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申请/专利权人：重庆范德瓦尔斯生物科技有限公司

摘要：本发明公开了一种基于磁珠的RNApulldown新方法，包括如下步骤：1）体外转录获得目的RNA；2）制备寡核苷酸或单个核苷酸磁珠；3）制备目的RNA磁珠复合物；4）捕获目的RNA‑蛋白复合物；5）收集目的RNA‑蛋白复合物，用于后续分析（WB、银染、质谱等）。本发明利用体外转录获得的目的RNA，还原其在细胞内的真实结构；目的RNA与磁珠上的核苷酸的连接稳定，不会形成混连；避免了在游离状态下目的RNA末端连接生物素标记的单个核苷酸所造成的生物素数量过多的弊端；本发明无需在目的RNA与生物素标记的核苷酸连接后进行纯化，节约了时间和成本。

主权项：1.一种基于磁珠的RNApulldown方法，其特征在于，包括如下步骤：1体外转录获得目的RNA；2制备寡核苷酸磁珠；3制备目的RNA磁珠；4捕获目的RNA-蛋白复合物；5收集目的RNA-蛋白复合物；所述步骤2寡核苷酸磁珠的制备方法为：将生物素标记的寡核苷酸与链霉亲和素磁珠在核苷酸捕获缓冲液中孵育，采用旋转混合仪持续混匀，孵育时间为30min-120min，孵育温度为15℃-37℃，通过生物素与链霉亲和素的亲和力将寡核苷酸固定至磁珠表面，经过磁分离、洗涤获得寡核苷酸磁珠，核苷酸捕获缓冲液pH7.0-7.5，包括：10-50mMTris、0.5-1MNaCl、1-5mMEDTA，洗涤缓冲液pH7.0-7.5，包括：10-50mMTris、10-50mMNaCl、0.1％-1％吐温20；所述步骤2中的寡核苷酸为人工合成的含5-30个碱基的寡核苷酸，其构成的碱基为A、U、C、G，其末端的1-3个碱基上带有生物素，具体方法为用带生物素的核苷酸合成寡核苷酸末端的1-3个核苷酸；所述步骤3制备目的RNA磁珠复合物的方法为：将步骤2所得核苷酸磁珠，通过RNA连接酶在RNA连接缓冲溶液中将目的RNA与磁珠上的寡核苷酸连接，采用旋转混合仪持续混匀，连接时间为0.5h-24h，连接温度为4℃-37℃，经过磁分离洗涤获得目的RNA磁珠，RNA连接缓冲溶液pH7.0-7.5，包括：10-50mMTris，10-50mMMgCl2，1-5mMDTT，10-50mMATP，0.1％-1％BSA，10％-30％PEG6000或PEG8000；所述步骤4捕获目的RNA-蛋白复合物的方法为：将步骤3得到的目的RNA磁珠在RNA-蛋白结合缓冲溶液中与样品蛋白进行孵育，采用旋转混合仪持续混匀，孵育时间为30min-120min，孵育温度为4℃-37℃，经过磁分离洗涤获得目的RNA-蛋白磁珠复合物，RNA-蛋白结合缓冲溶液pH7.0-7.5，包括：10-50mMTris、0.5–1MNaCl、10–50mMMgCl2、0.1％-1％吐温20。

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