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申请/专利权人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司

摘要：本发明涉及重组I型变应原Derp1和Derf1蛋白的制备方法，通过发酵参数优化，采用特定的培养和发酵控制条件，相比未优化的发酵条件，发酵产物活性提高50％，产量提高20％以，并且所用的发酵培养基成分简单、成本低廉，降低了发酵工艺的成本；通过对纯化工艺的优化，收率提高了30％。并且宿主残留蛋白和残留DNA已完全满足药用级要求，表示本发明的重组I型变应原Derp1和Derf1蛋白及其制备方法已具有产业化应用前景。

主权项：1.重组尘螨I型变应原DP1和DF1蛋白的制备方法，包括发酵工艺和纯化工艺，发酵过程包括重组酵母菌株活化、种子液培养、高密度发酵，其特征在于，所用发酵培养基为40%BSM培养基，高密度发酵的诱导阶段诱导温度为：25~27℃，pH值为6.5±0.2，所述BSM培养基的组分及含量为K2SO418.2gL，MgSO414.9gL，KOH4.13gL，CaSO40.93gL，H3PO426.7mLL，甘油40gL。

全文数据：重组尘螨Ⅰ型变应原Derp1和Derf1蛋白的制备与应用技术领域本发明属于生物工程基因领域，涉及重组Ⅰ型变应原Derp1和Derf1蛋白的产业化生产方法及其应用。背景技术尘螨种类繁多，广泛存在于人类生活和工作环境中，其排泄物、代谢物及螨体均具有较强的变应原性，据统计全球约10％的人口尘螨过敏，约80％的外源性哮喘由尘螨引起。目前，临床上主要采用尘螨变应原粗提液治疗尘螨引起的变态反应性疾病，例如2006年上市的浙江我武生物的“畅迪”粉尘螨滴剂即为粉尘螨代谢培养物的提取液。尘螨变应原主要存在于排泄物和螨体中，采用提取方法耗时长，过程繁琐，成本较高；此外天然变应原提取液的组成非常复杂，恒定其组分非常困难，且容易受到外源性有毒物质、病原体微生物的污染。长期使用尘螨变应原粗提液易导致红晕、肿胀、硬结、坏死等局部反应和休克、水肿、支气管痉挛、荨麻疹、血管性水肿、全身性红斑等全身反应。此外，采用粗提液进行诊断，无法明确患者对变应原各组分的反应程度，易致误诊。变应原的质量对变态反应疾病的诊断和治疗至关重要，用于免疫诊治的变应原应该是纯品而不宜为粗提取液。重组变应原与粗提液相比具有以下优势：1重组变应原具有更高的纯度，与粗提液相比不含非变应原成分、酶类、酶抑制剂和毒性蛋白等；2重组蛋白成分单一，具有较好的特异性，而粗提液中成分复杂，患者可能只与其中部分成分反应，特异性差；3重组变应原与天然提取液相比减少了IgE结合的抗原表位，有效降低IgE介导的过敏反应，同时保留变应原T细胞识别所必须的结构域，具有较好的免疫原性，减少免疫治疗的危险性，提高脱敏治疗的效果。尘螨变应原组成复杂，约有30余种，其中Ⅰ型和Ⅱ型变应原是最主要的变应原组分。目前对重组Ⅰ型户尘螨变应原DerP1，以下简称DP1和重组Ⅰ型粉尘螨Derf1，以下简称DF1变应原研究最全面的是日本学者ToshiroTakai等在2005年进行的研究，文章表明DP1和DF1在毕赤酵母系统中表达时需要加入蛋白前肽，否则无法在真核表达系统中进行表达，然后再经过活化过程得到与天然蛋白氨基酸序列一致的成熟的DP1和DF1蛋白，该文章对DP1和DF1蛋白活化方法和活化前后蛋白活性进行研究，证明活化后蛋白的活性与天然蛋白一致，高于活化前蛋白；但文章中介绍的方法成熟蛋白的收率较低，不适合于大规模制备，也未对DP1和DF1蛋白的表达和发酵工艺进行优化；除此外，暂时还没有更进一步的研究报道。综合以上研究结果，截止目前为止，针对DP1和DF1发酵和纯化的研究较少，且收率，结构，质量等均难以达到临床使用要求；本发明通过对DP1和DF1蛋白的发酵工艺和纯化工艺进行优化，使得发酵水平、纯化收率和质量要求均达到了重组脱敏药物临床使用要求。发明内容本申请根据本公司专利申请号201611270412.2DP1和201611267250.7DF1中提供的方法筛选到的基因工程菌株，对DP1和DF1蛋白发酵和纯化工艺中的关键质量参数进行了优化；由于DP1和DF1基因序列同源性高，因此蛋白的结构和性质有较大的相似性，发明人在研究中发现DP1和DF1蛋白在纯化工艺中也有极高的相似性。本发明提供的重组尘螨I型变应原蛋白的制备方法，包括发酵工艺和纯化工艺，发酵过程包括重组酵母菌株活化、种子液培养、高密度发酵，所用发酵培养基为40～60％BSM培养基，高密度发酵的诱导阶段诱导温度为：23～27℃，pH值为5.5-6.5。作为优选，所用发酵培养基为40％BSM培养基，高密度发酵的诱导阶段诱导温度为：25～27℃，pH值为6.5±0.2。更优选，高密度发酵的诱导阶段甲醇流加速度为30mLh-1L-1，并维持DO不高于40％。更优选，高密度发酵的菌体增值阶段发酵温度为27℃，pH＝5.5±0.2，转速300rpm，DO值100％，添加PTM12.4mlL。更优选，高密度发酵的限速生长阶段开始以30mlh-1L-1的速率补加50％甘油，后补料速度上调为60mlh-1L-1。作为优选，重组尘螨I型变应原蛋白的制备方法的纯化工艺为三步纯化，包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析。作为优选，阳离子交换层析的纯化填料为SPFF；优选的pH范围4.0-6.5。更优选的，阳离子交换层系中样品和缓冲液pH为5.0。作为优选，阴离子交换层析的纯化填料为QFF；优选的pH范围6.0-8.0；优选的电导值2.0mScm-20.0mScm。更优选的，阴离子交换层析中样品和缓冲液pH为8.0，电导为20.0mScm。作为优选，疏水层析的纯化填料为phenylFF；优选的pH范围6.5-8.5；优选的硫酸铵浓度为1.0-2.0M。更优选的，疏水层析中样品和平衡缓冲液硫酸铵浓度为2.0M，pH为8.5。本发明采用以上技术方案后，具有以下优点：通过发酵参数优化，制备的发酵液活性更高、产量更高，所采用的发酵培养基成分简单、成本低廉，降低了发酵工艺的成本；发酵工艺中采用特定的培养和发酵控制条件，与未经优化的无机培养基相比，活性提高50％略高于天然提取的DP1、DF1活性，产量提高20％以上；通过对纯化工艺进行优化，收率提高了30％。并且宿主残留蛋白和残留DNA已完全符合药典要求，表示经发明人大规模发酵的DP1、DF1已完全满足药用级要求。附图说明图1重组DP1毕赤酵母菌株实施例1中第一批次发酵SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图1-a为重组DP1毕赤酵母菌株实施例1中第一批次发酵中SDS-PAGE电泳图，泳道M为10-230kDa宽范围的蛋白上样Marker；泳道1为流加甲醇0h发酵上清液，泳道2为流加甲醇6h发酵上清液，泳道3为流加甲醇12h发酵上清液，泳道4为流加甲醇18h发酵上清液，泳道5为流加甲醇24h发酵上清液，泳道6为流加甲醇30h发酵上清液，泳道7为流加甲醇36h发酵上清液，泳道8为流加甲醇42h发酵上清液，其中箭头所指即为重组DP1条带。图1-b为重组DP1毕赤酵母菌株实施例1中第一批次发酵中小规模高密度发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图2重组DP1毕赤酵母菌株实施例1中第二批次发酵SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图2-a为重组DP1毕赤酵母菌株实施例1中第二批次发酵SDS-PAGE电泳图，泳道M为10-230kDa宽范围的蛋白上样Marker；泳道1为流加甲醇0h发酵上清液，泳道2为流加甲醇6h发酵上清液，泳道3为流加甲醇12h发酵上清液，泳道4为流加甲醇18h发酵上清液，泳道5为流加甲醇24h发酵上清液，泳道6为流加甲醇30h发酵上清液，泳道7为流加甲醇36h发酵上清液，泳道8为流加甲醇42h发酵上清液，其中箭头所指即为重组DP1条带。图2-b为重组DP1毕赤酵母菌株实施例1中第二批次发酵小规模高密度发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图3重组DP1毕赤酵母菌株实施例1中第三批次发酵SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图3-a为重组DP1毕赤酵母菌株实施例1中第三批次发酵SDS-PAGE电泳图，泳道M为10-230kDa宽范围的蛋白上样Marker；泳道1为流加甲醇0h发酵上清液，泳道2为流加甲醇6h发酵上清液，泳道3为流加甲醇12h发酵上清液，泳道4为流加甲醇18h发酵上清液，泳道5为流加甲醇24h发酵上清液，泳道6为流加甲醇30h发酵上清液，泳道7为流加甲醇36h发酵上清液，泳道8为流加甲醇42h发酵上清液，其中箭头所指即为重组DP1条带。图3-b为重组DP1毕赤酵母菌株实施例1中第三批次发酵小规模高密度发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图4重组DP1毕赤酵母菌株实施例2中SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图4-a为重组DP1毕赤酵母菌株实施例2中SDS-PAGE电泳图，泳道1为流加甲醇0h发酵上清液，泳道2为流加甲醇6h发酵上清液，泳道3为流加甲醇12h发酵上清液，泳道4为流加甲醇18h发酵上清液，泳道5为流加甲醇24h发酵上清液，泳道6为流加甲醇30h发酵上清液，泳道7为流加甲醇36h发酵上清液，泳道8为流加甲醇42h发酵上清液，其中箭头所指即为重组DP1条带。图4-b为重组DP1毕赤酵母菌株实施例2中小规模高密度发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图5重组DP1毕赤酵母菌株实施例3中SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图5-a为重组DP1毕赤酵母菌株实施例3中SDS-PAGE电泳图，泳道1为流加甲醇0h发酵上清液，泳道2为流加甲醇2h发酵上清液，泳道3为流加甲醇4h发酵上清液，泳道4为流加甲醇8h发酵上清液，泳道5为流加甲醇10h发酵上清液，泳道6为流加甲醇15h发酵上清液，泳道7为流加甲醇18h发酵上清液，泳道8为流加甲醇22h发酵上清液，泳道9为流加甲醇26h发酵上清液，其中箭头所指即为重组DP1条带图5-b为重组DP1毕赤酵母菌株实施例3中中试高密度发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图6为DP1发酵液上清pH4.0第一步纯化结果。其中，图6-a为DP1发酵液第一步纯化色谱图；图6-b为DP1发酵液第一步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为非预染蛋白Marker，泳道2为纯化前样品，泳道3为纯化穿透样品；泳道4-10为纯化洗脱峰各收集管。图7为DP1发酵液上清pH5.0第一步纯化结果。其中，图7-a为DP1发酵液第一步纯化色谱图；图7-b为DP1发酵液第一步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为非预染蛋白Marker，泳道2为纯化前样品，泳道3为纯化穿透样品；泳道4-10为纯化洗脱峰各收集管。图8为DP1发酵液上清pH6.5第一步纯化结果。其中，图8-a为DP1发酵液第一步纯化色谱图；图8-b为DP1发酵液第一步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为纯化前样品，泳道2为纯化穿透样品，泳道3为非预染蛋白Marker；泳道4-10为纯化洗脱峰各收集管。图9为DP1蛋白pH6.0第二步纯化结果。其中，图9-a为DP1蛋白第二步纯化色谱图；图9-b为DP1蛋白第二步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为纯化前样品，泳道2为非预染蛋白Marker，泳道3为纯化穿透样品，泳道4-6为洗脱样品。图10为DP1蛋白pH7.0第二步纯化结果。其中，图10-a为DP1蛋白第二步纯化色谱图；图10-b为DP1蛋白第二步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1非预染蛋白Marker，泳道2为纯化前样品，泳道3为纯化穿透样品，泳道4-6为洗脱样品。图11为DP1蛋白pH8.0第二步纯化结果。其中，图11-a为DP1蛋白第二步纯化色谱图；图11-b为DP1蛋白第二步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为非预染蛋白Marker，泳道2为纯化前样品，泳道3为纯化穿透样品，泳道4为洗脱样品。图12为DP1蛋白pH6.5第三步纯化结果。其中，图12-a为DP1蛋白第三步纯化色谱图；图12-b为DP1蛋白第三步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为非预染蛋白Marker，泳道2为纯化前样品，泳道3为纯化穿透样品，泳道4-8为洗脱峰各收集管样品。图13为DP1蛋白pH7.5第三步纯化结果。其中，图13-a为DP1DF1蛋白第三步纯化色谱图；图13-b为DP1DF1蛋白第三步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为纯化前样品，泳道2为非预染蛋白Marker，泳道3为纯化穿透样品，泳道4-9为洗脱峰各收集管样品。图14为DP1蛋白pH8.5第三步纯化结果。其中，图14-a为DP1DF1蛋白第三步纯化色谱图；图14-b为DP1DF1蛋白第三步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为纯化前样品，泳道2为纯化穿透样品，泳道3为洗脱收集管，泳道4为非预染蛋白Marker，泳道5-10为洗脱峰各收集管样品。图15为DP1DF1蛋白纯度HPLC分析结果。其中图15-a为DP1蛋白RP-HPLC分析结果；图15-b为DF1蛋白RP-HPLC分析结果。图16为DP1DF1蛋白氨基酸覆盖率分析结果。其中图16-a为DP1蛋白氨基酸覆盖率分析结果；图16-b为DF1蛋白氨基酸覆盖率分析结果。图17为DP1300L发酵液上清第一步纯化结果。其中，图17-a为DP1发酵液第一步纯化色谱图；图17-b为DP1发酵液第一步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为纯化前样品，泳道2为非预染蛋白Marker，泳道3为纯化穿透样品；泳道4-10为纯化洗脱峰各收集管。图18为DP1蛋白第二步纯化结果。其中，图18-a为DP1蛋白第二步纯化色谱图；图18-b为DP1蛋白第二步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为纯化前样品，泳道2为纯化后样品，泳道3为洗脱样品。图19为DP1蛋白第三步纯化结果。其中，图19-a为DP1DF1蛋白第三步纯化色谱图；图19-b为DP1DF1蛋白第三步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为纯化前样品，泳道2为非预染蛋白Marker，泳道3为纯化穿透样品，泳道4-9为洗脱峰各收集管样品。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1重组DP1DF1小规模3L高密度发酵工艺步骤1：重组菌株活化取冻存于-80℃的DP1工作种子库中甘油菌种子于YPD固体培养基酵母提取物10gL，蛋白胨20gL，葡萄糖20gL，琼脂糖15gL划线，30℃恒温恒湿箱培养3-5天。步骤2：种子液培养挑取平板上单克隆菌落于YPD液体培养基酵母提取物10gL，蛋白胨20gL，葡萄糖20gL，30℃，220rpm培养至OD600≈6.0，并在显微镜下观察无杂菌，即得到发酵用种子液。步骤3：发酵过程洗净赛多利斯B-plus生物反应器，用pH＝7.0和pH＝4.0的标准液分别校正发酵罐的pH计探头，然后配置BSM培养基作为发酵培养基不同发酵批次BSM浓度见表1，倒入罐中，121℃高压灭菌20min，待温度降到50℃后，用浓氨水调pH＝5.5±0.2。将步骤2中得到的种子液按照1:15VV，种子液发酵培养基比例接入生物反应器中。初期重组毕赤酵母菌体增殖阶段发酵温度为27℃，pH＝5.5±0.2，转速＝300rpm培养，DO值100％，添加PTM12.4mlL。此阶段大约22h，期间DO持续下降，通过增加搅拌转速、通气量以及通氧气将DO维持在20％，当碳源消耗完毕后，溶氧值迅速上升，菌体湿重达到120gL，此时进入限速生长阶段，此阶段的开始的3h以30mlh-1L-1的速率补加50％甘油，3h后补料速度上调为60mlh-1L-1。补加6h，菌体湿重约250gL，停止补料，DO上升，表明碳源耗尽，进入诱导阶段。不同发酵批次诱导条件见表1并维持DO不高于30％，进行发酵表达，诱导开始后，每隔一段时间开始取样，同时在诱导初期中进行DOSPIKE，保证发酵罐罐内甲醇无积累，测发酵液OD600吸收值以及菌体湿重，图1-3为三个批次菌体湿重发酵期间变化趋势图。表1重组DP1小规模高密度发酵工艺条件优化其中，BSM发酵培养基即是指life的发酵说明书上确定的标准浓度，即指K2SO418.2gL，MgSO414.9gL，KOH0.93gL，CaSO44.13gL，H3PO426.7mLL，甘油40gL，40％的BSM发酵培养基即是指life的发酵说明书上确定的标准浓度基础上各成分浓度都降为40％，即K2SO47.28gL，MgSO45.96gL，KOH0.372gL，CaSO41.652gL，H3PO410.68mLL，甘油16gL。重组DP1的上述发酵工艺对重组DF1同样适用。实施例2重组DP1DF1大规模30L高密度发酵验证步骤1：重组菌株活化取冻存于-80℃的工作种子库中甘油菌种子于YPD固体培养基酵母提取物10gL，蛋白胨20gL，葡萄糖20gL，琼脂糖15gL划线，30℃恒温恒湿箱培养3-5天。步骤2：一级种子液培养挑取步骤1中平板上单克隆菌落于YPD液体培养基酵母提取物10gL，蛋白胨20gL，葡萄糖20gL，30℃，220rpm培养至OD600≈6.0，并在显微镜下观察无杂菌，即得到发酵用一级种子液。步骤3：二级种子液培养将步骤2中获得的一级种子液接种至赛多利斯B-plus发酵罐中，并以60％BSM，pH＝5.5±0.2，27℃，300rpm值培养，通过通气和转速条件使溶氧保持在25％，最终至OD600≈40，湿重达到约80gL，并在显微镜下观察无杂菌，即得到发酵用二级种子液。步骤4：发酵过程洗净赛多利斯Cplus生物反应器，用pH＝7.0和pH＝4.0的标准液分别校正发酵罐的pH计探头，然后按照实施例1中关键工艺参数的设计区间，确定发酵培养基为40％BSM进行配置发酵培养基20L，并倒入发酵罐中，121℃在线灭菌20min，待温度降到50℃后，用浓氨水调pH＝5.5±0.2。将步骤3中得到的种子液按照1:15VV，种子液发酵培养基比例接入发酵罐中。初期重组毕赤酵母菌体增殖阶段发酵温度为27℃，pH＝5.5±0.2，转速＝300rpm培养，DO值100％，添加PTM12.4mlL。此阶段大约20h，当碳源消耗完毕后，溶氧值迅速上升，菌体湿重达到100gL，此时进入限速生长阶段，此阶段的开始的2h以30mlh-1L-1的速率补加50％甘油，2h后补料速度上调为60mlh-1L-。补加4h，菌体湿重约200gL，停止补料，DO上升，表明碳源耗尽，进入诱导阶段。调节pH＝6.0±0.2，以甲醇流加速度为30mlh-1L-1进行诱导表达重组DP1；维持DO不高于40％，诱导温度为25～27℃，pH＝6.5±0.2，进行发酵表达，发酵开始后每隔一段时间取样一次，测发酵液OD600吸收值以及菌体湿重，图4-b为重组DP1大规模发酵液OD600吸收值以及菌体湿重发酵期间变化趋势图，由图可知，在重组毕赤酵母发酵期间，发酵液OD600均能达到300以上，且菌体湿重均能达到400gL。诱导40h发酵结束后，离心收集上清，SDS-PAGE电泳鉴定甲醇诱导不同时间的重组DP1产量图4-a，说明发酵液OD600吸收值、菌体湿重变化趋势以及发酵产物均与3L小规模高密度发酵保持一致。申请人因此确定，本发明的发酵工艺，完全能够进行产业化放大生产。重组DP1的上述发酵工艺对重组DF1同样适用。实施例3重组DP1DF1中试300L高密度发酵验证步骤1：重组菌株活化取冻存于-80℃的工作种子库中甘油菌种子于YPD斜面培养基酵母提取物10gL，蛋白胨20gL，葡萄糖20gL，琼脂糖15gL划线，30℃恒温恒湿箱培养3-5天。步骤2：一级种子液培养挑取步骤1中平板上单克隆菌落于YPD液体培养基酵母提取物10gL，蛋白胨20gL，葡萄糖20gL，30℃，220rpm培养至OD600≈6.0，并在显微镜下观察无杂菌，即得到发酵用一级种子液。步骤3：二级种子液培养将步骤2中获得的一级种子液接种至迪沃信BVT-3000型30L种子罐中，并以60％BSM，pH＝5.5±0.2，27℃，300rpm值培养，通过通气和转速条件使溶氧保持在25％，最终至OD600≈40，湿重达到约80gL，并在显微镜下观察无杂菌，即得到发酵用二级种子液。步骤4：发酵过程洗净迪沃信BVT-3000型300L发酵罐，用pH＝7.0和pH＝4.0的标准液分别校正发酵罐的pH计探头，然后按照实施例1中关键工艺参数的设计区间，确定发酵培养基为40％BSM进行配置发酵培养基100L，并倒入发酵罐中，121℃在线灭菌20min，待温度降到50℃后，用浓氨水调pH＝5.5±0.2。将步骤3中得到的种子液按照1:10VV，种子液发酵培养基比例接入发酵罐中。初期重组毕赤酵母菌体增殖阶段发酵温度为27℃，pH＝5.5±0.2，转速＝300rpm培养，DO值100％，添加PTM12.4mlL。此阶段大约20h，当碳源消耗完毕后，溶氧值迅速上升，菌体湿重达到100gL，此时进入限速生长阶段，此阶段的开始的2h以3Lh的速率补加50％甘油，2h后补料速度上调为60mlh-1L-1。补加4h，菌体湿重约200gL，停止补料，DO上升，表明碳源耗尽，进入诱导阶段。以甲醇流加速度为60mlh-1L-1进行诱导表达重组DP1；维持DO不高于40％，诱导温度为25～27℃，pH＝6.5±0.2，进行发酵表达，发酵开始后每隔一段时间取样一次，测发酵液OD600吸收值以及菌体湿重，图5-b为重组DP1大规模发酵液OD600吸收值以及菌体湿重发酵期间变化趋势图。诱导26h发酵结束后，离心收集上清，SDS-PAGE电泳鉴定甲醇诱导不同时间的重组DP1产量图5-a，说明发酵液OD600吸收值、菌体湿重变化趋势以及发酵产物均与30L大规模高密度发酵保持一致。申请人因此确定，本发明的发酵工艺，完全能够进行产业化放大生产。重组DP1的上述发酵工艺对重组DF1同样适用。实施例4重组DP1DF130L纯化工艺一、重组DP1发酵液上清第一步纯化步骤1：发酵液的预处理按上述实施例中得到的发酵液高速离心，得到上清液；加入硅藻土助滤，过夜得到澄清的发酵液样品；用10KD膜包超滤稀释，降低电导至5mScm以下。步骤2：阳离子交换层析将上述处理后的发酵液上清乙酸调节pH4.0，上SPFF层析柱，柱型为BPG140100，柱床体积2800mL，平衡缓冲液为50mMNaAc，pH4.0，洗脱缓冲液为50mMNaAc，1.0MNaCl，pH4.0，按照0-100％线性洗脱，DP1目的蛋白主要集中在第二个洗脱峰，图6-a为DP1蛋白第一步纯化色谱图pH4.0，图6-b为DP1蛋白第一步纯化SDS-PAGE分析图pH4.0。步骤1、2的其余步骤不变，调节样品和缓冲液pH5.0。图7-a为DP1蛋白第一步纯化色谱图pH5.0，图7-b为DP1蛋白第一步纯化SDS-PAGE分析图pH5.0。步骤1、2的其余步骤不变，调节样品和缓冲液pH6.5。图8-a为DP1蛋白第一步纯化色谱图pH6.0，图8-b为DP1蛋白第一步纯化SDS-PAGE分析图pH6.0。由图6至图8结果可知，图7中纯化后DP1蛋白纯度最高，其余条件均有杂质存在，其中pH5.0为最佳条件。二、重组DP1蛋白第二步纯化:步骤1：超滤合并上述第一步纯化步骤2中第二个洗脱峰，10KD膜包超滤稀释至电导95％。重组DP1的上述纯化工艺对重组DF1同样适用。实施例7重组DP1DF1300L发酵液纯化样品蛋白活性分析按照实施例5步骤4中活性检测方法对300L发酵液制备得到的DP1和DF1蛋白进行活性检测，以30L发酵液制备得到的样品和天然蛋白作为比较，表6显示300L发酵及纯化样品活性略高于30L及天然蛋白，说明发酵及纯化工艺得到了较好的放大。表6：300L发酵纯化样品与30L发酵纯化及天然蛋白活性值比较

权利要求：1.重组尘螨I型变应原DP1和DF1蛋白的制备方法，包括发酵工艺和纯化工艺，发酵过程包括重组酵母菌株活化、种子液培养、高密度发酵，其特征在于，所用发酵培养基为40～60％BSM培养基，高密度发酵的诱导阶段诱导温度为：23～27℃，pH值为5.5-6.5。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所用发酵培养基为40％BSM培养基，高密度发酵的诱导阶段诱导温度为：25～27℃，pH值为6.5。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，高密度发酵的诱导阶段甲醇流加速度为30mLh-1L-1，并维持DO不高于40％。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，高密度发酵的菌体增值阶段发酵温度为27℃，pH＝5.5±0.2，转速300rpm，DO值100％，添加PTM12.4mlL。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，高密度发酵的限速生长阶段开始以30mlh-1L-1的速率补加50％甘油，后补料速度上调为60mlh-1L-1。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法的纯化工艺为三步纯化，包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，阳离子交换层析的纯化填料为SPFF，pH范围4.0-6.5。8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，阴离子交换层析的纯化填料为QFF，pH范围6.0-8.0，电导值2.0mScm-20.0mScm。9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，疏水层析的纯化填料为phenylFF，pH范围6.5-8.5；硫酸铵浓度为1.0-2.0M。

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