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申请/专利权人：云南大学

摘要：本发明公开了一种碳量子点氧化亚铜CQDsCu2O复合物在制备治疗癌症的药物中的应用。本发明通过体外细胞实验探究了CQDsCu2O的抗癌活性。CQDsCu2O对HeLa、A549、HT‑29、SKOV3以及BABL‑3T3五种癌细胞作用72h后的IC50值在1.25‑18.9μgmL‑1之间，对癌细胞增殖的抑制作用高于正常细胞，对正常细胞的毒性和副作用较低。浓度为12.5μg·mL‑1时，对肿瘤细胞的抑制率超过50％，其中CQDsCu2O对SKOV3细胞的抑制作用最强，IC50值为1.25μg﹒mL‑1，CQDsCu2O对SKOV3细胞最为敏感。

主权项：1.碳量子点氧化亚铜CQDsCu2O复合物在制备抑制癌细胞增殖的药物中的应用，其特征在于，所述癌细胞为HeLa、A549、HT-29、SKOV3和BABL-3T3细胞中的至少一种，所述碳量子点氧化亚铜CQDsCu2O复合物中CQDs的质量比为1～12％。

全文数据：碳量子点氧化亚铜CQDsCu20复合物在制备治疗癌症的药物中的应用技术领域[0001]本发明属于抗癌材料技术领域，尤其涉及碳量子点氧化亚铜CQDsCu20复合物在制备治疗癌症的药物中的应用。背景技术[0002]随着人类生活水平的提高和环境污染的加剧，癌症的发病率和致死率不断增高，尤其卵巢癌，是全球范围内发病率第二的致死率最高的妇科恶性肿瘤。肿瘤的治疗方法包括手术治疗，放射治疗和药物治疗，目前在临床常规治疗方案是在细胞减灭术的基础上进行药物治疗。由于抗肿瘤化疗药物常有严重的不良反应以及耐药性问题，严重影响了化疗的效果和患者预后，使其应用受到很大限制。常规的抗癌治疗直接杀死癌细胞的同时，也不可避免地杀死正常细胞以及破坏人体免疫系统，产生严重的毒副作用。因此新型抗肿瘤药物越来越受到人类的关注。[0003]很多无机材料具有较高的生物相容性、表面容易被修饰、载药量高以及稳定性好的优点而被用于医药领域，例如Huang等人合成了具有空心多孔球状结构的hm-Zr02作为抗癌药物输送载体，实验发现内孔直径为385nm时，药物负载量最高，且hm-Zr02负载DOX释放能力对pH具有依赖性，hm-Zr02在酸性中释放药物的速率最高，hm-Zr02粒子被正常细胞吸收的较多，但是hm-Zr〇2负载的DOX在癌细胞中比正常细胞释放更多的药物。二氧化硅材料也被用作药物载体，例如Yuan等人将介孔二氧化硅材料用于靶向载药时，聚天冬氨酸可以防止运输过程中正常细胞摄取该药，到达肿瘤部位后在谷胱甘肽的作用下药物又会被释放出来。二氧化硅与Fe3O4通过共价键结合生成的Fe3O4OmSiO2能够用作药物载体、造影剂，其中药物装在二氧化硅的介孔中，Fe3O4被连接在介孔处，药物被运输到肿瘤部位后只有通过磁场作用，药物才会被释放出。二氧化硅通过PVP修饰后生成的纳米球也具有药物控释的作用，递送过程中药物在球内不会泄露，达到疾病部位时，通过磁刺激，药物才会被缓慢释放出来。顺铂是癌症治疗中广泛使用的金属基药物，Fairlamb等人合成的铂类配合物对癌细胞的增殖具有抑制作用。由于C60产生的单线态氧具有杀死癌细胞的作用，因此石墨烯在生物领域得到了较好的应用。[0004]量子点（QD因其独特的光学性能备受关注，它被广泛应用在医学领域。然而大多数QD由重金属制成，毒性较大，阻碍其实际应用。碳量子点Carbonquantumdots，CQDs是量子点中一种新型的纳米材料，粒径低于IOnm，为球状结构的纳米材料，其骨架结构主要以碳元素为主。分离碳纳米管过程中Xu等第一次发现了这种碳材料，Sun等人利用激光烧蚀得至IJ了具有荧光的、颗粒小、均匀的CQDs，且光稳定性好。制取CQDs的碳源范围很广，比如蜡烛灰、废纸、活性炭、生姜等都可以制备CQDstXQDs有很好的生物相容性、毒性小、容易制备、荧光强等特点，因此在医学领域得到了较好的应用。Ming等人通过电化学法合成的碳量子点用于降解甲基橙。Li等人以明胶为原料制备的CQDs具有很好的分散性，且细胞毒性低。Wang等人在碱性条件下通过电化学法制备了粒径为1.2-3.Snm的CQDs，具有良好的荧光标记效果。Fowley等人将疏水性的CQDs通过具有生物相容性的两亲聚合物包裹后得到了水溶性的CQDs，在较宽的pH范围内荧光度强、稳定性好，制备的CQDs能够穿透胆固醇细胞的细胞膜，对细胞活力的影响小，其半数抑制率IC50值为350mg.mL一、[0005]CQDs与其他材料的复合物能增强其性能。Zhang等人对比了单独的碳量子点和CQDsAg类复合物的光催化活性，发现由于碳量子点与Ag的共振效应使得CQDsAgAg3P〇4对有机污染物的降解效果增强。这是因为CQDs可以充当电子受体和供体，在光催化过程中，CQDs的电子能够转移到Ag3PO4的表面，Ag3PO4上剩余的电子也可以转移到CQDs上，且CQDs会吸收部分可见光。通过双光子辐射将CQDs与光敏剂原卟啉PDT结合生成的CQDs-P复合物，在波长SOOnm处穿透人体组织的深度是PDT的四倍，与传统的含有重金属的量子点相比，CQDs-P复合物毒性低，为治疗深处肿瘤提供了重要的医用价值。利用对苯二酚和三溴化磷合成的掺杂P的碳量子点PCQD，磷原子的掺杂能提供更多的活性位点P掺杂的CQDs具有较好的生物标记能力。[0006]动植物的生存都离不开铜元素，铜参与细胞的新陈代谢过程，铜在人体内系统的稳定调节及运转起着非常重要的作用，铜能够促进人体内白细胞含量的增加，有利于人体对微量元素的吸收。如果人体含铜量过低，会发生贫血、骨骼发育较慢等不良反应。铜属于硬度不是很大的物质、且容易制取;铜容易失去最外层的电子，与其它种类的原子配位可以制得更为稳定的物质，因而具有较好的活性，在生物医学上具有广阔的应用前景。例如Lin报道了体内所含适量的铜能够具有预防癌症的作用，还可以起到杀菌的效果。市场上销售的含铜杀菌剂药物作用性强且药效长久，不容易产生抗药性，可以促进伤口的愈合。[0007]氧化亚铜属于P型半导体金属材料，几乎不溶于水和乙醇，作为重要的无机氧化物材料，在吸附、催化、电化学等领域得到了广泛应用。Wang等人制备的氧化亚铜纳米粒子CONPs能够抑制肿瘤细胞增殖，选择性高，可以进入细胞和特异性靶向线粒体诱导HeLa细胞凋亡，并使细胞停滞在G1G0期，而且CONPs对正常组织毒副作用低，当把⑶NPs注射到小鼠体内，进入体内七天就会被排除。氧化亚铜的复合材料也具有良好的生物活性，通过CuCl2、BaTi03与HAuCl4合成的BaTi03Cu20Au复合物显示出优异的抗病原效应。[0008]由于碳量子点的粒径很小，一般在IOnm以下，很容易进入到细胞中，CQDs比较稳定、荧光强，在光学成像以及生物医学领域得到了广泛应用。Cu2O又能选择性抑制肿瘤细胞增殖，具有良好的抗肿瘤活性。目前关于碳量子点氧化亚铜CQDsCu20复合物抗肿瘤活性的研究未见报道。本发明首次将碳量子点氧化亚铜复合物应用于抗肿瘤，该复合物能够发挥CQDs和Cu2O二者的协同作用，提供抗肿瘤活性。发明内容[0009]针对现有技术的不足，本发明提供碳量子点氧化亚铜CQDsCu20复合物在制备治疗癌症的药物中的应用，本发明发现CQDsCu20对肿瘤细胞增殖、细胞迀移、血管生成具有抑制作用，CQDsCu20具有良好的抗癌活性和选择性，且毒副作用低。[0010]本发明第一方面，提供碳量子点氧化亚铜CQDsCu2〇复合物在抑制癌细胞增殖中的应用。[0011]本发明第二方面，提供碳量子点氧化亚铜CQDsCu2〇复合物在抑制癌细胞迀移中的应用。[0012]所述癌细胞为他1^、六549、!11'-29、310¥3和8481^^3细胞中的至少一种;作为优选，所述癌细胞为SK0V3细胞，CQDsCu20对SK0V3细胞的抑制作用最强，IC5q值为Hyg.mL—1。[0013]本发明第三方面，提供碳量子点氧化亚铜CQDsCu20复合物在抑制新血管生成中的应用。大量的科学实验发现，新血管的形成是肿瘤转移以及侵袭的必要条件。CQDsCu2O能够抑制心血管生成，本发明通过增大CQDsCu20反应浓度，抑制作用更加明显，浓度为12.5yg.ml1时，几乎无血管网形成。[0014]进一步地，本发明还提供碳量子点氧化亚铜CQDsCu20复合物在制备治疗癌症的药物中的应用。[0015]作为优选，所述碳量子点氧化亚铜（CQDsCu20复合物中CQDs的质量比为1〜12%，该质量比范围内的CQDsCu20复合物的抗癌活性较高。[0016]本发明的特点如下：本发明通过体外细胞实验探究了CQDsCu2〇的抗癌活性。CQDsCu2〇对拖1^、4549、!11'-29、510¥3以及8481^^3五种癌细胞作用7211后的1〇5值在1.25-18.9ygmL—1之间，对癌细胞增殖的抑制作用高于正常细胞。浓度为12.5yg·mL—1时，对肿瘤细胞的抑制率超过50%，其中CQDsCu20对SK0V3细胞的抑制作用最强，IC5q值为1.25yg.mL，CQDsCu20对SK0V3细胞最为敏感。与药物奥沙利铂和青蒿琥酯相比，CQDsCu20的抗癌活性高于这两种药物。使用Α0ΕΒ染色和在流式细胞分析仪检测凋亡比例，发现CQDsCu20能诱导SK0V3细胞凋亡，并将细胞阻滞于S期，CQDsCu20还能使SK0V3细胞中的肌动蛋白F-actin荧光减弱。CQDsCu20对SK0V3细胞的迀移具有抑制作用，迀移率会随着CQDsCu20浓度的增大而减小。明胶酶谱实验证明了CQDsCu20通过调控SK0V3细胞MPP-2蛋白释放量，进而抑制细胞迀移。浓度为1.56yg.mL—1的CQDsCu20即能够抑制HUVEC血管生成，其抑制作用高于Cu2〇和酪氨酸激酶，当浓度增大至12.5yg.ml1时，几乎无管网形成。[0017]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:本发明提供的CQDsCu2〇能够抑制细胞增殖，对癌细胞的毒性作用高于正常细胞，且对正常细胞的毒性以及副作用较低。SK0V3细胞经CQDsCu20作用后，细胞F-actin荧光强度减弱，并诱导细胞凋亡，将细胞阻滞于S期。通过细胞划痕实验发现CQDsCu20对HUVEC血管生成具有很强的抑制作用。通过明胶酶谱实验，发现CQDsCu20能够抑制SK0V3细胞MPP-2蛋白表达量，进而抑制细胞迀移。附图说明[0018]图1为CQDsCu2〇的XRD图谱；[0019]图2为CQDsCu2〇的SEM和EDS图；[0020]图3为CQDs的TEM图；[0021]图4为不同浓度的CQDsCu20对细胞增殖的抑制作用（24h;[0022]图5为不同浓度的CQDsCu20对细胞增殖的抑制作用48h;[0023]图6为不同浓度的CQDsCu20对细胞增殖的抑制作用72h;[0024]图7为Α0ΕΒ染色法检测SK0V3细胞凋亡形态；[0025]图8为流式细胞仪检测CQDsCu20对SK0V3细胞凋亡的影响；[0026]图9为流式细胞仪检测CQDsCu20对SK0V3细胞周期分布的影响；[0027]图10为SK0V3细胞与不同浓度的CQDsCu20作用后F-actin的结构变化；[0028]图11为SK0V3细胞与CQDsCu2〇、CQDs、Cu2O作用后F-actin的变化；[0029]图12为不同浓度CQDsCu20对SK0V3细胞迀移的影响；[0030]图13为CQDsCu20对SK0V3细胞迀移数目的影响；[0031]图14为CQDsCu20对HUVEC细胞Dil-标记血管生成的影响，标尺:200μπι;[0032]图15为CQDsCu20、Cu2〇、SU5416对HUVEC细胞（Dil-标记）血管生成的影响，标尺：200μηι；[0033]图16为反应6ha和12hbCQDsCu20、Cu2〇、SU5416作用后血管长度统计图；[0034]图17为反应6ha和12hbCQDsCu20、Cu2〇、SU5416对血管生成的抑制率；[0035]图18为CQDsCu2〇对SK0V3细胞MMP-2蛋白表达的影响。具体实施方式[0036]下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。[0037]实施例ICQDsCu2〇和CQDs的制备[0038]称取6gNa0H和3.74g硫酸铜分别溶于150mL去离子水中，将Na0H溶液加到0.Imol·IZ1的硫酸铜溶液中，形成絮状悬浮液，超声（150W，40KH15分钟。称取Ig聚乙烯基吡咯烷酮溶于去离子水，加入上述混合物中。然后称取18g葡萄糖溶于100mLlmol·I1去离子水中加入到混合物中，超声波处理60分钟。放置16小时后用去离子水、无水乙醇分别洗三次，60°C烘箱干燥6小时，得到CQDsCu20复合材料。[0039]称取18g葡萄糖溶于去离子水中，加入Imol·IZ1的NaOH溶液，超声波处理5h，调节pH为7.0，用乙醇、硫酸镁纯化后得到CQDs。[0040]材料表征[0041]X射线衍射分析XRD是对样品CQDsCu20进行表征分析的重要手段，不同的物质，其衍射峰和衍射角都是不同的，可以通过衍射数据分析物质的晶体结构以及物相组成。从CQDsCu20的XRD谱图可以看到（图1，各衍射峰强度较高，谱峰尖锐，无杂峰，表明该材料的结晶性好。[0042]扫描电镜SEM[0043]通过扫描电子显微镜观察材料的形貌，进一步分析材料的结构和粒径大小。本实施例中通过扫描电镜对材料进行了表征。CQDsCu20是一种近球形胶体颗粒（图2-a所示），直径为1-3毫米图2-b和图2-c所示）。通过SEM进一步放大单个胶体颗粒可以看到该复合材料的表面上有突出的结构部分。通过对CQDsCu20材料的EDS表征（图2-d所示），结果显示材料中含有Cu元素，同时有C元素和0元素的存在。[0044]制得的CQDs的粒径比较小，平均粒径大小在IOnm左右（图3所示），Au为表征实验中的镀金，Cu为胶带底板。实验结果表明CQDs成功沉积在Cu2O表面上。[0045]实施例2[0046]本实施例深入研究了CQDsCu20对SK0V3细胞的迀移、细胞凋亡、细胞周期、F-actin、金属基质蛋白酶MMP-2表达量、血管生成的影响。[0047]细胞培养[0048]细胞用含10%胎牛血清的低糖培养基DMEM，BABL-3T3细胞用含15%胎牛血清的高糖培养基，HUVEC细胞，用0.01%胶原酶从人体脐带中提取，用含15%BI的培养基培养。所有细胞置于37°C，5%二氧化碳培养箱中培养，细胞汇合度达到80%以上时进行传代培养。[0049]细胞消化、传代[0050]当细胞生长达到80%以上，抽去培养瓶中原培养液，用经过预热的I3BS缓冲液洗一次，用预热的0·25%trypsin消化3-5min后，加入IOmLDMEM培养液（含胎牛血清），离心5min，手机细胞，加入IOmL新鲜培养液，放入培养箱培养。[0051]细胞MTT毒性分析[0052]当细胞生长达到80%以上，经胰酶消化后离心，用新鲜培养基重悬细胞。将细胞液加之96孔板，每孔2XIO4个细胞，然后培养24h。细胞生长良好且全部贴壁后，加入浓度为0，1.56，3.12，6.25，12.5，25，50yg.ml1的CQDsCu20。每个浓度重复3个实验孔，不加药物的孔设置为对照，加药后放置培养箱分别培养2411、4811、7211。每一个孔都加入50uL的5yg.ml1的MTT放置培养箱反应4h后吸取每孔中的培养液，每孔再加入150yLDMSO，震荡15min，选择波长为490nm，测定吸光度0D值），实验至少重复三次。IC50值为细胞抑制率达到50%时药物的浓度。[0053]Α0ΕΒ染色法凋亡检测[0054]SK0V3细胞用0.25%胰酶含有EDTA消化后离心，用新鲜培养基重悬细胞。将细胞接加至35mm培养皿，每一个孔2XIO5个细胞，然后将其放置培养箱培养24h。分别加入浓度为12.5yg.mL—1的CQDsCu20、Cu20、CQDs作用3h，不加药物的细胞设置为对照。抽去培养基，PBS洗三次，经胰酶消化后离心，弃上清液，吖啶橙AO与溴乙锭EB加至培养皿中，常温反应6分钟。用移液枪滴加至载玻片上，通过显微镜观察细胞形貌变化，实验至少重复三次。[0055]AnnexinV-FITC细胞凋亡检测[0056]AnnexinV经过荧光素FITC标记之后可以用于早期凋亡细胞的检测，碘化丙啶PI能够透过中期、晚期以及坏死细胞，细胞核被PI染成红色，AnnexinV与PI联合使用通过流式细胞仪分析检测细胞的凋亡情况。SK0V3细胞生长达到70%以上，消化后离心，用新鲜培养基重悬细胞。将细胞液加至35mm培养皿中，每盒2XIO5个细胞，培养24h。加入浓度为0，3.12，6.25，12.5yg.mL—1的CQDsCu20，作用24h后，抽去原培养液，通过不含EDTA的0.25%的胰酶消化后离心，吸去上清，加入PBS缓冲液收集5-10万个细胞，离心后吸去上清。将200μL的AnnexinV-FITCL结合液和IOyL的PI染色液加入细胞中，常温避光反应15min，在流式细胞仪上检测，计数8000个细胞，实验至少重复三次。[0057]流式细胞仪分析细胞周期[0058]将SK0V3细胞接种于35mm培养皿中，每盒2XIO5个细胞，然后培养24h。加入浓度为0，3.12，6.25，12.5，25yg.mL—1的CQDsCu20，不加药物的细胞设置成对照。放入培养箱作用24h后，用不含EDTA的胰酶消化后离心，吸去上清后重悬细胞事先预冷的PBS缓冲液和70%乙醇各ImL，轻轻吹打均匀，放入4°C冰箱固定。次日离心吸去上清液，分别加入500yL染色液（150yL的PI、60yL的RNase与3mL的染色缓冲液混合），用流式细胞仪检测，实验至少重复三次。[0059]细胞体外迀移实验[0060]将SK0V3细胞加至6孔板，每孔2XIO5个细胞，培养24h。用200微升枪头在每孔中间部位划痕，随后用I3BS冲洗三次，弃掉，加入浓度为0，6.25，12.5，25yg.mL—1的CQDsCu20，放入培养箱分别作用6h、12h、24h后在显微镜下观察，不加药物的孔设置为对照。实验至少重复二次。[0061]体外血管生成[0062]在96孔板中加入50yL的Matrigel，使Matrigel均勾铺于孔板中，铺好后放入4°C冰箱5miη，再取出放入37°C培养箱中凝固30min。期间将HUVEC细胞Di1标记消化、离心后，重悬细胞（2XIO5细胞mL。取IOOyLHUVEC细胞悬液轻轻加入上述96孔板中，加入浓度为0，1·56，3·12，6·25，12·5yg.mL—1的CQDsCu20和VEGFIOng.mL—”，不加药物的孔设置为对照，在显微镜下观察。实验结束后利用相应软件测得管网的长度，管网抑制率％=对照组的管网长度-实验组的管网长度对照组的管网长度X100%。实验至少重复三次。[0063]F-actin荧光染色[0064]将SK0V3细胞接加至35mm培养皿含18X18mm的盖玻片），每孔2XIO5个细胞，然后将其放于培养箱中进行细胞爬片。24h后，加入浓度为0，6.25，12.5，25yg.mL—1的CQDsCu20作用3h，不加药物的孔设置为对照。抽去培养基，PBS洗后用4%的多聚甲醛固定12min，PBS洗两次，加入500yL的0.1%TritonX-100经PBS稀释溶液破膜4min，PBS缓冲液洗两次，用F-actin经PBS稀释染色液，常温避光染色lh，PBS缓冲液洗两次，再用5yL的PI染色6min，PBS洗两次后用去离子水经过灭菌处理洗两次，慢慢取出爬有细胞的玻片，通过显微镜观察细胞变化，并拍照。[0065]明胶酶谱法[0066]将SK0V3细胞液加至35mm培养皿中，每盒2XIO5个细胞，然后培养24h。抽去原培养基，用PBS洗净培养基，加入浓度为0，3.125，6.25，12.5、25yg.mL—1的CQDsCu20，不加药物的孔设置为对照。放入培养箱作用24h。超滤浓（1000r5min，4°C离心），超滤管左右两侧分别吹打10次，提取至I.OmL离心管中。[0067]通过SDS-PAGE电泳法对实验最后得到的上清液进行分析。电泳时浓缩电压为100V，40mA，浓缩20min，分离电压为150V，50mA，持续60-90min。电泳后，用2.5%Triton-X洗胶15-30min，洗两次，将胶放入3mL的2.5%Triton-X和IOOmL孵育液的混合液中，装入塑料袋，封口后放至培养箱20-24h。将胶放在40mL洗脱液中，15min，用0.1%考马斯亮蓝G-250对胶进行染色90min，之后用洗脱液洗去胶的蓝色背底，洗脱时间为2-3h。[0068]CQDsCu20抑制细胞增殖作用[0069]利用MTT法测定了CQDsCu2〇对HeLa、A549、HT-29、SK0V3、BABL-3T3五种细胞增殖的影响。图4、图5、图6分别为不同反应时间时，CQDsCu20对细胞生长的抑制率。从图4可以看出，CQDsCu20对正常细胞的抑制作用强于对正常细胞的抑制作用。当CQDsCu20的浓度为12.5yg·mL—1时，反应24h后对癌细胞的抑制率超过40%，CQDsCu20与癌细胞作用相同的时间时，随着CQDsCu20浓度的增加，对细胞增殖具有明显的抑制作用，说明CQDsCu20对癌细胞的抑制作用具有浓度依赖性。同一浓度的CQDsCu20作用细胞时，细胞在CQDsCu20作用48h后（图5，抑制率比24h提高，在72h后，抑制率最高，表明材料对细胞的抑制作用在72小时达到最佳（图6，CQDsCu20对细胞增值的抑制作用呈时间和浓度依赖性。CQDsCu20对SK0V3细胞的抑制作用最强，CQDsCu20的浓度为1.56yg·ml1时，反应24h后对细胞的抑制率接近50%，说明CQDsCu20不仅具有抗癌活性，而且对SK0V3细胞具用很高的选择性。[0070]CQDsCu20对五种细胞的IC5Q值在1.25-18.9ygmL—1之间（见表1所示），以上数据说明CQDsCu20的浓度1.56-50yg·ml1范围内对癌细胞增殖具有抑制作用。72h时，CQDsCu20对Hela、A549、HT-29、SK0V3和BABL-3T3细胞四种细胞的IC5Q值分别为10·9、10·5、10·2、I·25和16·9yg·mL—1，CQDsCu20对SKOV3细胞的IC5Q值最低为1·25yg.mL—1，对SKOV3细胞抑制作用最强，说明对SKOV3细胞最为敏感。根据表l，CQDsCu20对癌细胞的IC5q值高于Cu2O的IC50值。与药物奥沙利铂OXA和青蒿琥酯ART相比，CQDsCu20的IC5q值也远远低于这两种药物，表明其抗癌活性高于这两类药物。[0071]表I:CQDsCu20、Cu2〇和抗癌药物对细胞的1：50值[0072][0073]如表2所列，CQDsCu20对SK0V3细胞的IC5q值远远低于文献报道的MOFs对细胞的IC50值。[0074]表2:其它材料对细胞的1：50值[0077]CQDsCu20诱导SK0V3细胞凋亡[0078]细胞凋亡apoptosis是一种受基因调控的主动性的细胞程序化死亡过程，用丫碇橙和嗅乙啶Α0ΕΒ双重染色后置于荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。染色时，AO是可以透过正常细胞与早期凋亡细胞，进而跟细胞核里的DNA起作用，表现出绿色荧光;EB溴乙锭则只可以透过膜被破坏的细胞，表现出橘红色荧光。活细胞的形貌正常，核染色为绿色；处于早期凋亡的细胞为固缩状形态，核染色质为绿色；晚期凋亡的细胞不仅呈现出固缩状态，而且还有凋亡小体，核染色质为橘红色。[0079]如图7所示，SK0V3细胞在CQDsCu2012·5yg.mL—”作用3h后，细胞生长受到不同程度的抑制，能够看到细胞核被染色后呈黄绿色荧光的早期凋亡细胞。有一部分细胞边缘不规则，染色体固缩，呈橙红色，还有一部分细胞染成橙红色且带有绿色斑点，并伴有凋亡小体的形成，呈现出晚期凋亡特征。如果细胞体积变大，呈现出橙红色荧光，界限不明，并且能够看到凋亡小体，则表明细胞已经坏死。通过Α0ΕΒ染色后，发现CQDsCu20能抑制SK0V3细胞生长，引起细胞损伤，诱导细胞凋亡。SK0V3细胞在Cu2O12.5yg.ml1和CQDs作用3h后，细胞形态变化较小，有一些细胞呈黄绿色荧光，呈现出早期凋亡特征和少量已经坏死的细胞。然而CQDs对细胞的形态和生长几乎没有影响。因此进一步证明CQDsCu20在短时间内就能使SK0V3细胞受损，具有较强的毒性作用。[0080]CQDsCu20作用于SK0V3细胞24h后，经AnnexinV-FITC试剂染色后在流式细胞仪上测定细胞的凋亡情况。如图8所示，对照组SK0V3细胞的早期凋亡率是0.76%，浓度为3.12,6.25，12.5,25yg.mL—1的CQDsCu20作用SK0V3细胞24小时后，对应的早期凋亡率分别是1.37%，1.51%，1.19%，0.88%。对照组细胞的晚期凋亡率是3.5%，经CQDsCu20作用后晚期率分别是12.9%，20.4%，48.4%，80.0%。和对照组比较，实验组早起凋亡细胞变化较小，而晚期凋亡细胞相差很大，并且坏死的细胞较少，进一步证明CQDsCu20能抑制SK0V3细胞生长，诱导细胞处于晚期凋亡状态。[0081]CQDsCu20对SK0V3细胞周期分布的影响[0082]细胞周期包括间期以及分裂期两个时间段，间期又包括有Gl期、S期、G2期。Gl期主要是合成核糖体与RNA，属于DNA合成的前期。S期主要是DAN的合成期，S期的时间为6-8个小时左右，在这个期间DNA大量复制，最后每个染色体会被复制成两个染色单体，促进细胞的增殖。破坏S期过程，G2期就不能有效进行。G2期处在细胞质复制完毕与进行有丝分裂的间隔期，DAN停止合成，大量合成蛋白质以及RNA提供有丝分裂所需要的物质，例如促成熟因子与微管蛋白。分裂期M期），在这个阶段单个细胞分裂为两个子细胞。S期是影响细胞分裂增值的关键时期，这个阶段如果受到影响，细胞的生长就会受到抑制。[0083]CQDsCu20作用于SK0V3细胞24h后，在流式细胞仪上测定细胞周期的分布情况，如细胞周期图9所示，和对照组细胞相比，CQDsCu20使处在S期的细胞比例增加，而G0G1期、G2M期细胞比例变化很小。对照组S期细胞比例为9.24%，细胞经〇0〇8：112〇作用后，3期细胞比例增大。CQDsCu20的浓度从3.12增大至12.Syg.ml1时，S期细胞比例由11.5%提高到23.8%，〇0〇812〇使细胞阻滞于3期，对于彻底抑制肿瘤生长有着重要的意义。〇0〇8：112〇对SK0V3细胞F-actin的影响[0084]肌动蛋白是细胞核内和细胞质的重要蛋白成分，也是细胞骨架微丝的重要成分。在细胞分裂、迀移、细胞生长、DNA损伤修复过程中起着重要的作用。[0085]图10为SK0V3细胞在不同浓度CQDsCu20作用3h后，细胞中F-acin荧光图。从图8可以看出，和对照组相比，浓度为6.25yg.ml1时，细胞中F-acin的荧光开始变弱，浓度为12.5μgml1时，SK0V3细胞变得很小，细胞中F-actin焚光进一步减弱，甚至部分细胞无焚光。当CQDsCu20的浓度增大至SSyg.ml1时，几乎所有细胞只能看到微弱的荧光。随着CQDsCu20浓度的增大，细胞中F-actin荧光强度越来越弱，细胞逐渐变小。因此浓度为12.5yg.ml1时，CQDsCu20已经能够破坏SK0V3细胞的F-actin，使细胞的F-actin荧光减弱。[0086]图11为SK0V3细胞在CQDsCu2〇、CQDs、Cu2O12·5ygmL—3作用3h后，细胞中F-acin荧光图。和对照组相比，CQDsCu20会使细胞的F-acin荧光减弱。CQDs使细胞中肌动蛋白F-actin荧光强度没有明显变化，Cu2O对细胞中肌动蛋白actin的影响远远低于CQDsCu20图11。说明CQDsCu20对SK0V3细胞中的肌动蛋白F-actin的损坏程度远远高于CQDs和Cu20。[0087]CQDsCu20对SK0V3细胞迀移能力的影响[0088]通过体外细胞划痕实验探究了不同浓度的CQDsCu20对SK0V3细胞迀移的影响，结果如图12，0h时对照组和实验组划痕处均无细胞，由0-24h反应过程中，划痕处细胞个数越来越多，加药组的细胞迀移速度远远低于未加药组细胞。反应24h后，对照组划痕处已铺满细胞且细胞生长状况良好，细胞在CQDsCu20作用后，向划痕处迀移的细胞个数低于对照组，迀移能力不如对照组。随着CQDsCu20浓度的增加，向伤口处迀移的细胞数逐渐减少（图13，表明CQDsCu20能够抑制SK0V3细胞迀移。[0089]CQDsCu2〇抑制血管生成[0090]图14为不同浓度CQDsCu20对HUVEC细胞血管生成的影响。对照组细胞在VEGF中反应6小时后生成管网结构，经不同浓度的CQDsCu20作用后，管网的形成受到抑制。增大CQDsCu20反应浓度，抑制作用更加明显，浓度为12.5yg.ml1时，几乎无管网形成。与相同浓度的Cu2O和血管生成抑制剂酪氨酸激酶SU5416相比较，6h后，随着CQDsCu20浓度的增大，管网总长度逐渐变短，当浓度为12.5ygml1时，管网总长度是是Cu2O的二分之一[图16-a]。反应12h后，管网总长度急剧减小，12.5ygml1时，管网总长度是Cu2〇的五分之一；CQDsCu20的血管生成抑制率高于Cu2O和SU5416图17。说明CQDsCu20抑制血管生成作用高于Cu2O和酪氨酸激酶。[0091]CQDsCu20抑制金属基质蛋白酶MMP-2的表达[0092]根据前面的实验结果，CQDsCu20能够抑制细胞迀移和血管生成，通过明胶酶谱方法来分析了CQDsCu20对SK0V3细胞分泌MMP-2能力的影响，图18为CQDsCu20抑制SK0V3细胞MPP-2活力的电泳图。电泳图谱里72kDa蛋白分子量为附近的白色条带即为MPP-2蛋白条带，亮度分别反映了丽P-2的含量。对照组中MPP-2含量较高，经CQDsCu20作用后，随着浓度的增加，MMP-2电泳条带的亮度逐渐变弱。因此和对照组相比，不同浓度CQDsCu20对MMP-2活性具有不同程度的抑制作用。随着CQDsCu20浓度的增大，MPP-2电泳条带的亮度逐渐变弱，表明它能够降低MPP-2蛋白量，即对MMP-2酶活性抑制作用随CQDsCu20浓度的提高而逐渐增强，浓度达到SSyg.ml1时，MPP-2的表达和释放显著降低，抑制作用最强。说明CQDsCu20对抑制细胞MPP-2蛋白表达量呈剂量依赖关系。

权利要求：1.碳量子点氧化亚铜CQDsCu20复合物在抑制癌细胞增殖中的应用。2.碳量子点氧化亚铜CQDsCu20复合物在抑制癌细胞迀移中的应用。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述癌细胞为HeLa、A549、HT-29、SK0V3*BABL-3T3细胞中的至少一种。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述癌细胞为SK0V3细胞。5.碳量子点氧化亚铜CQDsCu20复合物在抑制新血管生成中的应用。6.碳量子点氧化亚铜CQDsCu20复合物在制备治疗癌症的药物中的应用。7.如权利要求1〜6任一所述的应用，其特征在于，所述碳量子点氧化亚铜CQDsCu20复合物中CQDs的质量比为1〜12%。

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