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申请/专利权人：广州赛佰澳生物医药科技有限公司

摘要：本发明涉及一种HVEM蛋白作为药物在治疗与肝损伤相关的疾病中的应用，该HVEM蛋白具有序列表中SEQIDNO.1第1位到202位所示的氨基酸序列，其在治疗与肝损伤相关的疾病药物的各种剂型中至少包含有该HVEM蛋白。本发明利用HVEM表达载体实现体外高表达HVEM蛋白，并通过HVEM免疫共刺激分子的信号网络，在急性肝炎和肝衰竭中发挥降低肝细胞凋亡和坏死以减轻肝组织损伤，并减缓体内的炎症反应，以达到抗炎保肝的作用。

主权项：1.HVEM的融合蛋白在制备治疗与肝损伤相关疾病的药物中的应用，其特征在于所述HVEM的融合蛋白是指HVEM蛋白的膜外段与人IgG的Fc段组成的可溶性的融合蛋白，且所述HVEM蛋白的膜外段具有序列表SEQIDNO.1中第1位到第202位所示氨基酸序列，所述与肝损伤相关的疾病包括病毒性肝炎、肝纤维化和肝衰竭。

全文数据：HVEM蛋白作为药物在治疗与肝损伤相关的疾病中的应用技术领域[0001]本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及HVEM蛋白作为药物在治疗与肝损伤相关的疾病中的应用。背景技术[0002]肝病是常见病和多发病，通常肝病包括病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝炎、药物性肝损伤、脂肪肝、肝硬化、肝衰竭和肝癌等几大类。中国是病毒性肝炎的高流行区。全世界约有3亿人感染乙型肝炎病毒HBV而中国就有约1.2亿人，受HBV感染的人群罹患原发性肝癌的相对危险性至少增加300倍。病毒性肝炎一直是最广泛、最常见导致肝脏疾病的原因，也是我国当前流行最广泛、危害性最严重的一种传染性疾病。[0003]现在，对病毒性肝炎的治疗主要由以下5类药物：核甘类似物、干扰素、免疫调节剂、中草药和联合用药。这些药物治疗方法都涉及到了抑制肝炎病毒在体内的复制而发挥抗病毒的作用，目前在临床应用上发展迅速，己成为治疗病毒性肝炎的主要手段。尽管如此，几个主要的缺点也是不可忽略的，除了耐药现象越来越突出外，最主要的是忽略了对降低病毒性肝炎中肝细胞凋亡和减轻肝组织损伤，抑制体内免疫应答的过度活化的治疗。随着人们生活水平的提高，酒精肝和脂肪肝等“富贵病”发病率逐年提高，患病人数甚至己经超过乙肝患者。我国的总体非酒精性脂肪肝的发病率约15%左右，一线城市已经接近西方发达国家达20%〜30%，重度肥胖者的脂肪肝发病率高达61%〜94%。据此推算，我国目前有脂肪肝病人群至少有2亿人，未来由脂肪肝病人转化为肝纤维化和肝硬化的人数约在400〜800万。[0004]研宄发现不论肝炎的初始病因如何，炎症和免疫介导的肝细胞损伤是这些疾病的病理过程中共同的必经过程，也关系到疾病严重程度与预后。对于炎症或免疫介导的肝细胞损伤，目前认为其治疗关键在于调节免疫功能。[0005]HVEM是LIGHT肿瘤坏死因子超家族成员14的受体。研究发现，LIGHT属于肿瘤坏死因子配体家族，选择性的表达在T细胞、NK细胞、粒细胞、单核细胞和DC上，和其相应的受体结合具有诱导细胞凋亡及活化NF-kB信号的作用。进一步研究发现，LIGHT在气管炎、非酒精性脂肪肝和急性自身免疫性肝炎的动物模型中是重要的炎症因子，参与体内的炎症反应。在小鼠肝脏中浸润的免疫细胞过表达LIGHT，同时LIGHT在肝细胞凋亡中也具有重要的作用。最重要的是在乙肝和非酒精性脂肪肝病人的血清中，LIGHT的表达水平明显增高。而在气管炎动物模型中还发现阻断LIGHT的信号能下调TGF-f3和IL-13水平。在ConA诱导的急性肝炎模型中，阻断LIGHT能下调TNF-a和IFN-Y的水平。这些研宄都表明以LIGHT在肝炎中的潜在关键作用。经实验研宄，TLR3诱导的急性病毒性肝炎模型上表明LIGHT在mRNA和蛋白表达水平都上调。同时阻断LIGHT信号通路后表现出明显减缓肝脏损伤的作用。这说明，LIGHT是治疗病毒性肝炎和肝衰竭的靶点。而HVEM作为LIGHT的受体，除了可以特异性地阻断LIGHT的信号外，还可以作为一个配体和它的抑制性受体BTLA和CD160结合诱导免疫负调控。HVEM不仅可以阻断LIGHT下游诱导凋亡的信号，同时也减缓了体内炎症因子的产生，从而缓解体内肝脏的损伤。[0006]目前尚无以LIGHT作为靶点在急性肝炎和肝衰竭治疗中的其他报道，更没有发现利用HVEM阻断LIGHT信号对肝炎和肝衰竭进行治疗的研究报道。发明内容[0007]本发明所要解决的技术问题是提供一种HVEM蛋白作为药物在治疗与肝损伤相关的疾病中的应用。[0008]为解决上述问题，本发明所述的HVEM蛋白作为药物在治疗与肝损伤相关的疾病中的应用，其特征在于:该HVEM蛋白具有序列表中SEQIDNO.1第1位到202位所示的氨基酸序列，其在治疗与肝损伤相关的疾病药物的各种剂型中至少包含有该HVEM蛋白。[0009]所述HVEM蛋白采用HVEM的膜外段与人IgG的Fc段组成可溶性的融合蛋白代替;所述HVEM的膜外段与人IgG的Fc段具有序列表中SEQIDN0.2第1位到434位所示的氨基酸序列。[0010]所述与肝损伤相关的疾病包括病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝炎、药物性肝损伤、脂肪肝、肝纤维化和肝衰竭。本发明与现有技术相比具有以下优点：1、本发明利用HVEM表达载体实现体外高表达HVEM蛋白，并通过HVEM免疫共刺激分子的信号网络，在急性肝炎和肝衰竭中发挥降低肝细胞凋亡和坏死以减轻肝组织损伤，并减缓体内的炎症反应，以达到抗炎保肝的作用。[0012]2、本发明利用ConA诱导的小鼠肝损伤模型和PolyI:CD_GalN诱导的小鼠肝炎模型，研宄了HVEM重组蛋白对在ConA或者PolyI:CD-GalN致死剂量下小鼠存活率、亚致死剂量诱导的小鼠血清ALTAST升高的抑制作用，通过肝脏形态观察、肝组织病理学、肝细胞凋亡和肝脏炎症反应的分析，发现HVEM重组蛋白可提高ConA和PolyI:CD-GalN致死剂量下小鼠的存活率到70%，没有经过HVEM蛋白治疗组小鼠100%死亡。HVEM蛋白显降低ConA或者PolyI:CD-GalN诱导的肝炎小鼠血清中ALT和ASTP0.01，明显抑制减轻炎症反应及由此引发肝脏病变、肝细胞坏死和凋亡。[0013]【药理实验及结果证明】⑴实验用小鼠为SPF级BALBC小鼠，6〜8周龄，雌性，体重18〜22g，饲养环境严格按照SPF级执行。[0014]⑵小鼠急性病毒性肝炎模型建立：将小鼠至于高温环境，使尾静脉扩张;注射前用75%乙醇擦拭小鼠尾部，将300ul1.5ug剂量的polyI:C液体无热源经尾静脉匀速注射入小鼠体内，然后同时将200ul10mg剂量的D-GalN液体无热原经腹腔匀速注射入小鼠体内，小鼠于SPF环境中继续饲养。[0015]成功经尾静脉注射polya:〇和腹腔注射D-GalN后，在8h、16h、24h时间点，通过采血针在小鼠颌下静脉窦采血，检测血清谷丙转氨酶ALT。24小时后处死小鼠，解剖后，将小鼠的肝、脾取出，一部分存于-80*3备用，一部分用福尔马林固定。[0016]通过Real-TimePCR和westernblot检测病毒性肝炎模型中，HVEM的配体LIGHTmRNA和蛋白水平的表达。通过肝组织切片HE染色检测肝组织损伤和TUNEL染色检测肝内细胞的凋亡。[0017]结果显示：同时尾静脉注射poly1:0和腹腔注射D-GalN给药之后，小鼠血清的ALT在8h后已经上升，在16h时达到最高，24h相对下降。肝脏组织切片HE染色显示大面积的损伤坏死。以上结果显示:小鼠急性病毒性肝炎模型建立成功参见图3。[0018]同时Real-TimePCR和westernblot结果显示HVEM的配体LIGHT的表达出现显著上调，表示LIGHT诱导的细胞凋亡和炎症因子上调在病毒性肝炎模型中具有重要的作用，也表示HVEM信号网络在病毒性肝炎中的作用参见图4。[0019]⑶人HVEM蛋白对小鼠急性病毒性肝炎的治疗：①设立正常BALBC小鼠对照组生理盐水对照组），人HVEM蛋白给药剂量的对照组，急性病毒性肝炎模型组，模型建立前lh应用人HVEM蛋白治疗组。每组小鼠为6只，实验均重复3次。[0020]正常BALBc小鼠对照组尾静脉注射生理盐水300ul，人HVEM蛋白对照组尾静脉注射人HVEM蛋白100ug，急性病毒性肝炎模型组是尾静脉注射polyI:C浓度5ugml300ul和腹腔注射D-GalN浓度50mgml200ul，模型前lh应用人HVEM蛋白治疗组是先尾静脉注射100叫人出^1蛋白，比后同时尾静脉注射?〇171:〇浓度5叫1111300111和腹腔注射0-0£^浓度50mgml200ul。[0021]②颂下静脉窦采血：分别在模型建立的8h、16h、24h时间点用0.45mm的采血针在小鼠颌下静脉窦采血0.2〜0•5ml，37度lh后，3000rmp，lOmin，分离血清，-20°保存，分别进行血清中ALT的检测、LIGHTmRNA蛋白水平的检测、HE检测肝组织损伤和TUNEL检测肝内细胞的凋亡。[0022]③处死小鼠：在模型建立24h，将小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼处死。分别取小鼠的肝脏和脾脏，一部分存于-80°备用，一部分用福尔马林固定备用。[0023]④血清中谷丙转氨酶ALT测定：用谷丙转氨酶GPTALT测试盒单试剂，IFCC推荐方法，南京建成），通过连续监测法，用紫外分光光度计监测样品0D值在每分钟的变化，计算血清中ALT的酶活水平。[0024]⑤肝脏HE染色观察组织病理变化：将各组小鼠肝脏组织在福尔马林中固定后，组织梯度酒精脱水处理后，石蜡包埋，制作5um的石蜡切片1二甲苯115min脱赌；2二甲苯215min脱蜡；3无水乙醇15min;4无水乙醇25min;595%乙醇15111；[11;695%乙醇25111；[11;790%乙醇51^11;88%乙醇5111；[11;970%乙醇5111；1_11;10蒸馈水1〜3min;11苏木精15min;1¾流水冲洗lmin中，冲洗掉苏木精浮色；131%盐酸-乙醇分化用70%乙醇配置）1〜3s，看到片子变红；14流水冲洗15min;15反蓝。NaHC03中30s〜ltnin;16蒸馏水洗lmin;171%伊红染色3min;18蒸馈水漂洗掉伊红；1970%乙醇51^11;2080%乙醇511^11;2190%乙醇5111；1_11;2295%乙醇15111让；2395%乙醇251^11;24100%乙醇15min;25100%乙醇25min;26二甲苯15min;27二甲苯25min;28中性树脂封片。[0025]⑥TUNELTdT-mediateddUTPNick_EndLabeling荧光染色原位检测肝组织细胞凋亡情况：_利用TUNNEL标记试剂盒，分别将各组小鼠肝脏组织石蜡包埋切片进行TUNEL染色，用荧光显微镜观察肝组织细胞的凋亡情况。[0026]⑷结果显示：①血清中ALT水平参见图6:模型组中，8h时血清中ALT酶活己经升高；16h时ALT达到峰值;24h时ALT的水平有所降低。[0027]人HVEM蛋白治疗组：以上时间点，血清中ALT的水平显著低于模型组。[0028]而人的HVEM蛋白对照组、生理盐水对照组与正常小鼠无显著差异。[0029]②肝脏组织切片HE染色检测组织损伤参见图7:模型组中表现为明显的组织局部坏死，肝细胞成空泡样变。[0030]人HVEM蛋白治疗组和模型组有显著的差异，无明显的组织坏死表现和肝细胞形态变化。[0031]而人蛋白对照组和正常小鼠对照组没有显著差异。[0032]③肝脏组织切片TUNEL染色检测细胞凋亡参见图8:模型组中表现为明显的肝细胞凋亡。[0033]人HVHM蛋白提前治疗组肝细胞的凋亡显著低于模型组。[0034]人HVEM蛋白治疗组可以显著降低肝组织细胞的倜亡。[0035]而人HVEM蛋白对照组和正常小鼠对照组无明显差异。[0036]⑸人HVffl蛋白对小鼠急性病毒性肝炎的治疗作用HVEM重组蛋白对在ConA或者Po1yI:CD-GalN致死剂量下小鼠存活率的提升作用，HVEM重组蛋白可提高ConA和PolyI:CD-GalN致死剂量下小鼠的存活率到70%，没有经过HVEM蛋白治疗组小鼠100%死亡（图5、图9。[0037]⑹结论：人HVEM蛋白可明显减轻急性肝炎小鼠的肝脏损伤，具体表现在血清中AL頂每活水平显著降低，肝脏病理切片组织损伤降低，肝细胞凋亡显著降低。同时结果也表明人HVEM蛋白无任何毒副作用。因此人HVEM蛋白将在治疗急性肝炎和肝衰竭的药物中有很大的应用价值，具有极其广阔的开发应用前景。[0038]3、本发明通过HVEM蛋白的免疫阻断和抑制肝损伤作用，使得HVEM重组蛋白成为一个具有非常广阔前景的肝炎和肝衰竭治疗新药。附图说明[0039]下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。[0040]图1为本发明人HVEM基因pET-28a表达载体测序图谱，箭头所指为HVEM序列。其中：A为PCR扩增PBMC细胞HVEM基因片M-Maker，l-HVfflPCR产物）；B为菌落PCR挑选阳性克隆M-Maker，1至9为挑选的单克隆菌落PCR产物）。[0041]图2为本发明人HVEM蛋白表达高产菌株的筛选，蛋白表达纯化后的鉴定结果。其中:A为考马斯亮蓝染色（1-全菌，2-上清，3-20mM咪唑洗脱液，4-100mM咪唑洗脱液，5-250mM咪唑洗脱液，6-500mM咪唑洗脱液，M-Maker;B为westernblot〇[OO42]图3为polyI:C和D-GalN诱导小鼠急性肝炎模型后血清中ALT检测。其中:A为小鼠血清中ALT水平;B为小鼠肝脏组织切片HE染色。[0043]图4为本发明在小鼠肝脏中LIGHTmRNA水平表达和蛋白westernblot检测水平。其中:A为LIGHT在mRNA水平的表达;B为LIGHT在蛋白水平的表达。[0044]图5为本发明给药致死剂量的polyI:C和D-GalN诱导小鼠急性肝炎模型，HVEM蛋白阻断LIGHT后动物生存曲线。[0045]图6为本发明polyI:〇和D-GalN诱导小鼠急性肝炎模型，HVEM蛋白阻断LIGHT后各组ALT检测水平。[_6]图7为本发明各组小鼠肝脏病理切片HE染色。[0047]图8为本发明TUNEL染色检测各组小鼠肝细胞的凋亡水平。[0048]图9为本发明致死剂量的ConA诱导小鼠急性肝炎模型，HVB[蛋白阻断LIGHT后动物生存曲线。具体实施方式[0049]实施例1HVEM蛋白作为药物在治疗与肝损伤相关的疾病中的应用，该HVEM蛋白具有序列表中SEQIDNO.1第1位到202位所示的氨基酸序列，其在治疗与肝损伤相关的疾病药物的各种剂型中至少包含有该HVEM蛋白。[0050]SEQIDN0.11MEPPGDWGPPPWRSTPKTDYLRLVLYLTFLGAPCYAPALPSCKEDEYPVGSECCPKCSPG61YRVKEACGELTGTVCEPCPPGTYIAHLNGLSKCLQCQMCDPAMGLRASRNCSRTENAVCG121CSPGHFCIVQDGDHCAACRAYATSSPGQRVQKGGTESQDTLCQNCPPGTFSPNGTLEECQ181HQTKCSWLVTKAGAGTSSSHWV其中：与肝损伤相关的疾病包括病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝炎、药物性肝损伤、脂肪肝、肝纤维化和肝衰竭。[0051]一、人蛋白表达载体构建：收取PBMC，通过TRIZL抽提细胞RNA，用premega逆转录酶的逆转录获得PBMCcDNA作为模版。[0052]用于构建原核表达载体的引物：上游引物:CGGAATTCCTGCCGTCCTGCAAGGAGG;下游引物:CCCAAGCTTTACCCAGTGGGAGCTGCTGG;HindIII和EcoRI双酶切目的基因，pET-28a空载体质粒，回收目的片段和线性质粒，酶连获得pET_28a_HVEM质粒。产物转化DH5a进行细菌内克隆，筛选后的阳性克隆大量扩增获得原核表达质粒pET-28a-HVEM测序结果见图1。[0053]二、原核表达人HVEM蛋白：质粒pET-28a-HVEM，转化BL21表达菌种，细菌生长到对数生长期OD6Q=0.4〜1.0期间时，加终浓度为ImM的IPTG诱导表达，筛选出高表达目的蛋白的克隆，然后进行大量表达目的蛋白。培养6h后，12000g尚心收集菌体，用5mM的咪挫重悬。超声破碎，离心收集上清，用0.45mm的过滤器过滤上清，加用咪唑重悬的NI-NTA，4°C翻转过夜结合。然后将结合液转至离心管中，待自然沉降后，用5mM，20mM,50mM,lOOmM，250mM,500mM的咪唑依次从低浓度到高浓度洗脱蛋白，通过蛋白浓度分析仪的读数确定洗脱目的蛋白的咪唑浓度，并收集峰值时的洗脱液。结果显示为250mM时，观察到峰值。然后通过SDS-PAG电泳后，考马斯亮蓝染色和westernblot来鉴定蛋白纯化结果，并通过BCA法测定纯化蛋白的浓度参见图2。[0054]实施例2蛋白作为药物在治疗与肝损伤相关的疾病中的应用，该HVEM蛋白采用HVEM的膜外段与人IgG的Fc段组成可溶性的融合蛋白代替；HVEM的膜外段与人IgG的Fc段具有序列表中SEQIDN0.2第1位到434位所示的氨基酸序列，其在治疗与肝损伤相关的疾病药物的各种剂型中至少包含有该融合蛋白。[0055]SEQIDNO.21MEPPGDWGPPPffRSTPKTDVLRLVLYLTFLGAPCYAPALPSCKEDEYPVGSECCPKCSPG61YRVKEAOGELTGTVCEPCPPGTYIAHLNGLSKCLQCQMCDPAMGLRASRNCSRTENAVCG121CSPGHFCIVQDGDHCAACRAYATSSPGQRVQKGGTESQDTLCQNCPPGTFSPNGTLEECQ181HQTKCSWLVTKAGAGTSSSHWVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI241SRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDff301LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY361PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH421NHYTQKSLSLSPGK构建和表达人HVEM的膜外段与人IgG的Fc段组成的可溶性的融合蛋白是指将人HVEM的膜外段与人IgG的Fc段基因克隆到真核表达载体再转染到CH0细胞表达。[0056]一、构建pcDNA3•1-HVEM和pcDNA3•1-HVEM-Fc表达质粒：通过PCR和重叠PCR的方法，将人IgGlFc和HVEM胞外端基因片段重组，得到融合基因HVEM-Fc。将HVHi[和HVEM-Fc分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，构建pcDNA3.1-HVEM和pcDNA3•1-HVEM-Fc质粒。[0057]二、建立表达HVEM和HVEM-Fc的CHO细胞株：转染CHOK1细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，当细胞融合至80%左右时，通过Lipofectamine@2000transfection试剂将重组质粒pcDNA3.1-HVEM和pcDNA3.1-HVEM-Fc分别转染CHOK1细胞。转染24h后，用G418800ygml加压筛选，同时设以未转化的CH0K1细胞为对照，每5d换一次液。当对照细胞全部死亡时，转染细胞换用含维持浓度的G418400ugml的培养基维持培养4周，建立稳定表达的CH0细胞系。经过4轮筛选，选出了稳定高表达细胞株，将筛选的高表达单克隆在T75方瓶中贴壁培养，随后分别换成不含FBS的DMEMF12和无血清培养基B001培养。最后用无血清培养基B001悬浮驯化培养，得到适合悬浮生长的稳定高表达细胞株。在摇瓶中依次进行悬浮批次培养，120rPtn，37°C恒温振荡持续培养。[0058]三、融合蛋白的纯化，培养上清经ProteinA琼脂糖亲和法分离纯化，收集洗脱峰，SDS-PAGE和Westemblot分析。

权利要求：1.HVEM蛋白作为药物在治疗与肝损伤相关的疾病中的应用，其特征在于:该蛋白具有序列表中SEQIDNO.1第1位到2〇2位所示的氨基酸序列，其在治疗与肝损伤相关的疾病药物的各种剂型中至少包含有该HVEM蛋白。2.如权利要求1所述的HVEM蛋白作为药物在治疗与肝损伤相关的疾病中的应用，其特征在于:所述HVEM蛋白采用HVffl的膜外段与人IgG的Fc段组成可溶性的融合蛋白代替;所述HVffl的膜外段与人IgG的Fc段具有序列表中SEQIDN0.2第1位到434位所示的氨基酸序列。3.如权利要求1所述的HVEM蛋白作为药物在治疗与肝损伤相关的疾病中的应用，其特征在于:所述与肝损伤相关的疾病包括病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝炎、药物性肝损伤、脂肪肝、肝纤维化和肝衰竭。

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