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申请/专利权人：上海元戊医学技术有限公司

摘要：本发明公开了一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，包含如下步骤：将含有多能干细胞的神经祖细胞培养液铺在细胞培养板上，定向分化培养得到多巴胺能神经祖细胞；该神经祖细胞培养液含有细胞机械传导通路抑制剂；将含有多巴胺能神经祖细胞的神经前体细胞培养液铺在细胞培养板上，定向分化培养得到多巴胺能神经前体细胞；该神经前体细胞培养液含有细胞机械传导通路激活剂。本发明将生化因子添加与细胞机械传导通路调控相结合，在诱导分化的初期，采用小分子药物来抑制细胞机械传导信号通路；在分化的后期，使用小分子药物来激活这一通路，在短时间内获得高纯度、高产量的细胞，适合于生产临床级别的细胞。

主权项：1.一种诱导多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，包含如下步骤：步骤S1，将含有多能干细胞的神经祖细胞培养液铺在细胞培养板上，定向分化培养得到多巴胺能神经祖细胞；所述神经祖细胞培养液包括：神经细胞基础培养基、N2补充剂、不含维生素A的B27补充剂、L-谷氨酰胺、TGF-β信号通路抑制剂SB431542、BMP信号通路抑制剂LDN193189、GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂CHIR99021、音猬因子通路激活剂SAG、细胞机械传导通路抑制剂Y27632；其中，L-谷氨酰胺的浓度为1～5mM；所述TGF-β信号通路抑制剂SB431542的浓度为1～15μM；所述BMP信号通路抑制剂LDN193189的浓度为100～500nM；所述GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂CHIR99021的浓度为0.5-9μM；所述音猬因子通路激活剂SAG的浓度为0.5-2μM；所述细胞机械传导信号通路抑制剂Y27632的浓度为5-15μM；于步骤S1中，包括诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经祖细胞：1第0天，当人多能干细胞成长至汇合度70-80％的时候，确认细胞状态良好后，使用Accutase消化细胞；计数后，接种细胞于玻连蛋白Vitronectin或粘连蛋白Laminin包被的孔板上，细胞密度为40万个细胞cm2；加入新鲜的神经祖细胞培养液；2第1天至第3天，每天更换新鲜的神经祖细胞培养液；3第4天，将之前的培养液吸出，加入新鲜的神经祖细胞培养液，但是不包括细胞机械传导抑制剂Y27632，同时提高培养液中GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂CHIR99021的浓度；4第6天，将之前的培养液吸出，加入新鲜的神经祖细胞培养液，培养液成分跟第4天使用的培养液相同；5第7天，将之前的培养吸出，加入新鲜的神经祖细胞培养液，但是不包括TGF-β信号通路抑制剂SB431542，BMP信号通路抑制剂LDN193189和音猬因子通路激活剂SAG；6第9天，将之前的培养液吸出，加入新鲜的神经祖细胞培养液，培养液成分跟第7天使用的培养液相同；步骤S2，将含有多巴胺能神经祖细胞的神经前体细胞培养液铺在细胞培养板上，定向分化培养得到多巴胺能神经前体细胞；该神经前体细胞培养液包含：神经细胞基础培养基、B27补充剂、L-谷氨酰胺、多巴胺能神经祖细胞生长所需的营养因子、L-抗坏血酸、TGF-β3、GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂、激活剂cAMP、DAPT、细胞机械传导通路激活剂，其中，L-谷氨酰胺的浓度为1～5mM；所述多巴胺能神经祖细胞生长所需的营养因子包括脑源性神经营养因子和神经胶质细胞系衍生的神经营养因子；所述脑源性神经营养因子的浓度为10～50ngmL，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子的浓度为10～50ngmL；所述L-抗坏血酸的浓度为0.1～1mM；所述TGF-β3的浓度为0.5～5ngmL；所述GSK-3β抑制剂也即WNT信号通路激活剂为浓度为2～4μM的CHIR99021；所述激活剂cAMP的浓度为0.2～2mM；所述DAPT浓度为1～15μM；所述细胞机械传导通路激活剂PY-60浓度为1-20μM；于步骤S2中，包括诱导多巴胺能神经祖细胞分化为多巴胺能神经前体细胞：1第10天，将前一天加入的培养液吸出，加入新鲜的神经前体细胞培养液；2第11天，使用Accutase消化细胞30-40分钟，接种于15μgml聚-L-鸟氨酸溶液Polyornithine，PO+1μgmlLaminin+2μgml纤连蛋白Fibronectin包被的孔板上，接种密度为80万个细胞cm2，使用与第10天相同的培养液培养；3第12天，更换新鲜的神经前体细胞培养液，但是不含有GSK-3β抑制剂即WNT信号通路激活剂CHIR99021；另外，在培养液中添加10μMDAPT；4第13天至第14天，每天更换新鲜的神经前体细胞培养液；5收集并低温保存多巴胺能神经前体细胞：在第15天，使用Accutase消化细胞20-40分钟，然后通过孔径为40μm的细胞过滤器以获得单细胞；进行细胞计数，离心，以8百万个细胞毫升的密度重悬于细胞冻存液，然后将细胞分装放入冻存管中；最后，将收集到的细胞保存于低温储存设施中。

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