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申请/专利权人：广州瑞臻再生医学科技有限公司

摘要：本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种诱导多能干细胞来源的前脑少突胶质祖细胞和少突胶质细胞的制备方法。所述分化培养基包括基础培养基和添加剂；所述添加剂包括转化生长因子β信号传导抑制剂、骨形态发生蛋白信号传导抑制剂、Wnt信号通路调控因子肝素、成纤维细胞生长因子FGF2、视黄酸、音猬因子信号通路激活剂、三碘甲状腺素、生物素、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1和神经营养素3中的至少一种。本发明通过优化分化培养基的配方，以及Olig2+前脑少突胶质祖细胞和O4MBP前脑少突胶质细胞的制备方法，可以高效制备高纯度端脑亚型的少突胶质祖细胞和成熟少突胶质细胞。

主权项：1.一种诱导多能干细胞来源的前脑少突胶质祖细胞和前脑少突胶质细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）胚状体悬浮培养阶段：消化诱导多能干细胞，克隆诱导多能干细胞，培养第0天至第4天，将克隆的诱导多能干细胞转入分化培养基1；培养第5天至第9天，加入分化培养基2培养；培养至第9天时，诱导多能干细胞分化为往前脑少突胶质祖细胞方向发育的神经干细胞；2）少突胶质祖细胞贴壁分化培养阶段：培养第10天至第13天，将贴壁的神经干细胞在分化培养基3中培养，培养第14天至第22天，将贴壁的神经干细胞在分化培养基4中培养，然后将神经干细胞进行悬浮；3）少突胶质祖细胞悬浮分化培养阶段：培养第23天至第34天，将悬浮的神经干细胞在分化培养基5中培养，获得细胞聚集物；培养第35天至第50天，将细胞聚集物悬浮在分化培养基6中培养；培养第51天至第60天，最终分化为成熟少突胶质细胞；分化培养基1为以下浓度的组分：基础培养基1、1-5μM转化生长因子β信号传导抑制剂RepSox和1-5μM骨形态发生蛋白信号传导抑制剂Dorsomorphin；分化培养基2为以下浓度的组分：基础培养基2、1-5μgmlWnt信号通路调控因子肝素和10-50μgml成纤维细胞生长因子FGF2；分化培养基3为以下浓度的组分：基础培养基2和5-200nM视黄酸；分化培养基4为以下浓度的组分：基础培养基3、5-200nM视黄酸和1-5μM音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine；分化培养基5为以下浓度的组分：基础培养基3、1-5μM音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine和5-20ngml成纤维细胞生长因子FGF2；分化培养基6为以下浓度的组分：基础培养基4、1-5μM音猬因子信号通路激活剂Purmorphamine、30-60ngml三碘甲状腺素、20-100ngml生物素、2-10ngml血小板源性生长因子、5-10ngm胰岛素样生长因子1和5-10ngml神经营养素3；基础培养基1为以下组分：DMEMF12、血清替代物、GlutaMAX、β-巯基乙醇和非必需氨基酸；基础培养基2为以下组分：DMEMF12、N2、非必需氨基酸和GlutaMAX；基础培养基3为以下组分：DMEMF12、N2、B27、非必需氨基酸和GlutaMAX；基础培养基4为以下组分：DMEMF12、N1、B27和GlutaMAX；所述少突胶质祖细胞呈Foxg1Olig2阳性。

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