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申请/专利权人：中国科学院生态环境研究中心

摘要：本申请涉及一种基于MCF‑7细胞系构建的RARα效应物体外筛选方法，包括以下步骤：Step1，构建RARα表达载体；Step2，细胞转染；Step3，化合物暴露及报告基因检测。本申请利用离体的人源细胞作为宿主细胞，可以最大程度的反映外源化学品对人类健康的潜在内分泌干扰效应。并且，本申请的方法的灵敏度较高，激动剂AM580的EC50值为0.87nM，最小可观察效应浓度LOEC为0.1nM；拮抗剂Ro41‑5253的IC50值为2.67μM，LOEC值为0.625μM。

主权项：1.一种基于MCF-7细胞系构建的RARα效应物体外筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：Step1，构建RARα表达载体1通过基因合成人源RARα受体的转录本序列NM_000964.4，其两端含有NheI和EcoRI的酶切位点；2将商品化的载体pEF1α-IRES-TagRFP和RARα合成片段分别经过NheI和EcoRI双酶切消化，获得具有粘性末端的新载体骨架片段和RARα片段；3用T4DNA连接酶将两个片段重组形成RARα表达载体pEF1α-RARα-RFP，并转化至E.coliDH5α菌株进行质粒扩增，其中pEF1α-RARα-RFP的序列如SEQIDNO:3所示；4对RARα表达载体pEF1α-RARα-RFP进行去内毒素的大量提取，使质粒的终浓度500ngμL；Step2，细胞转染1将MCF-7细胞复苏并置于37℃、5％CO2细胞培养箱传代培养，所用培养基为完全培养基；2种板；当细胞传代稳定后，将MCF-7细胞接种于带孔白板中，细胞密度为4×104细胞孔，并置于37℃、5％CO2细胞培养箱中过夜使其贴壁生长；3转染；当细胞汇合度为80％时，开始执行细胞转染，所用转染方法为阳离子脂质交换法：a.准备2支1.5mL离心管，在管1中加入5μL孔的减血清培养基Opti-MEMI和0.2μL孔Lipofectamine3000转染试剂；在管2中依次加入5μL孔的Opti-MEMI培养基、50ng孔的报告载体pRARE-TA-Luc、50ng孔的RARα表达载体pEF1α-RARα-RFP和0.2μL孔的P3000试剂，其中，报告载体pRARE-TA-Luc的序列如SEQIDNO:4所示；b.将管2中的溶液加入到管1中，充分混匀，室温孵育15min；c.将孵育后的转染复合物按照10μL孔的用量加入到位于96孔白板的细胞培养基中；d.在37℃、5％CO2细胞培养箱中持续培养4h，完成质粒转染过程；Step3，化合物暴露及报告基因检测1化合物暴露；待转染过程结束后，将细胞用无明显细胞毒性的不同浓度的待测化合物进行暴露，暴露时间为24h，暴露培养基为无酚红DMEM增补1％CS-FBS和1％的双抗；2萤火虫荧光素酶Luc活性检测；用检测试剂盒测定化合物暴露24h后的Luc活性，检测方法为单荧光素酶试验mono-Lucassay；Step4，双荧光素酶报告试验Step2描述的细胞转染过程，在配制转染复合物时，管2中除了加入Luc报告载体和RARα受体载体，再加入10ng孔的RLuc报告载体pGL4.74，其余过程不变；在报告基因的检测时，使用Dual-Gloluciferaseassaysystem双荧光素酶检测试剂盒，对体系中的Luc和RLuc分别进行活性检测，以每孔中Luc与RLuc的化学发光强度的比值作为该孔样品校正后的Luc活性。

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权利要求：

百度查询： 中国科学院生态环境研究中心 基于MCF-7细胞系构建的RARα效应物体外筛选方法