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申请/专利权人：济南大学

摘要：本发明属于生物技术领域，具体涉及玉米锌指结合蛋白互作因子基因Actin及其重组表达载体和应用。该基因全长12712bp，为一个完整的表达框，有6个外显子构成，编码123个氨基酸，通过酵母中的表达检测，发现Zm‑Actin基因能与Zm‑ZnRing基因具有明显的相互调控作用，且两基因共定位在叶绿体中发挥作用。本发明公开的Actin基因具有提高外源基因翻译效率的功能，该锌指结合蛋白是具有E3泛素连接酶活性的，E3泛素连接酶参与植物盐胁迫响应过程中，控制膜运输及产生活性氧来调控细胞的生长代谢，该基因可应用于提高烟草叶片中活性氧的增加以调节细胞的生长代谢。

主权项：1.一种玉米锌指结合蛋白与基因Actin表达蛋白相互作用在提高植物叶片活性氧中的应用，其特征在于，所述玉米锌指结合蛋白核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述Actin基因核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；所述植物为烟草。

全文数据：玉米锌指结合蛋白互作因子基因Actin及其重组表达载体和应用技术领域本发明属于生物技术领域，具体涉及玉米锌指结合蛋白互作因子基因Actin及其重组表达载体和应用。背景技术很多RING型锌指蛋白蛋白质泛素化途径中催化终末过程的E3泛素化连接酶都含有RING结构域，这些RING型锌指蛋白主要是通过和其他蛋白质之间的相互作用，参与泛素化蛋白降解过泛素化蛋白降解过程会改变蛋白活性，影响生物效应，RING型锌指蛋白可能参与很多重要生物效应。RING型锌指蛋白基因也和盐胁迫息息相关。锌指结合蛋白也是具有E3泛素连接酶活性的，参与植物盐胁迫响应过程中，主要调控膜运输相关基因表达量，控制膜运输及产生活性氧来调控参与盐胁迫途径的。但RING型锌指蛋白研究主要集中在水稻与拟南芥中，在大豆、玉米等其他作物中研究较少，且与之互作的基因验证较少，在其应用上的研究更是少之又少，因此，将玉米锌指蛋白与基因Actin同时注射到烟草中发现两基因的互作位点在膜和胞质中，并测定活性氧的含量，进而发现两基因参与到膜运输中。植物基因互作后的信号传递激活了包括活性氧AOS:activeoxidespecies的生成和其它各类防卫反应。活性氧迸发oxidativeburst被认为是过敏反应HR:hypersensitiveresponse的特征性反应，也是植物对病原物应答的最早期反应之一。AOS作为与植物抗病性密切相关的因子，一直是人们关注的焦点。AOS主要由病原菌诱导产生,其中非亲和病菌诱导的AOS迸发强烈且持续时间长。植物在处于一些逆境stress条件下，例如：低温、紫外光，也能产生AOS。植物体内主要的AOS是：超氧阴离子O2-、过氧化氢H2O2、羟自由基OH-。它们之间可以相互转变，其中OH-极为活泼，能与有机化合物作用产生自由基链反应，氧化细胞质膜成分，使酶失活、核酸降解，从而导致细胞损坏，组织坏死，产生过敏反应。AOS具有抗微生物活性，能作为过氧化物酶的底物使细胞壁交联，强化细胞壁，参与过敏反应，与植保素生成有关，并作为信号分子参与诱导基因表达，使植物获得局部和系统抗性。植物具有完整的体系来调节活性氧的生成和积累，确保有效信号传导，这样既可使植物能抑制病菌的感染和再度侵入，又能使自身少受氧化胁迫。其清除AOS的体系主要是依靠超氧歧化酶SOD:surperoxidedismutase、过氧化氢酶CAT:catalase、过氧化物酶POX:peroxidase。另外植物体内两种极重要的抗氧化物抗坏血酸ASA:ascorbicacid、还原型谷胱甘肽GSH也参与AOS清除。AOS是目前关于植物抗病性研究的的热点，但由于AOS含量少、不稳定，造成了含量测定和组织定位困难，不同的组织部位往往需要不同的方法检测，而国内鲜见关于AOS检测方法研究的报道。发明内容基于现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于验证玉米锌指结合蛋白与Actin基因表达蛋白相互作用，并将互作位点在烟草叶片内进行定位，解决了两基因互作位点的精确定位。本发明的另一发明目的在于提供了含有玉米锌指结合蛋白基因与基因Actin的重组载体，能够高效表达玉米锌指蛋白基因；本发明的第三个目的在于提供玉米锌指结合蛋白与Actin基因表达蛋白互作条件下的的应用。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：（权利要求）玉米锌指蛋白基因和Actin基因的两个蛋白之间互作，所述玉米锌指结合蛋白核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述Actin基因核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。含有上述所述玉米锌指结合蛋白基因与基因Actin得重组表达载体。一种重组细胞，含有上述的重组载体。上述的玉米锌指结合蛋白与基因Actin表达蛋白相互作用调控膜运输基因表达量，在提高植物叶片活性氧中的应用。优选地，所述植物为烟草。有益效果本发明从玉米中克隆玉米锌指结合蛋白基Zm-ZnRing（GRMZM2G035341）和基因ActinZm-Actin（GRMZM2G152328），Zm-ZnRing基因全长12712bp，为一个完整的表达框，有6个外显子构成，编码123个氨基酸，Zm-Actin基因全长2531bp，为一个完整的表达框，有4个外显子构成，编码377个氨基酸，分别将两个基因序列构建到重组的表达载体，通过在烟草和酵母中的表达检测，发现Actin能显著提高报告基因Zm-ZnRing的表达安水平；因此本发明公开的Zm-Actin具有提高外源基因翻译效率的功能，该锌指结合蛋白基因Zm-ZnRing是具有E3泛素连接酶活性的，E3泛素连接酶参与植物盐胁迫响应过程中，主要调控膜运输相关基因表达量，控制膜运输及产生活性氧来调控细胞的生长代谢，该基因可应用于提高烟草叶片中活性氧的增加。附图说明图1：Zm-ZnRing凝胶电泳图图2：Zm-Actin凝胶电泳图图3：酵母双杂和双分子荧光互补实验验证图图4：互作组与对照组的活性氧含量比较图。图5：不同时间下活性氧浓度测定。具体实施方式下面结合附图，对发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1酵母双杂：1．酵母重组载体构建将锌指蛋白基因（GRMZM2G035341）和Actin基因（GRMZM2G152328）的基因全长在基因的起始位点（ATG）设计引物引入KpnI酶切位点，在3’末端引入PacI酶切位点，分别用PCR方法扩增出基因的全长cDNA，基因扩增使用的引物序列为：2328-FKpnI：CGGGGTACCATGGCCGATGCCGAGGATAT2328-RPacI；CCTTAATTAACGATGGATGGGCCGGACTCG5341-FKpnI：CGGGGTACCATGTCCGCCATGGAGACCGA5341-RPacI：CCTTAATTAACTAGTGGCCATATTTCTGGAACT将得到的扩增产物进行胶回收，测定浓度。载体和目的基因必须采用相同的酶切位点，然后用KpnI和PacI双酶切目的基因片段和载体，重新回收后。使用NEB的T4连接酶分别连入pGADT7和pGBKT7克隆载体，连接体系如下：CompotentVolumeμLddH2O9pGADT7pGBKT7载体2ZmNAC77基因片段4T4连接酶15xT4buffer4将上述反应液置于PCR仪16℃反应过夜，即可得到重组载体，用于酵母转化。2．酵母感受态的制备（1）20mlYPDA接种Y2Hgold单菌落，250rpm，30℃，摇菌16h；（2）50mlYPDA，接种约1ml，同时留1ml空白YPD使OD600调至0.2-0.3，置于30℃，250rpm振荡培养5h至OD600为0.5～0.6（大约108细胞ml）；（3）将菌液移至50ml无菌离心管中，1500rpm室温离心5min收获细胞，加入10ml无菌水重悬，1200rpm室温离心2min，弃上清；（4）再加入10ml无菌水重悬，1200rpm室温离心2min，弃上清；（5）加入1ml无菌水重悬，并转移至无菌的1.5mL离心管中,12000rpm室温离心1min,弃上清；（6）取1ml1xTELiAc重悬菌体,室温12000rpm室温离心1min,弃上清；（7）加入300ul1xTELiAc重悬菌体,即为感受态酵母细胞。3．酵母菌转化及阳性菌落筛选（1）取1mL2mgL的鲑精DNA置于金属浴95℃热浴5min,迅速置冰上冷却；（2）取50ulY2Hgold感受态细胞，加入5ul变性的鲑鱼精DNA，5ul构建好的质粒或对照载体，再加入500ul无菌1XPEGLiAC,轻轻混匀；（3）置于30℃培养箱，180rpm，振荡培养45-60min；（4）每管中加入50ulDMSO，轻轻混匀，42℃热击15min，；（5）冰浴2min，12000rpm，1min，弃上清，加入100-200ul1xTEBuffer重悬涂板，30℃培养3d，至菌落直径1mm即可；（6）阳性菌落筛选的方法参照2.3.1（4）大肠杆菌阳性菌落的筛选，得到阳性酵母菌落4．酵母阳性菌缺陷培养（1）缺陷型培养基的配制分别配制一缺、二缺、三缺、四缺培养基，培养基购买于TAKARA，配方如下：将配置好的培养基调PH值为5.8.置于高温高压灭菌锅中115℃，灭菌30min，待取出培养基后，导入培养皿，用于酵母培养。（2）酵母菌的缺陷培养1）酵母菌对照培养使用到的酵母菌体有：将上述阳性酵母菌体分别稀释1、10-1、10-2、10-3倍，并将所有菌液滴板至二缺、三缺、四缺培养基上，倒置平板，28℃培养箱培养3天。培养后观察各基因序列的生长情况，看该转录因子是否具有自激活活性。实施例2双分子荧光互补（BiFC）：1．载体构建（1）载体的构建1）构建载体采用的方式是同源重组，同源重组酶购买自全式金生物公司，设计将锌指蛋白基因（GRMZM2G035341）和Actin基因（GRMZM2G152328）的基因全长基因同源序列引物如下：BP-5341-F：GGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGCATGTCCGCCATGGAGACCGACABP-5341-R：GGGGACAACTTTGTACAAGAAAGTTGGGCAGTGGCCATATTTCTGGAACTCBP-2328-F：GGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGCATGGCCGATGCCGAGGATATBP-2328-R：GGGGACAACTTTGTACAAGAAAGTTGGGCATGGGCCGGACTCGAGGTCA2）以大肠杆菌锌指蛋白基因（GRMZM2G035341）和Actin基因（GRMZM2G152328）的T载体提取的质粒为模板，使用上述引物基因目的基因序列扩增，将PCR产物回收，并使用Nanodrop2000测定基因片段的浓度；3）配制目的基因与载体的重组反映体系如下：CompotentVolumeμLddH2O735S-eGFP载体5质粒3重组酶Mix5将以上反应液置于PCR仪，23℃反应6h，反应结束后将重组载体置于冰上，进行大肠杆菌的转化。（2）大肠杆菌感受态的制备1）大肠杆菌（E.coli）DH5α菌种用接种环在LB培养基平板上划线，37℃，培养过夜；2）挑取新鲜的单菌落接种到5MlLB液体培养基中，37℃，250rpm振荡培养过夜；3）稀释100倍，接种到50mLLB液体培养基中，37℃，250rpm培养3~5h至细菌生长对数期；4）将菌液转入50mL离心管中，放置在冰上10min；5）4℃，4000rpm，离心10min，弃上清；6）用50mL0.1MCaCl（24℃预冷）重悬细胞，4℃，4000rpm，离心10min，弃上清；7）向沉淀中加入25mL0.1MCaCl（24℃预冷），重悬沉淀，4℃，4000rpm，10min，弃上清；8）每管中加入2.5mL0.1MCaCl2（含15%甘油），重悬沉淀；9）分装至1.5mlEP离心管中，100μL管；10）保存到-70℃冰箱中，备用。（3）重组载体的转化1）冰上融化大肠杆菌感受态细胞；2）将连接产物加入感受态细胞中，约10μL重组载体加入至50μL感受态中轻轻旋转混匀，在冰上放置30min；3）在42℃的水浴中热激90sec，不要摇动，立即放回冰上冷却2min；4）加入600μLLB培养基，37℃，150rpm振荡培养60~90min；5）室温4000rpm离心5min，吸出部分LB培养基，剩余约200μL体积；6）将剩余液体和沉淀混匀，均匀涂布于含100mgmLSpec+抗性的LB培养基平板上；7）37℃倒置培养12~16h，直至出现菌落。（4）阳性菌落筛选及测序1）挑取单菌落于含有0.6mLLB（Spec+抗性）的1.5mL离心管中，37℃，220rpm震荡培养约6h；2）用通用引物T7SP6进行PCR扩增。取1μL菌液作为模板，退火温度为52℃。阳性克隆的PCR产物应在1kb左右；如果克隆为假阳性（载体自连），PCR产物片段约为300bp；3）挑取3个阳性菌落，送公司测序，挑选测序正确的菌株用于后序实验。（5）质粒的提取1）挑取含有载体质粒的大肠杆菌单菌落，在含有Spec+抗性的LB液体培养基中于37℃200rpm振荡过夜培养；2）将菌液倒于1.5mL离心管中，12000rpm离心1min，弃上清液，收集细菌沉淀；3）用移液器吸去上清，在管中加100μL预冷的SolutionI充分振荡，冰浴5min；4）加入200μL新配制的SolutionII（室温），盖紧管口，轻轻颠倒2~3次，使其混合均匀，不要剧烈振荡，冰浴放置不超过5min；5）加入150μL预冷的SolutionIII，充分混合，冰浴5min；4℃,12000rpm离心5min；6）将上清移至离心管中，加入等体积苯酚、氯仿（1:1）抽提，12000rpm离心5min,取上清；7）再用等体积苯酚、氯仿（1:1）抽提一次；转移上清至一新的离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放2h沉淀；8）4℃，12000rpm，离心15min弃上清，收集沉淀；用1mL70%乙醇洗沉淀2次；9）4℃，12000rpm，离心2min，吸干液体；室温干燥沉淀，50μLddH2O溶解沉淀，-20℃保存。（6）农杆菌感受态的制备1）农杆菌AH109菌种在含有100μgmLRif+的YEB平板划线，28℃培养36~48h至长出菌落；2）挑取单菌落接种于5mL含有100μgmLmLRif+的YEB液体培养基中，28℃，250rpm振荡培养16~24h；3）将0.5mL菌液转接于50mL含有50μgmLRif+的YEB液体培养基中，28℃，250rpm，振荡培养至对数期，OD600=0.5左右，约8~16h；4）将菌液转移至50mL离心管中，冰浴30min，5000rpm离心10min，沉淀细胞；5）加入10mL预冷的0.15MNacl，轻轻悬浮细胞，4℃，5000rpm离心5min，去上清；6）重复步骤（5）一次；7）用1mL预冷的含15%甘油的Cacl2重悬细胞，分装至1.5mL离心管中，100μL管，液氮中速冻，保存到-70℃，备用。（7）农杆菌转化及阳性菌落筛选1）取-70℃冻存的感受态细胞EHA105，冰上融化；加入5-10μl待转化质粒于50-100μl感受态中，轻轻混匀，冰浴30min；2）将离心管置于液氮中速冻1min，立即放入37℃，3min，3）立即加入800mlYEP培养基，混匀，28℃，180rpm振荡培养3h；4）室温下5000rpm离心1min，沉淀细胞；5）吸去多余的培养基，保留约200μL涂布于YEB（含100mgL利福平，50mgL卡那霉素）平板；6）28℃倒置培养2天，直至菌落出现7）阳性菌落筛选的方法1）挑取多个白色单克隆分别10μL无菌水中，涡旋混匀；2）取1μL混合液于20μLPCR体系中，使用下列引物鉴定阳性克隆；引物序列：5341-F：ATGTCCGCCATGGAGACCGACA5341-R：AGTGGCCATATTTCTGGAACTC2328-F：ATGGCCGATGCCGAGGATAT2328-R：ATGGGCCGGACTCGAGGTCAPCR反应体系：CompotentVolumeμLddH2O1325×EasyTaqPCRSuperMix10M13F10μM1M13R10μM1上述混合液2PCR反应完成后，经琼指糖凝胶电泳验证，筛选出阳性菌落。得到阳性菌落2．农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞（1）试剂准备渗透液（50ml）：250mg葡萄糖，5mlMES原液，5mlNa3PO4.12H20原液，5μL乙酰丁香酮原液，加ddH2O至50ml。1）500mMMES（sigma）:4.88g溶于50mlddH2O，保存于4℃2）20mMNa3PO4.12H20（BDH）:0.38g溶于50mlddH2O，保存于4℃3）1M乙酰丁香酮：0.196g，加DMSO至1ml，可分装成小剂量，存于-20℃（2）实验步骤1）将含有重组质粒的GRMZM2G035341）和Actin基因（GRMZM2G152328）农杆菌菌液加入到无菌的20mlRif+和Spec+二抗的液体YEP培养基中，28℃，200rpm，过夜扩摇培养；2）取1-1.5ml菌液，加入到无菌的50mlRif+和Spec+二抗的液体YEP培养基中，28℃，200rpm培养，待OD600=1.2时取出；注：如果悬浮液的OD600值在1.5-2.0之间，说明有大量的死菌细胞，将降低转化效率。3）将菌液转移至50ml离心管中，10000rpm，10min，沉淀菌体（室温），弃上清，加入上述渗透液，悬浮菌体；4）去少量悬浮液稀释10倍，测定OD600,并乘以10，作为悬浮菌液的OD600值6）确定含有重组质粒的GRMZM2G035341）和Actin基因（GRMZM2G152328）农杆菌菌液等体积混合悬浮菌液对渗透液的滴定度，计算稀释系数，使得最终悬浮菌液（用于侵染）为0.5-5ml，OD600为0.01-0.1，通常0.5-1ml的最终悬浮菌液就能满足侵染了；例如：需要OD600=0.1的500μL最终悬浮菌液，而测定的悬浮菌液的OD600=0.4，则最终悬浮菌液中，悬浮菌液的用量为（0.1*500）0.4=125Μl,则需要渗透液为375μL。7）在50ml离心管中，配好最终悬浮菌液，准备侵染；8）侵染前，将烟草放于白色荧光灯下1h，使气孔张开；9）选择倒三叶和倒四叶，用于侵染（于两叶脉之间侵染），一株选两叶，侵染一种菌液用去掉针头的注射器，轻柔地摩擦待转叶片的背部（0.5cm2），使用小针头刺穿，以去除其蜡质层；10）侵染前，用标签纸标记待转叶片；11）将第7步中的最终悬浮菌液吸入1ml去针头的注射器中，将注射器对着叶片背部的待转区域，一手按着叶片上面，另一只手轻轻推动活塞，直到看到液体扩散，再侵染其他部位，侵染后，用记号笔圈定侵染区域12）将侵染后的烟草浇足水，黑暗放置24h，然后放回到培养室生长2-3天后，进行亚细胞定位试验；13）切掉侵染区域，制片，荧光显微镜观察，得到双分子荧光互补电镜图片。实施例3活性氧的测定细胞色素C法细胞色素C最早时用来检测动物细胞的O2-，该检测方法是基于O2-可将氧化型细胞色素C还原成还原型细胞色素C，后者在550nm有最大光吸收。把含有重组载体的菌液注射到烟草叶片生长三天后浸到含20μmo1L细胞色素C的磷酸盐缓冲液pH7.8中，每2min取样一次,测定反应液的OD550，在10分钟内OD550的增加量呈线性，由此可以计算出O2-的含量。细胞色素C是分子量为12.5kD的蛋白质，像这样大分子的底物的移动、穿透植物壁的能力会受到限制，所以可以用细胞色素C还可对O2-进行定位测定。通过图4发现互作组比对照组的活性氧含量有所增加。序列表济南大学玉米锌指结合蛋白互作因子基因Actin及其重组表达载体和应用16SIPOSequenceListing1.01372DNA玉米2AmbystomalateralexAmbystomajeffersonianum1atgtccgccatggagaccgacatcaacgcgccgccgcccgccccagccggcgagggatcc60tccgtggtcggtccgtcctcctcatcctcccgcaagcccaacaagcgcttcgagatcaag120aagtggaacgccgtcgcgctctgggcatgggatatcgtcgtcgacaactgcgccatctgc180cgcaaccacatcatggatctatgcatcgagtgccaggcgaaccaagctagcgcgaccagc240gaggagtgcactgtcgcttggggtgtctgtaatcatgcttttcacttccactgcatcagc300aggtggcttaagactcgccaagtgtgcccattagataacagtgagtgggagttccagaaa360tatggccactag3722123PRT玉米2AmbystomalateralexAmbystomajeffersonianum2MetSerAlaMetGluThrAspIleAsnAlaProProProAlaProAla151015GlyGluGlySerSerValValGlyProSerSerSerSerSerArgLys202530ProAsnLysArgPheGluIleLysLysTrpAsnAlaValAlaLeuTrp354045AlaTrpAspIleValValAspAsnCysAlaIleCysArgAsnHisIle505560MetAspLeuCysIleGluCysGlnAlaAsnGlnAlaSerAlaThrSer65707580GluGluCysThrValAlaTrpGlyValCysAsnHisAlaPheHisPhe859095HisCysIleSerArgTrpLeuLysThrArgGlnValCysProLeuAsp100105110AsnSerGluTrpGluPheGlnLysTyrGlyHis11512031054DNA玉米2AmbystomalateralexAmbystomajeffersonianum3atggccgatgccgaggatatccagcccctcgccgtcttccccagcatcgtggggcgcccg60cgccacactggtgtcatggtcgggatggggcagaaggacgcctacgtcggtgacgaggcg120cagtccaagaggggtatcctgaccctcaagtaccccatcgagcacgggatcgtcagcaac180tgggacgacatggagaagatctggcatcacaccttctacaacgagctccgcgtggctccc240gaggagcaccccgtcctcctcaccgaggcgcccctgaaccccaaggctaacagggagaag300atgacccagatcatgttcgagaccttcaacaccccggctatgtacgtcgccatccaggcc360gtgctctctctgtatgccagtggccgtaccacaggtatcgtgctcgactcgggagatggt420gtgagccacaccgtccccatctacgagggatacgccctcccccacgccatccttcgtctt480gacctggccggtcgcgacctcaccgactacctgatgaagatcctgactgagcgcggctac540tccttcaccaccaccgctgagcgggaaatcgtgagggacatgaaggagaagctcgcctac600atcgccctggactacgaccaggagatggagaccgccaagaccagctcttccgtggagaag660agctacgagctccccgacggacaggtgatcaccatcggcgccgagcgcttccgctgcccc720gaggtcctcttccagccatccttcatcgggatggaagctgccggcatccacgagaccacc780tacaactccatcatgaagtgcgacgtggatattaggaaggatctgtacggcaacatcgtc840ctctccggtggcaccaccatgttccctgggatcgctgacaggatgagcaaggagatcact900gccttggctcccagcagcatgaagatcaaggtggtcgctcctccagagaggaagtacagt960gtctggatcggaggatccatcctggcatccctcagcaccttccagcagatgtggatcgcc1020aaggccgagtacgacgagtccggcccatccatcg10544377PRT玉米2AmbystomalateralexAmby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权利要求：1.玉米锌指蛋白基因和Actin基因的两个蛋白之间互作，其特征在于，所述玉米锌指结合蛋白核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述Actin基因核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。2.含有权利要求1所述玉米锌指结合蛋白基因与基因Actin的重组表达载体。3.一种重组细胞，含有权利要求2所述的重组载体。4.权利要求1所述的玉米锌指结合蛋白与基因Actin表达蛋白相互作用调控膜运输基因表达量，在提高植物叶片活性氧中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物为烟草。

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