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申请/专利权人：杭州师范大学

摘要：本发明公开了一种p53及UTX信使RNA纳米粒制备方法及其在膀胱癌治疗中的应用，属于基因工程技术领域。肿瘤抑癌基因信使RNA纳米粒通过下述方法制备：1）体外合成化学修饰p53‑mRNA及UTX‑mRNA，2）制备脂质聚合物复合信使RNA纳米粒。本发明中p53、UTX信使RNA成功通过纳米体系递送至膀胱癌细胞内，在体内外高效快速地诱导细胞凋亡和抑制促转移因子的表达从而显著抑制了肿瘤细胞的生长及转移；具有膀胱粘膜粘附功能的RNA纳米粒递送体系可以增加膀胱内p53‑mRNA及UTX‑mRNA药物停留时间从而使得信使RNA进入肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用。

主权项：1.p53-mRNA及UTX-mRNA纳米粒的制备方法，其特征在于该制备方法包括以下步骤：1）体外合成化学修饰p53-mRNA及UTX-mRNA携带T7启动子的人p53及UTX基因开放阅读框质粒形成线性化DNA，再采用PCR扩增包含T7启动子的p53及UTX开放阅读框，并对PCR产物进行纯化，得到纯化的聚合酶链式反应产物；将MEGAscript®T7转录试剂盒与纯化的聚合酶链式反应产物、3′-O-Me-m7G5′ppp5′G帽结构类似物、三磷酸鸟苷、5-甲基-胞苷三磷酸、三磷酸腺苷和假尿苷-5’-三磷酸反应，反应完成后进行脱氧核糖核酸酶处理,再使用polyA试剂盒将3’polyA试剂盒添加到IVTRNA转录物中，得到p53UTX信使RNA；p53UTX信使RNA经MEGAclear试剂盒纯化后用热敏磷酸酶处理以及进一步纯化得到所需mRNA；热敏磷酸酶处理温度为37℃，处理时间为30分钟；其中，化学修饰反应体系具体为：纯化的聚合酶链式反应产物的添加量为1-2μg，3′-O-Me-m7G5′ppp5′G帽结构类似物的添加量为6mM、三磷酸鸟苷的添加量为1.5mM、5-甲基-胞苷三磷酸的添加量为7.5mM、三磷酸腺苷的添加量为7.5mM、假尿苷-5’-三磷酸的添加量为7.5mM，反应温度为37℃，反应时间为4小时；2）制备脂质聚合物复合信使RNA纳米粒取PAMAM树枝状聚合物G0和1,2-环氧十四烷，合成阳离子脂质G0-C14；采用优化的自组装策略，将步骤1）得到的mRNA与G0-C14DMF混合，形成mRNAG0-C14络合物，再在5mgml的DMF中快速加入250gPLGA，与配合物混合，达到均匀混合溶液；磁力搅拌下，将混合溶液滴入10毫升无核酸的HyPure水，其中1mgDSPE-PEG-SH构建得到NPs的脂质PEG外层；自组装策略中，mRNA16μg与G0-C14250μg进行混合15s，其中，mRNA的浓度为1mgml，G0-C14的浓度为2.5mgml；经自组装稳定后，形成的NPs用预冷的无酶纯水使用Amicon过滤管冲洗，去除游离化合物和有机溶剂，洗涤后的纳米粒沉淀用PBS重悬成不同浓度的黏附型mRNANPs，得到p53-mRNA及UTX-mRNA纳米粒。

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