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申请/专利权人：中山大学

摘要：本发明公开了一种减少CRISPRCas9脱靶效应的方法，CRISPRCas9体系中的sgRNA通过Spacer部分20bp长度的碱基通过互补配对形成RNA‑DNAduplex识别靶向DNA序列，结合了sgRNA的Cas9蛋白沿着DNA双链搜寻NGG时，RNA‑DNA会形成一个类似“R‑loop”的结构，并从1位碱基开始配对，通过调控“Stem”部分长度可以影响sgRNA活性，根据不同的序列选择适当的长度，使其依旧保持sgRNA的靶向功能，再与不改造的sgRNA对比，观察有无改善脱靶效应；本发明通过与spacer部分形成碱基互补配对结构，通过在sgRNA的5’‑端引入发卡结构，构建了具有降低脱靶效应的Hairpin‑sgRNA，针对任何特定靶向序列，通过优化stem部分配对碱基的个数找到在不影响在靶能力的前提下能有效改善脱靶的Hairpin‑sgRNA序列，为CRISPRCas9体系解决普遍存在的脱靶现象提供了新的思路。

主权项：1.一种减少CRISPRCas9脱靶效应的方法，其特征在于，其方法包括如下步骤：1CRISPRCas9体系中的sgRNA通过Spacer部分20bp长度的碱基通过互补配对形成RNA-DNAduplex识别靶向DNA序列；2结合了sgRNA的Cas9蛋白沿着DNA双链搜寻NGG时，RNA-DNA会形成一个类似“R-loop”的结构，并从1位碱基开始配对；2.1配对成功则沿着链一直配对至20bp，完全互补配对后则会形成稳定的RNA-DNAduplex进而激活Cas9的HNH和RuvC核酸酶结构域；2.2如果中间出现碱基不匹配的情况，RNA-DNAduplex将解离，而sgRNA-Cas9蛋白复合物会继续寻找下一个PAM位点，直至找到正确的靶点配对成功。3通过调控“Stem”部分长度可以影响sgRNA活性，根据不同的序列选择适当的长度，使其依旧保持sgRNA的靶向功能，再与不改造的sgRNA对比，观察有无改善脱靶效应；4将200ng的含EGFP基因的质粒与50nMsgRNA、50nMCas9酶在1×Cas9bTffer中37℃孵育30min，加入1μLProteinaseK继续孵育10min以消化Cas9蛋白，加入DNAloadingbuffer后将反应溶液加入到制备好的1％琼脂糖凝胶中，在1×TAE缓冲液中室温140V恒压电泳30min，取出放入凝胶成像仪观察质粒切割情况；5转录stem-4bp-stem-20bp的十二条sgRNA，纯化后通过含7M尿素的6％聚丙烯酰胺凝胶确认sgRNA的纯度；6对胶图上的条带分别进行定量，通过在sgRNA的5’-端延伸使其形成分子内发卡结构，sgRNA与靶向DNA配对时形成RNA-DNAduplex与hairpin-sgRNA存在相互竞争关系；6.1当配对数较少时，随着RNA-DNAduplex从sgRNA的20位碱基开始延伸，hairpin-sgRNA的loop结构被打开，最终20bp的RNA-DNAduplex完全形成，激活Cas9酶，此时stem部分序列变成单链RNA游离在RNA-DNAduplex之外；6.2如果配对数增多，已经形成的RNA-DNAduplex稳定性不足以将hairpin-sgRNA的loop结构打开，那么20bp的完整RNA-DNAduplex将不能形成，无法激活Cas9。7在细胞内，CRISPRCas9的脱靶序列是通过计算机模拟计算出来的，再通过对潜在脱靶位置进行测序对比control组和实验组，即可确定实验体系是否存在脱靶效应，以及各位点脱靶的频率，在体外通过分子克隆对相应的靶标序列做定点突变，即可得到带有不同靶向序列的质粒；8使用双质粒系统，一个质粒以U6作为启动子表达sgRNA，另一个质粒则依靠CMV作为启动子表达Cas9蛋白，按一定比例同时转入两个质粒；9通过分子克隆，将靶向相关序列的sgRNA及改造的hairpin-sgRNA均克隆在质粒pSLQ1651-sgTelomereF+EAddgene，#51024，对于hairpin-sgRNA，根据体外实验的结果，设计不同配对长度的stem-4bp-stem-12bp的sgRNA；10选择了两对引物对靶标序列进行扩增，首先测试不同温度条件下引物扩增的特异性；11用EMX1-primer1分别扩增转录不同sgRNA的实验组，包括NC组，PC组和sgEMX1-stem-5bp6bp7bp8bp10bp11bp12bp，共九组样品；12通过测序的方法确定的脱靶最多的两个位置，筛选出合适的引物及退火温度后，对九个实验组的gDNA分别进行PCR扩增；13将回收的PCR产物用于T7E1assay实验，分析在靶实验切割条带检测，再选择两个靶向VEGFA的位点，同时各选一个脱靶率最高的位置进行PCR扩增研究；14通过与spacer部分形成碱基互补配对结构，通过在sgRNA的5’-端引入发卡结构，构建了具有降低脱靶效应的Hairpin-sgRNA。

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