1至3中任一项的肽。6.权利要求5的组合物，其是用于诱导CTL的组合物，其中所述成分是选自下组（a至d的至少一种成分：a—种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；b—种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1至3中任一项的肽；c抗原呈递细胞APC，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物;和d外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物。7.权利要求5的组合物，其是药物组合物。8.权利要求7的组合物，其用于选自下组的一种或多种用途：（i癌症治疗，（ii癌症预防防范prophylaxis和iii手术后癌症复发的预防防范）。9.权利要求7的组合物，其用于诱导针对癌症的免疫应答。10.权利要求8或9的组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组:膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性髓性白血病CML、食管癌、胃癌、非小细胞肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌、小细胞肺癌、头颈癌、软组织肿瘤和大肠癌I11.权利要求5至10中任一项的组合物，其配制为用于对至少一种选自下组的HLA阳性的受试者施用:HLA-AlI、HLA-A33和HLA-A03。12.诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其包含选自下组的步骤：a体外、离体或体内将APC与权利要求1至3中任一项的肽接触;和b将编码权利要求1至3中任一项的肽的多核苷酸引入APC。13.诱导CTL的方法，其包含选自下组的步骤：a将CD8阳性T细胞与APC共培养，所述APC在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至3中任一项的肽的复合物；b将CD8阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至3中任一项的肽的复合物；c将多核苷酸引入CD8阳性T细胞，所述多核苷酸编码T细胞受体TCR的每个亚基，所述T细胞受体能够结合细胞表面上由HLA抗原呈递的权利要求1至3中任一项的肽。14.APC，其在其表面呈递HLA抗原与权利要求1至3中任一项的肽的复合物。15.权利要求14的APC，其通过权利要求12的方法诱导。16.CTL，其靶向权利要求1-3中任一项的肽。17.权利要求16的CTL，其通过权利要求13的方法诱导。18.诱导针对癌症的免疫应答方法，其包含向受试者施用选自下组a至（e的至少一种成分：a—种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；b—种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1至3中任一项的肽；c抗原呈递细胞APC，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；d外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和eCTL，其靶向权利要求1至3中任一项的肽。19.治疗和或预防癌症，和或预防其手术后复发的方法，所述方法包括向受试者施用选自下组a至e的至少一种成分：a—种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；b—种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1至3中任一项的肽；c抗原呈递细胞APC，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；d外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和eCTL，其靶向权利要求1至3中任一项的肽。20.抗体，其结合权利要求1至3中任一项的肽。21.筛选具有CTL诱导能力的肽的方法，其包含以下步骤：a产生由氨基酸序列组成的候选序列，其中对由选自下组的氨基酸序列组成的原始氨基酸序列取代、缺失、插入和或添加一个，两个或数个氨基酸残基:SEQIDNOs:3,5至7，9,10,12至14,17,19,21，30,35,38至40,45,53,56,58,27,60,28,67,69和47;b从在a中产生的候选序列中选择除CDCAl外的与任何已知的人基因产物不具有显著同源性序列同一性的候选序列；c将APC与由在b中选择的候选序列组成的肽接触；d将c的APC与CD8阳性T细胞接触;和e选择与由原始氨基酸序列组成的肽相比，具有相等或更高的CTL诱导能力的肽。22.乳剂，其包含一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽、水溶性载体和油佐剂。23.试剂盒，其包含容纳权利要求5至11中任一项的组合物的容器和容纳佐剂的容器。

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