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申请/专利权人：中国科学院华南植物园

摘要：本发明公开了一种单座苣苔的分子育种方法。本发明以无菌苗的叶片、叶柄、茎为转化受体，将构建的含目标基因的植物表达载体通过根癌农杆菌介导方法将目标基因导入单座苣苔基因组，通过芽器官发生途径分化形成再生植株；在转化芽诱导、转化芽伸长及生根时添加筛选标记基因的相应的、适宜浓度的抗生素筛选转化体，通过Southern杂交、Northern杂交及GUS染色证明所获得的抗性株均为转化株。本发明方法整个操作过程为4个月，一次操作100个叶片外植体，平均可以获得大约11个株系的转基因株系，每个转基因叶片经6周培养可以产生20个以上的芽，再生植株的生根率为100％，转基因植株移栽到土壤的存活率达100％。

主权项：1.一种单座苣苔的分子育种方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.用于转化的外植体的培养：外植体为单座苣苔再生植株的叶片；所述的再生植株是通过以下步骤制备的：取单座苣苔幼叶消毒后，切成0.5-0.8cm长的切段，接种到芽诱导培养基，培养出现绿色愈伤组织而后发育为芽，芽高达1cm时将芽切出转接入生根培养基培养，诱导生根获得再生植株；所述的芽诱导培养基为MS培养基添加1mgLBA、0.1mgLNAA、30gL蔗糖和8gL琼脂，pH5.8；所述的生根培养基为12MS培养基添加30gL蔗糖和8gL琼脂，pH5.8；所述的消毒为将幼叶用自来水冲洗干净后，放入质量分数0.1％的多菌灵水溶液中浸泡5-10分钟，取出后用自来水冲洗干净；用体积分数75％乙醇水溶液浸泡30秒，再用无菌水冲洗3遍后，将幼叶移入含质量分数0.05％吐温80的质量分数0.1％升汞水溶液中浸泡12分钟，用无菌水冲洗6遍，然后将叶片置于无菌滤纸上吸干水分；S2.转化获得抗性植株：将步骤S1制备的外植体浸泡于含有携带目标基因的植物表达载体的根癌农杆菌菌液中25分钟，然后取出外植体，吸干多余的菌液后将外植体移至共培养基中，黑暗下培养3天，然后取出共培养后的外植体，漂洗后将外植体移至抗性芽诱导筛选培养基I中，光下培养，待长出抗性芽后，将抗性芽转接至新鲜抗性芽诱导培养基II，待抗性芽高达1cm时，移到抗性芽生根培养基中，光下培养，抗性芽伸长并产生不定根，获得抗性植株；所述的共培养基为MS培养基添加1mgLBA、0.1mgLNAA、20mgL乙酰丁香酮、30gL蔗糖和8gL琼脂，pH5.5；所述的抗性芽诱导筛选培养基I为MS培养基添加1mgLBA、0.1mgLNAA、15mgL潮霉素、500mgL头孢霉素、30gL蔗糖和8gL琼脂，pH5.8；所述的抗性芽诱导筛选培养基II为MS培养基添加1mgLBA、0.1mgLNAA、15mgL潮霉素和250mgL头孢霉素、30gL蔗糖和8gL琼脂，pH5.8；所述的抗性芽生根培养基为12MS培养基添加25mgL潮霉素、250mgL头孢霉素、30gL蔗糖和8gL琼脂，pH5.8；所述的漂洗为将共培养后的外植体用质量分数0.05％吐温80无菌水溶液冲洗5～6次，然后用500mgL头孢霉素无菌水溶液冲洗一次，置外植体于无菌纸上吸干水；S3.抗性植株的分子检测：利用植物表达载体上的筛选标记基因、报告基因或者目标基因的序列进行Southern杂交检测基因是否已转入单座苣苔基因组，采用GUS染色或Northern杂交检测目标基因的表达水平，检测抗性芽或者抗性植株是否为转基因材料；S4.转基因植株的移栽：将检测确认为含有目标基因的抗性植株从培养瓶中移出，洗去根部培养基，定植在装有栽培基质的盆中，得到移栽成功的转基因植株。

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