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申请/专利权人：安徽农业大学;安徽省动物疫病预防与控制中心;安徽省兽药饲料监察所

摘要：本发明涉及病毒检测技术领域，且公开了一种PPV检测的crRNA引物对、CRISPRCas12a系统及应用方法，包括以下步骤：S1、组织样品的处理：将称取约1g的各组织样品，加入1mLPBS后放入研磨钵中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以12000rpmmin离心3min；S2、病毒核酸的提取：使用某生化科技有限公司的病毒基因组DNARNA提取试剂盒对病毒进行核酸提取；S3、引物设计：在GenBank中检索猪细小病毒全基因组GenBankID:NC_001718.1，通过Meglign软件分析比对，确定猪细小病毒全基因组中高度保守片段为VP2基因，使用PrimerPremier5软件，设计VP2基因的全长引物，根据猪细小病毒全基因组中高度保守片段VP2基因，使用CRISPR‑DT网站中Cpf1引物设计软件设计猪细小病毒VP2基因的crRNA引物，并委托某生物公司合成生产。

主权项：1.一种PPV检测的crRNA引物对、CRISPRCas12a系统及应用方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、组织样品的处理：将称取约1g的各组织样品，加入1mLPBS后放入研磨钵中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以12000rpmmin离心3min；S2、病毒核酸的提取：使用某生化科技有限公司的病毒基因组DNARNA提取试剂盒对病毒进行核酸提取；S3、引物设计：在GenBank中检索猪细小病毒全基因组，通过Meglign软件分析比对，确定猪细小病毒全基因组中高度保守片段为VP2基因，使用PrimerPremier5软件，设计VP2基因的全长引物，根据猪细小病毒全基因组中高度保守片段VP2基因，使用CRISPR-DT网站中Cpf1引物设计软件设计猪细小病毒VP2基因的crRNA引物，并委托某生物公司合成生产；S4、PCR扩增：根据猪细小病毒VP2基因全长片段，使用PrimerPremier5软件设计全长引物，进行PCR扩增，扩增片段为1658bp；S5、PCR产物回收及纯化：根据SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书提取步骤操作，把扩增产物回收备用；S6、标准质粒的构建：根据TaKaRa公司的pMDTM19TVectorCloningKit使用说明书，构建pMDTM19T-VP2重组质粒；S7、重组质粒鉴定：取部分培养菌液，委托某生物公司进行测序服务，并在NCBI网站的BLAST功能和Meglign软件与VP2基因全长进行比对分析；S8、质粒DNA小量抽提：根据SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒使用说明书，提取构建的pMDTM19T-VP2重组质粒备用；S9、crRNA纯化S91、双链DNA的合成：将上述合成的crRNA单链退火成双链，反应体系为50μL，95℃退火5min，自然冷却至室温；S92、转录：将退火得到的双链进行转录，转录体系如下，转录所需DNA模板的用量应在0.1-1μg，轻轻混匀各组分，短暂离心，PCR仪37℃孵育2h，程序结束后，加入1μL的DNaseⅠ，37℃水浴消化15min，去除模板DNA；S93、crRNA纯化：将转录产物进行纯化；S10、猪细小病毒CRISPRCas12a可视化体系建立：对设计的四对猪细小病毒crRNA引物进行筛选，对比结果；S11、灵敏度试验：测量出重组质粒浓度，根据拷贝数浓度copiesμL＝[6.02×1023×浓度ngμL×10-9][DNA长度×660]公式，计算拷贝数浓度，以10倍浓度倍比稀释VP2基因重组质粒pMDTM19T-VP2，稀释浓度为3.75×100copiesμL、3.75×101copiesμL、3.75×102copiesμL、3.75×103copiesμL、3.75×104copiesμL、3.75×105copiesμL、3.75×106copiesμL、3.75×107copiesμL、3.75×108copiesμL、3.75×109copiesμL并使用灭菌水ddH2O作为实验的阴性对照，反应体系使用本实验建立的体系进行灵敏度验证并将扩增产物在紫外灯下进行观察；S12、特异性试验：使用猪流行性腹泻病毒，猪瘟疫苗病毒，猪蓝耳疫苗病毒，猪伪狂犬病毒，猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的核酸为模板，阴性和阳性对照分别使用ddH2O和PPV的阳性样本，验证该方法的特异性并将扩增产物在紫外灯下进行观察。

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