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申请/专利权人：中国科学院生态环境研究中心;国科大杭州高等研究院

摘要：本发明公开了一种无标签人源重组酶蛋白Rad51快速纯化方法，涉及蛋白纯化方法技术领域。本发明提供的无标签人源重组酶蛋白Rad51快速纯化方法，通过质粒构建、原核大肠杆菌低温诱导过表达、样品高压破碎裂解、硫酸铵沉淀、两步层析分离纯化、透析降低盐浓度和浓缩目的蛋白的方法。本发明建立了阴离子交换层析柱HiTrapQHP5mL，cytiva和肝素亲和层析柱HiTrapHeparinHP5mL，cytiva两步层析分离纯化，提供一种通过原核大肠杆菌表达系统获得高纯度90％和链交换活性的无标签人源重组酶蛋白Rad51快速纯化方法，步骤少、成本低，提高了人源重组酶蛋白Rad51的纯化效率。

主权项：1.一种无标签人源重组酶蛋白Rad51快速纯化方法，其特征在于，该无标签人源重组酶蛋白Rad51快速纯化方法包括以下步骤：1利用聚合酶链式反应PCR技术扩增人源重组酶蛋白Rad51基因，采用基因工程技术构建不含标签的原核表达重组质粒；2将步骤1构建的重组质粒转化到重组酶ARecA缺陷的表达型大肠杆菌化学感受态细胞中，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG低温诱导表达人源重组酶蛋白Rad51。3将步骤2诱导表达人源重组酶蛋白Rad51的大肠杆菌溶液经高速冷冻离心机固液分离，去除上清液收集沉淀，将沉淀在裂解缓冲液中重悬，再经低温高压破碎仪处理2次；4将步骤3处理后的裂解液经高速冷冻离心机固液分离，去除沉淀收集上清液，向上清液中加硫酸铵盐析1h，然后经高速冷冻离心机固液分离，去除上清液收集沉淀；5将步骤4处理后的沉淀溶于缓冲液K中，然后采用0.22μm的滤膜进行过滤；6将步骤5处理后的滤液用经流动相K+175mMKCl平衡好的阴离子交换层析柱进行分离纯化，流动相K+1MKCl梯度洗脱收集含人源重组酶蛋白Rad51组分；7将步骤6处理后获得的含人源重组酶蛋白Rad51洗脱液在4℃下于缓冲液HA中透析，得到人源重组酶Rad51蛋白上样液；8将步骤7处理后的含人源重组酶蛋白Rad51溶液用经缓冲液HA平衡好的肝素亲和层析柱进行分离纯化，流动相HB梯度洗脱收集人源重组酶蛋白Rad51洗脱液；9将步骤8处理后的人源重组酶蛋白Rad51洗脱液在4℃下于透析液中透析，透析后即可获得人源重组酶Rad51蛋白储备液；10将步骤9处理后的人源重组酶蛋白Rad51进行链交换活性分析。

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