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申请/专利权人：中南林业科技大学
摘要：本发明公开了一种油茶叶肉原生质体分离与纯化方法，属于植物生物技术领域。本发明方法包括以下步骤：对油茶组培苗进行22～32h黑暗预处理，采集组培苗完全展开的叶片；去掉采集叶片的主脉和叶缘，切成叶条加入到含EME培养基的无菌瓶中，盖上封瓶膜，负压下抽真空10min～1h；吸出EME培养基、加入酶液；无菌瓶用封口膜封口后酶解6～14h；将酶解后的溶液通过无菌筛过滤，滤液离心后去上清，用W缓冲液对原生质体进行清洗和重悬，冰上静置沉淀后，吸去上清，得到纯净的原生质体。通过本发明方法获得的原生质体形态完整、稳定，产量高达2.8×107个g·FW，原生质体活力高达91.7％以上。
主权项：1.一种油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，其特征在于：包括以下步骤：1对油茶组培苗进行22～32h黑暗预处理，采集油茶组培苗完全展开的叶片；2去掉步骤1采集的叶片的主脉和叶缘，切成叶条加入到含EME培养基的无菌瓶中，盖上封瓶膜，负压下抽真空10min～1h；然后吸出EME培养基、加入酶液；无菌瓶用封口膜封口后酶解6～14h；所述的酶液与EME培养基的pH调为5.5～6.0；其中，酶液：10～15gL纤维素酶R-10、5～10gL离析酶R-10、2.5～5gL蜗牛酶、0.6gL2-N-吗啉乙磺酸一水合物、1.8gL二水合氯化钙、0.055gL二水合磷酸二氢钠、36.43gL甘露醇、68.46gL蔗糖、12MS培养基、250mgL麦芽提取物；EME培养基：MS培养基+500mgL麦芽提取物+136.92gL蔗糖；3将步骤2酶解后的溶液通过无菌筛过滤，滤液离心后去上清，用W缓冲液对原生质体进行清洗和重悬，冰上静置待原生质体沉淀后，吸去上清，得到纯净的原生质体；其中，W缓冲溶液：2mmolL2-N-吗啉乙磺酸一水合物、125mmolLCaCl2、5mmolLKCl、154mmolLNaCl、5mmolL葡萄糖，用1molL的HCl和KOH调pH为5.6～6.0。
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