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申请/专利权人：安阳工学院;中国农业科学院棉花研究所

摘要：本发明涉及一种用于单细胞转录组测序的亚洲棉根尖细胞与叶肉细胞原生质体的解离方法，该方法包括亚洲棉种子的萌发、组织培养、酶解解离原生质体、离心收集原生质体以及显微观察鉴定等步骤。本发明从亚洲棉的根尖和叶片所解离的原生质体浓度较高高于3000cellsμL，且活率不低于92％，完全符合10×Genomics单细胞转录组测序的上机要求。因此本发明得出的根尖与叶片解离原生质体的方法，更好的解决了亚洲棉根尖细胞与叶肉细胞原生质体解离困难以及活率低的难题，从而可以更好的研究棉花抗逆过程特定基因的表达，对于棉花的遗传发育与培育抗逆棉花的品种至关重要。

主权项：1.一种用于单细胞转录组测序的亚洲棉根尖细胞与叶肉细胞原生质体的解离方法，其特征在于，其包括如下步骤：1分别培养获得亚洲棉的根尖和叶肉组织；2将根尖与叶肉组织分别加入酶解液进行培养；3向步骤2中处理后的酶解液中加入原生质体释放液，之后细胞筛过滤，低速离心，弃上清；4向步骤3中保留的溶液中加入原生质体释放液，重新悬浮原生质体，细胞筛过滤，低温低速离心，弃上清，加入原生质体释放液重新悬浮原生质体；5将步骤4中获得的原生质体置于冰上，重新悬浮原生质体，取原生质体悬浮液加入台盼蓝染色液在载玻片上通过显微镜镜检，计算细胞数量与细胞活率；在步骤2中，根尖组织所加入的酶解液的配方为：CellulaseR101.5％、Pectolyase1％、D-甘露醇0.4molL、KCl0.1molL、MES0.08molL、CaCl20.02molL、BSA0.1％，溶剂为灭菌的ddH2O，根尖组织加入酶解液后，先进行抽真空，之后再进行培养，抽真空的时间为30min-1h，培养为在25℃，以80-120rmin培养5-7h；在步骤2中，叶肉组织所加入的酶解液的配方为CellulaseR101.5％、Macerozyme0.75％、HemiCellulase1％、D-甘露醇0.4molL、KCl20mmolL、MES20mmolL、CaCl210mmolL、BSA0.1％，溶剂为灭菌的ddH2O，培养为在25℃，以80-120rmin培养4-6h；在步骤3中，根尖组织所用的原生质体释放液的配方为：KCl0.1molL、BSA0.1％、MES0.08molL、D-甘露醇0.4molL，溶剂为灭菌的ddH2O；叶肉组织所用的原生质体释放液的配方为：KCl5mmolL、NaCl154mmolL、MES20mmolL，溶剂为灭菌的ddH2O；MES的pH值为5.7。

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