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申请/专利权人：新加坡科技研究局;新加坡国立大学

摘要：本公开内容提供了在培养中衍生和维持中脑样类器官的方法，包括：a培养多能干细胞以获得神经元谱系类胚体；b培养来自a的所述神经元谱系类胚体以获得中脑区域化组织；c在细胞外基质中包埋和培养来自b的所述中脑区域化组织以获得神经上皮组织；和c培养来自c的所述神经上皮组织以获得中脑样类器官。本文还公开了适用于衍生和维持神经元谱系类胚体的培养基，包含：aTGF‑β抑制剂和或SMAD23抑制剂；和bWNT信号激活剂；适用于衍生和维持中脑区域化组织的培养基，包含：aTGF‑β抑制剂和或SMAD23抑制剂；bWNT信号激活剂；c刺猬信号蛋白；和d成纤维细胞生长因子；适用于衍生和维持神经上皮组织的培养基，包含：a刺猬信号蛋白；和b成纤维细胞生长因子；以及适用于衍生和维持中脑样类器官的培养基，包含：a神经营养因子；b抗坏血酸；和ccAMP依赖性通路的激活剂。

主权项：1.一种衍生和维持人中脑样类器官的方法，包括：a在第一细胞培养基中培养多能干细胞以获得神经元谱系类胚体；b在第二细胞培养基中培养来自a的所述神经元谱系类胚体以获得中脑区域化组织，其中所述中脑区域化组织是对中脑区域特异的组织并且不含FOXG1或GBX2阳性细胞；c在第三细胞培养基中在细胞外基质中包埋和培养来自b的所述中脑区域化组织以获得发育中的神经上皮组织；和d在第四细胞培养基中培养来自c的所述神经上皮组织以获得中脑样类器官，其中所述第一细胞培养基包含：iTGF-β抑制剂，其中所述TGF-β抑制剂是4-[4-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺SB431542；iiSMAD23信号传导抑制剂，其中所述SMAD23信号传导抑制剂是头蛋白；iiiRho激酶ROCK抑制剂，其中所述ROCK抑制剂是1R,4r-4-R-1-氨基乙基-N-吡啶-4-基环己烷甲酰胺Y27632；和ivWNT信号激活剂，其中所述WNT信号激活剂是6-[2-[[4-2,4-二氯苯基-5-5-甲基-1H-咪唑-2-基嘧啶-2-基]氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈CHIR-99021，其中所述第二细胞培养基包含：iTGF-β抑制剂，其中所述TGF-β抑制剂是4-[4-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺SB431542；iiSMAD23信号传导抑制剂，其中所述SMAD23信号传导抑制剂是头蛋白；iiiWNT信号激活剂，其中所述WNT信号激活剂是6-[2-[[4-2,4-二氯苯基-5-5-甲基-1H-咪唑-2-基嘧啶-2-基]氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈CHIR-99021；ivRho激酶ROCK抑制剂，其中所述ROCK抑制剂是1R,4r-4-R-1-氨基乙基-N-吡啶-4-基环己烷甲酰胺Y27632；v刺猬信号蛋白，其中所述刺猬信号蛋白是SHH-C25II；和vi成纤维细胞生长因子，其中所述成纤维细胞生长因子是FGF8，其中所述第三细胞培养基包含：i刺猬信号蛋白，其中所述刺猬信号蛋白是SHH-C25II；和ii成纤维细胞生长因子，其中所述成纤维细胞生长因子是FGF8，并且其中所述第四细胞培养基包含：i神经营养因子，其中所述神经营养因子是脑源性神经营养因子BDNF和神经胶质细胞系衍生的神经营养因子GDNF；ii抗坏血酸；和iiicAMP依赖性通路的激活剂，其中所述cAMP依赖性通路的激活剂是二丁酰基-cAMPdbCAMP。

全文数据：从人多能干细胞产生中脑特异性类器官相关申请的交叉引用本申请要求2016年3月14日提交的新加坡临时申请No.10201601965P的优先权，其内容通过引用整体并入本文用于所有目的。发明领域本发明一般涉及生物技术领域。特别地，本发明涉及产生类器官的方法。背景技术对功能性人脑组织的限制性接触机会是了解人类神经系统发育及其在脑部疾病中功能障碍的最大挑战。最近，人类多能干细胞hPSCs的快速研究进展正在克服这一挑战，hPSC包括例如胚胎干细胞hESCs和诱导的多能干细胞iPSCs，它们可以从任何个体产生，并且可以被引导体外分化成代表所有胚层的衍生物，包括神经元细胞。在过去的几十年中，人类多能干细胞向神经元的分化方案完全基于条件下的二维2D方法，这些方法无法概括发展中的三维3D神经系统的细胞结构或完整的体内神经回路的复杂性和功能性。以前的报告证明了婴儿大脑的产生适合于研究发育障碍。然而，成熟脑类器官的产生仍然具有挑战性。由于在再生医学中以及在鉴定影响中脑多巴胺能mDA神经元的疾病的机制中的兴趣日益增加，从人多能干细胞产生中脑多巴胺能神经元一直是一个激烈的研究领域。然而，它主要使用传统的2D方法产生中脑多巴胺能神经元。虽然这些研究肯定会推动该领域的发展，但尚不清楚是否可以开发出针对中脑的3D类器官模型。因此，需要开发用于产生脑部分的类器官培养物例如皮质类器官、端脑类器官和小脑组织的3D系统。发明内容在一个方面，本发明涉及衍生和维持中脑样类器官的方法，包括：a培养多能干细胞以获得神经元谱系类胚体；b培养来自a的神经元谱系类胚体以获得中脑区域化组织；c在细胞外基质中包埋和培养来自b的中脑区域化组织以获得发育中的神经上皮组织；和培养来自c的神经上皮组织以获得中脑样类器官。另一方面，本发明涉及通过本文公开的方法获得的分离的中脑样类器官。另一方面，本发明涉及用于衍生和维持神经元谱系类胚体的培养基，包含：aTGF-β抑制剂和或SMAD23抑制剂；和bWNT信号激活剂。另一方面，本发明涉及用于衍生和维持中脑区域化组织的培养基，包含：aTGF-β抑制剂和或SMAD23抑制剂；bWNT信号激活剂；c刺猬信号蛋白；d成纤维细胞生长因子。另一方面，本发明涉及用于衍生和维持发育中的神经上皮组织的培养基，包含：a刺猬信号蛋白；和b成纤维细胞生长因子。另一方面，本发明涉及用于衍生和维持中脑样类器官的培养基，包含：a神经营养因子；b抗坏血酸；和ccAMP依赖性通路的激活剂。附图的简要说明当结合非限制性实例和附图考虑时，参考详细说明将更好地理解本发明，其中：图1提供了显示来自人多能干细胞hPSC的人中脑样类器官hMLO的产生和表征的数据。A显示了说明产生人中脑样类器官的总体策略的示意图。微分干涉对比显微镜DIC图像说明了每个阶段细胞的典型形态。SBNC：SB431542、头蛋白和CHIR99021；SF：SHH-C25II和FGF8；BGAC：BDNF、GDNF、抗坏血酸和db-cAMP。比例尺＝500μm。B左：显示在第35天人中脑样类器官的冷冻切片的显微照片图像，对Ki67和MAP2染色。右图：显示图像左部分所示白色框的放大视图的显微图像。左比例尺＝200μm。右比例尺＝10μm。C显示了柱状图，其显示通过荧光激活细胞分选FACS分析定量的第25天和第35天人中脑样类器官中存在的Ki67+和MAP2+细胞的百分比。n＝3，*p20pA，证明人中脑样类器官内的神经元参与网络活动图3G。在人中脑样类器官中记录的神经元用生物胞素标记的回顾性免疫组织化学显示，大多数神经元n＝10个中的8个是TH阳性，表明记录的神经元确实是mDA神经元图3H。为了进一步确定人中脑样类器官中的mDA神经元是否产生细胞外多巴胺，进行了高效液相色谱HPLC测量，发现随着它们成熟进展，人中脑样类器官中多巴胺含量逐渐增加图3I。总之，该数据表明人中脑样类器官中的mDA神经元产生DA，表现出成熟的神经元特性，并且能够与人中脑样类器官中的神经元形成突触。鉴定人中脑样类器官中的而不是小鼠中脑样类器官中的的神经黑色素。在人中脑样类器官的长期培养过程中，从第45天开始，通过光学显微镜可以在人中脑样类器官的表面上观察到稀疏的黑褐色沉积物。这些沉积物的数量随时间逐渐增加图4A。不受理论束缚，假设这些深色沉积物是神经黑色素NM，其为在人和灵长类动物的SN中积累的不溶的黑褐色颗粒状色素。为了证实这一点，人中脑样类器官经石蜡包埋、切片成人中脑样类器官切片、Fontana-Masson染色以进行神经黑色素检测。发现这些沉积物对Fontana-Masson染色确实是阳性的图4B、图7A和图7B。在图4B中，在神经元细胞溶质中观察到大的、粗糙的、黑色染色的颗粒可能是神经黑色素，并且可以观察到这些颗粒中的一些大小为2μm至3μm在神经元细胞外，表明这些神经黑色素可以从人中脑样类器官中的hDA神经元分泌出图4B。相反，Fontana-Masson染色未能在体外在相当的天数从2D培养的人诱导的DA神经元检测到阳性颗粒数据未显示。鉴于神经黑色素是作为mDA神经元中DA合成的副产物合成的，外源性多巴胺前体L-DOPA的添加被理解为加速神经黑色素在较年轻的人中脑样类器官中的积累。实际上，在第35天用来自人中脑样类器官的L-DOPA50μM处理的人中脑样类器官中观察到神经黑色素样颗粒的强烈分布，而在同一天的未处理的人类中脑样类器官中未观察到神经黑色素样颗粒图4C。为了检查含有神经黑色素的细胞是否TH阳性细胞，使用来自相同的人中脑样类器官的相邻切片进行免疫染色。因此，在同一人中脑样类器官中观察到来自显示为Fontana-Masson染色阳性的区域的TH阳性细胞图4D。神经黑色素样颗粒主要在灵长类动物中观察到，但在小鼠中没有观察到。在小鼠胚胎干细胞衍生的中脑样类器官中没有观察到神经黑色素样颗粒，该小鼠胚胎干细胞衍生的中脑样类器官在体外在相当的天数含有高百分比的TH阳性神经元图4D。此外，在来自同一人类胚胎干细胞系H1系的人脑类器官中可能没有检测到Fontana-Masson染色阳性颗粒图7B，表明只有在三维培养中生长的mDA神经元才能原位产生神经黑色素样颗粒。总之，已经证明人类胚胎干细胞聚集体可以被转向分化成中脑祖细胞，最终自组织成包含具有功能性mDA神经元的三个不同层的3D人中脑样类器官。发现只有3D中脑样类器官中的人mDA神经元才能产生神经黑色素样颗粒，而2D培养中的人mDA神经元或3D中脑样类器官中的小鼠mDA神经元不能产生神经黑色素样颗粒图4D。最近，通过使用合成的多巴胺黑色素代替天然的多巴胺黑色素，研究了NM与小神经胶质细胞诱导的神经炎症导致的PD中DA神经元的易损性的关联。本文说明性描述的发明可以在缺少本文未具体公开的任何要素，限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包括”，“包含”，“含有”等应当被广泛地解读而不受限制。另外，这里使用的术语和表达已被用作描述的术语而非限制，并且无意使用这些术语和表达来排除所示和所述特征的任何等同物或其部分，但应认识到在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应该理解，尽管已经通过优选实施例和任选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用本文公开的发明的修改和变化，并且这些修改和变化被认为在本发明的范围内。在此广泛和一般地描述了本发明。落入一般公开内容中的每个较窄物种和亚属组群也构成本发明的一部分。这包括具有从该属中去除任何主题的附带条件或否定限制的本发明的一般描述，无论是否在本文中具体叙述了被切除的材料。其他实施方案在以下权利要求和非限制性实施例内。另外，在根据马库什群组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也因此以马库什群组的任何单个成员或成员子群的形式描述。实验部分hESCs的培养使用人胚胎干细胞系hESCH1系WA01，第30代和H9系WA09，第25代。在无饲养细胞条件下在mTeSR培养基StemcellTechnologies中在包被基底膜基质的6孔板BDBiosciences上在37℃在5％湿润的CO2培养箱中维持人胚胎干细胞。每天更换培养基，并使用1mgmlDispaseStemcellTechnologies每5天分离人胚胎干细胞培养物。所有人胚胎干细胞系均被证实对支原体污染呈阴性并且表现出正常的核型。可商购的人胚胎干细胞ESC系H1和H9；WiCell研究所用于参考实验。这些细胞系由人胚胎的内细胞团建立。据了解，所有与这些细胞系有关的信息都是公开的参见例如Jamesetal.,1998，以及https:www.wicell.orghomestem-cell-linescatalog-of-stem-cell-lineswa01.cmsx和https:www.wicell.orghomestem-cell-linescatalog-of-stem-cell-lineswa09.cmsx在线提供的信息。产生人中脑样类器官为了产生人中脑样类器官，使用少于40代的人胚胎干细胞系。用TrypLEExpressLifeTechnologies将人胚胎干细胞从完整的克隆解离为单细胞，并在具有V底锥形孔SumitomoBakelite的低细胞粘附96孔培养板的每个孔中铺板10,000个细胞以在神经元诱导培养基中形成均一的EB，神经元诱导培养基含有DMEMF12：Neurobasal1：1、1：100N2补充剂Invitrogen、1：50不含维生素A的B27Invitrogen、1％GlutaMAXInvitrogen、1％最小必需培养基-非必需氨基酸Invitrogen和0.1％β-巯基乙醇Invitrogen、补充有1μgml肝素Sigma-Aldrich、10μMSB431542Stemgent、200ngml头蛋白Prospec、0.8μMCHIR99021ReagentsDirect和10μMROCK抑制剂Y27632Calbiochem。最初48小时加入ROCK抑制剂，第2天更换神经元诱导培养基。在第4天，加入100ngmlSHH-C25IIR&；DSystems和100ngmlFGF8R&；DSystems培养人中脑样类器官，用于中脑图案化。3天后，人中脑样类器官开始挤出神经外胚层芽，完全除去培养基并立即通过使用预先冷却的200μl移液管头移液在每个孔中加入30μl生长因子降低的基底膜基质。将基底膜基质包埋的中脑样类器官放入37℃培养箱中30分钟以使基底膜基质凝固，并在含有Neurobasal、1：100N2补充剂Invitrogen、1：50不含维生素A的B27Invitrogen、1％GlutaMAXInvitrogen、1％最小必需培养基-非必需氨基酸Invitrogen和0.1％β-巯基乙醇Invitrogen，补充有2.5μgml胰岛素Sigma-Aldrich、200ngml层粘连蛋白Sigma-Aldrich、100ngmlSHH-C25IIR&DSystems和100ngmlFGF8R&DSystems的组织生长诱导培养基中生长24小时。一旦hMLO被包埋在基底膜基质中，类器官开始形成更多扩张的神经上皮。为了促进生长和分化，通过使用经切割的1000μl移液管头移液将hMLO转移到超低附着6孔板Costar上含有Neurobasal、1：100N2补充剂Invitrogen、1：50不含维生素A的B27Invitrogen、1％GlutaMAXInvitrogen、1％最小必需培养基-非必需氨基酸Invitrogen、0.1％β-巯基乙醇Invitrogen、10ngmlBDNFPeprotech、10ngmlGDNFPeprotech、100μM抗坏血酸Sigma-Aldrich和125μMdb-cAMPSigma-Aldrich的最终分化培养基中。使用定轨振荡器培养人中脑样类器官以增强营养和氧气的交换。在培养基中包括抗生素100Uml青霉素G、100μgml链霉素以防止潜在的细菌污染以进行长期培养。培养基每3天更换一次。免疫组化将人中脑样类器官在4％多聚甲醛PFA中固定过夜，在磷酸盐缓冲盐水PBS中洗涤，在PBS中的30％蔗糖溶液中于4℃温育过夜，随后包埋在O.C.T化合物SakuraFinetek中用于冷冻切片。冷冻的人中脑样类器官以16μm厚度冷冻切片。对于免疫组织化学，用封闭缓冲液含有3％牛血清白蛋白BSA和0.5％TritonX-100的PBS在室温下封闭冷冻切片的人中脑样类器官1小时。然后用在缓冲液含有1％BSA和0.1％TritonX-100的PBS中稀释的一抗对切片染色，并在室温下用PBS中的二抗染色1小时。所有切片用DAPI15000，Sigma-Aldrich复染，并用Aqua-mountThermo固定或保持在PBS中，避光。在LSM710共聚焦显微镜或ObserverZ.1倒置显微镜Zeiss上拍摄图像。表4中描述了一抗和二抗。RNA提取、逆转录、实时RT-PCR和RNA-seq制备使用TRIzol试剂Invitrogen从hMLO、2D-DA神经元或未分化的hESC分离总RNA。用DNASEIAmbion消化DNA污染物，并使用SuperScriptII试剂盒Invitrogen逆转录500ngRNA以产生cDNA。使用ViiA7实时PCR系统AppliedBiosystem进行定量RT-PCR。应用ΔΔCt方法将每个基因的表达水平标准化为GAPDH的表达水平。使用的引物先前进行测试以确保特定的解链曲线，并且另外通过使用由人神经元样品ScienCell制备的人cDNA文库进行验证。对于hMLO和2D-DA神经元的RNA-seq文库制备，通过柱PuelinkRNAMinikit，Ambion进一步纯化总RNA，并根据制造商的方案使用4μg总RNA来制备TruSeqRNASamplePreparationKitv2,Illumina。样品被多重化并被测序单读取150bp配对末端HiSeq2000，Illumina。人脑解剖使用手术刀和手持式牙钻在目视检查下从妊娠中期胎儿脑干切开中脑的腹侧半部分表3。病例是母亲知情同意捐献的，并基于肉眼的大脑检查中没有任何先天性解剖异常以及产前检查中未发现任何主要遗传缺陷进行选择。IRB批准来自WesternIRB，这是一个被美国许多独立机构使用的私人且经过充分认证的IRB：地址：101939thAvenueSESuite120,Puyallup,WA98374-2115。研究编号：1126332。WIRB协议号：20111080。批准到期：2016年7月18日。死后大脑：RNA提取和测序此前已描述了死后RNA提取和测序以及RNA-seq数据处理的细节Jaffeetal.,2015。从胎儿脑获得腹侧中脑的死后组织匀浆。RNA提取后，使用AgilentTechnologiesBioanalyzer2100的高分辨率毛细管电泳测量RNA质量，并获得所有10个样品的RNA完整值RNAintegritynumber，RIN。核糖体RNA去除depeletionRiboZero与链特异性文库制备和QC使用IlluminaTruSeqStrandedTotalRNARibo-ZerosamplePrepKit按照制造商的方案构建RNA-seq文库。使用Ribo-zero珠从经约800ngDNA酶处理的总RNA中去除核糖体RNA。纯化后，在升高的温度94℃下使用二价阳离子持续2分钟，将不含核糖体RNA的总RNA片段化成小片。在此条件下，片段长度范围为130-290bp，中值长度为185bp。使用逆转录酶和随机引物将切割的RNA片段复制成第一链cDNA。使用DNA聚合酶I和RnaseH，以dUTP代替dTTP合成第二链cDNA。然后使用T4DNA聚合酶、T4PNK和KlenowDNA聚合酶对这些cDNA片段进行末端修复过程，并使用Klenowexo3'至5'exominus添加单个'A'碱基，然后使用T4DNA连接酶连接IlluminaPE连接子。将指标96个独特的双指标对插入Illumina连接子中，以便在必要时可以在8泳道流通池的一个泳道中对多个样品进行测序。然后将这些产物纯化并用15个PCR循环富集以产生最终cDNA文库，用于使用H100碱基对配对末端读数和IlluminaHiSeq3000进行高通量DNA测序，每个样品靶向约100M的测序片段reads。通过QubitInvitrogen，CA测量RNA文库的浓度。使用HTDNA1K12KHiSensLabchip通过LabChipGXCaliper，MA测量RNA-seq文库的质量。生物信息学分析使用GENCODERelease19版本的基因注释，用TopHat2-2.0.12Kimetal.,2013将RNA-Seq数据针对人类基因组版本hg19作图。R-3.1.2Team,2014和Bioconductor3.0Gentlemanetal.,2004用于RNA-Seq分析。使用RpackageGenomicAlignmentsmode＝'Union'，inter.feature＝FALSELawrenceetal.,2013计数测序片段，仅保留主要测序片段的比对。使用DESeq2Loveetal.,2014计算计数的Rlog转换值和差异表达。对于上调和下调基因，我们分别使用调整后的p值阈值0.0005和对数倍数变化阈值2-2。使用ggplot2_1.0.0Wickham,2009创建覆盖图图2E和图2F和PCA图6F。将来自GTEx项目的成人脑RNA-Seq数据Consortium,2015用作比较。为了绘制热图中的基因表达，通过倍数变化对基因进行分类，并且通过减去平均值并除以标准偏差来标准化每个基因的表达评估分布以用于可视化。流式细胞术对于细胞内染色，将细胞固定并用转录因子染色缓冲液组eBioscience透化。简而言之，首先用TrypLETMExpressGibco解离细胞，离心并将细胞沉淀重悬于1ml1×固定透化缓冲液中，在黑暗中于4℃持续30分钟。在不洗涤以使细胞损失最小化的情况下，向细胞悬浮液中加入2ml1×透化缓冲液并将样品离心。滗析上清液，并在室温用100μl透化缓冲液中的抗体将样品染色1小时。最后，将300μl染色缓冲液加入细胞悬浮液中直至分析。通过具有细胞过滤器BDBiosciences的BDFalcon12×75mm管过滤细胞。使用BDLSRFortressaTMX-20BDBiosciences进行流式细胞术分析，并且所有数据由FlowJo软件表示。用两个阴性对照样品定义负阈值门用单独的二抗体染色的解离的hMLO细胞和用一抗和二抗二者染色的hESC。多巴胺能神经元诱导2D方法按照基于底板的神经诱导方案进行DA神经元分化Kriksetal.,2011。将hESC以35×103个细胞cm2铺板，并在含有DMEM、15％KSR、2mML-谷氨酰胺和10μMβ-巯基乙醇，添加有100nMLDN193189Stemgent和10μMSB431542的基底培养基1中在基底膜基质上生长24小时。在第1天，将培养基更换为添加有100nMLDN193189、10μMSB431542、100ngmlSHH-C25II、2μM嘌呤胺Stemgent和100ngmlFGF8的基底培养基1，持续2天。在第3天，添加3μMCHIR99021改变培养基。至第5天，如前所述，将培养基逐渐转移至含有DMEM、N2补充剂、2mML-谷氨酰胺和10μMβ-巯基乙醇基底培养基2的N2培养基中持续2天Chambersetal.,2009。在第11天起，将含有NeurobasalB27L-谷氨酰胺Invitrogen基地培养基3更换为补充有3μMCHIR99021，持续2天。之后，使用补充有10μMDAPTSigma-Aldrich、0.2mM抗坏血酸、20ngmlBDNF、20ngmlGDNF、0.2mMdb-cAMP和1ngmlTGF-β3Invitrogen的基底培养基3直至20天，每隔一天更换一次培养基。在第20天，将细胞用0.05％胰蛋白酶-EDTA解离，以高细胞密度每平方厘米300-400×103个细胞重新铺板在预包被有0.1mgml聚赖氨酸和1μgml层粘连蛋白的皿中。细胞在含有10μMDAPT、0.2mM抗坏血酸、20ngmlBDNF、20ngmlGDNF、0.2mMdb-cAMP和1ngmlTGF-β3的NeurobasalB27培养基中生长，每隔一天更换新鲜培养基直至如所示的实验分析。产生脑器官使用与Lancaster等人相同的方案产生脑类器官LancasterandKnoblich,2014；Lancaster等，2013。简而言之，用TrypLETMExpress解离hESC，将10,000个细胞平铺在具有V底锥形孔的低细胞粘附96孔培养板的每个孔中以形成DMEMF12和20％Knockout血清替代物Gibco、1％GlutaMaxInvitrogen、1％NEAAInvitrogen、0.1％β-巯基乙醇Invitrogen、4ngml的bFGFInvitrogen和20μMROCK抑制剂Y27632Calbiochem中的EB。在第6天，将EB转移至低粘附24孔板中含有DMEMF12、1：100N2补充剂Invitrogen、1％GlutaMaxInvitrogen、1％NEAAInvitrogen和1μgml肝素Sigma-Aldrich公司的神经诱导培养基中。在第11天EB开始形成神经上皮，并转移到带有小凹坑的Parafilm片上的基底膜基质BDBioscience包埋中。基底膜基质液滴在37℃固化，并在含有以下的分化培养基中生长以允许静止增长：DMEMF12：Neurobasal1：1、1：100N2补充剂Invitrogen、1：50不含维生素A的B27Invitrogen、1％GlutaMAXInvitrogen、1％NEAAInvitrogen、0.1％β-巯基乙醇Invitrogen、2.5μgml胰岛素Sigma-Aldrich和100Uml青霉素G、100μgml链霉素Gibco-BRL。在第15天，将液滴转移到超低附着6孔板Costar上在分化培养基中含有B27补充剂和维生素AInvitrogen的分化培养基中。大脑类器官在定轨振荡器上培养。每3天更换一次培养基。神经黑色素染色Fontana-Masson染色将人中脑样类器官在4％多聚甲醛PFA中固定过夜，在PBS中洗涤，包埋在石蜡块中，随后切成4μm厚。接下来，将hMLOsections脱石蜡，用蒸馏水水合，并根据制造商的方案用Fontana-Masson染色试剂盒Abcam染色Carrieletal.,2011。简而言之，将切片置于氨性银溶液中并在58℃至60℃水浴中孵育30至60分钟，直至组织切片变为黄色棕色。用蒸馏水洗涤组织切片，并在氯化金溶液0.2％中孵育30秒。接下来，将切片在氯化金溶液0.2％中孵育30秒，随后与硫代硫酸钠溶液5％一起温育2分钟。最后，将切片在核快红溶液中孵育5分钟以进行染色和固定。在LSM710共聚焦显微镜或ObserverZ.1倒置显微镜Zeiss上拍摄图像。神经黑色素的分离和定量将NM颗粒阳性的hMLO在具有1.5mlpH7.4磷酸盐缓冲液50mM的玻璃管中匀浆，然后以12,000g离心30分钟。将得到的沉淀用pH7.4磷酸盐缓冲液洗涤两次，然后在37℃使用振荡器用1.5ml含有十二烷基硫酸钠5mgml和0.2mgml蛋白酶KFermentas的Tris缓冲液50mM，pH7.4重悬浮3小时。随后将重悬的NM颗粒以12,000g离心30分钟，然后用NaCl9mgml洗涤两次，并用蒸馏水洗涤两次。为了定量NM颗粒，将NM颗粒在80℃溶解于1ml的1MNaOH中1小时，以通过分光光度计350nm测量NM。离心溶液并收集上清液。对于通过AFM和SEM对NM结构的成像，将沉淀用1.5ml甲醇和1ml己烷洗涤。最后，通过冷冻干燥Bushetal.,2006；Zeccaetal.,2002。原子力显微镜AFM在该测量中，使用商业AFM系统NX-Bio，ParkSystemsCorp.，Korea。安装在AFM头上的Z扫描仪使探头在样品表面上移动时可以保持恒定的反馈条件力或距离。它还与商用倒置光学显微镜Tieclipse，Nikon，Japan相结合，使得可以轻松检测样品和AFM探针位置。所有图像均在室温于空气条件中使用AFM接触模式进行。扫描面积为2×2μm2，分辨率为256×256像素。同时收集高度和偏转图像，扫描速率为0.8-1.2Hz。为了获得可靠的图像，我们使用非常柔软的商用Si悬臂CSG-01，NT-MDT，Russia，用UV臭氧清洁剂清洁15分钟。通过测量探针的热波动来评估探针的弹簧常数0.06Nm和共振频率12kHz。对于AFM成像，通过移液管将NM溶液5μl滴加到清洁和切割的云母表面上来制备NM样品。将云母表面上的NM样品储存并在黑暗条件下干燥，直至NM完全干燥。扫描电子显微镜SEM在SEM分析之前，对NM样品实施如上所述的用于AFM样品制备的程序。然后使用AutoFineCoaterJEOLJFC-1600，Japan在20mA用10nm厚的金层溅射涂覆预干燥的样品50秒，并且使用配备有加热电压为5.0kV的冷阴极发射器的场发射扫描电子显微镜JEOL6340F，Japan处理SEM图像。单细胞基因表达分析通过TrypLETMExpress将120天至150天的hMLO解离成单细胞，并通过具有细胞过滤器的BDFalcon12×75mm管过滤细胞。为了收集含有NM的细胞，基于使用激发激光355nm和过滤器53030检测，使用BDFACSAriaIIBDBioscience将细胞直接分选到装有5μl逆转录特异性靶扩增溶液LifeTechnologies的96孔PCR板中Nighswander-Rempeletal.,2005。对于阳性对照，将2D分化的DA神经元悬浮并直接用相同的FACS仪器置于96孔PCR板中。在具有20个循环的预扩增的热循环仪中进行逆转录RT特异性靶扩增，并且通过核酸外切酶1NewEnglandBioLabs处理消化未使用的引物，然后在分析之前将样品稀释3倍。通过qRT-PCR验证96孔PCR板中的预扩增产物GAPDH、MAP2和TH的表达，并且除去了显示弱表达或不表达这些基因的细胞。为了表征hMLO中的mDA神经元，分析了除那些细胞之外的细胞。根据制造商的说明，使用具有低ROXBio-Rad的2XSsoFastEvaGreenSupermix和在Biomark系统Fluidigm上的96×96动态阵列中的单个qPCR引物分析这些样品。使用BioMark实时PCR分析软件Fluidigm计算Ct值。结果表示为通过图7N和图7O中的颜色编码的Ct值的热图。每个引物对被设计和验证以确保特定的解链曲线并且另外通过使用商业参考样品[从人神经元制备的人cDNA文库ScienCell]进行评估。电生理学全细胞膜片钳记录技术用于测量人中脑样类器官中神经元的内在特性。将每个人中脑样类器官置于室中，并浸没在连续灌注的在30℃至32℃用95％O2和5％CO2饱和的人工CSFaCSF下。用细胞内溶液填充贴片移液管2至4MΩ，该细胞内溶液含有以mM计：甲磺酸钾135、KCl10、HEPES10、EGTA1Na2ATP2；290mOsm；用KOH将pH调节至7.2-7.4。使用IR-DIC可视化技术和OlympusBX51WI直立显微镜，使用×60水浸透镜进行全细胞记录。使用MultiClamp700B放大器记录信号，使用贝塞尔滤波器以3kHz过滤，并使用Digidata1322A模拟-数字AD板MolecularDevices，Sunnyvale，CA以10kHz数字化。为了测量Na+电流和K+电流，施加电压阶跃500毫秒持续时间，从-70mV的保持电位到-50mV至+90mV10mV增量的测试电位范围。对于兴奋性测试，注入一系列增幅5pA步长的电流脉冲500毫秒以产生电流发射频率关系。在-70mV的保持电位收集自发兴奋性突触后电流sEPSC。通过位于距hMLO内的记录神经元约300μm的钨丝电极诱导诱发兴奋性突触后电流eEPSCs。高效液相色谱HPLC将单个人中脑样类器官或人皮质球体hCO在100μl0.5N高氯酸中匀浆，离心，并通过0.1mm过滤器Millipore过滤。仅将得到的上清液加载到HPLC系统ThermoScientific中。多巴胺的流动相用12.5％乙腈缓冲液pH3.0，90mM磷酸二氢钠一水合物、50mM柠檬酸、2.1mM1-辛磺酸盐一水合物和0.1mMEDTA运行。使用DionexCoulochemIII电化学检测器以通过定制程序测定多巴胺水平，灵敏度范围为2-10nA。然后结果通过细胞计数的归一化和峰读数转换为数值表达来分析。统计分析所有实验以至少一式三份进行，结果表示为平均值±标准误差。使用单向ANOVA检验进行统计学分析，然后如果需要，进行学生t检验。p新加坡科技研究局从人多能干细胞中产生中脑特异性类器官9869SG4380112PatentInversion3.5124DNA人工序列GAPDH正向引物1caagatcatcagcaatgcctcctg24222DNA人工序列GAPDH反向引物2gcctgcttcaccaccttcttga22320DNA人工序列OCT4正向引物3gtggaggaagctgacaacaa20420DNA人工序列OCT4反向引物4attctccaggttgcctctca20521DNA人工序列NANOG正向引物5tttgtgggcctgaagaaaact21621DNA人工序列NANOG反向引物6agggctgtcctgaataagcag21721DNA人工序列PAX6正向引物7tccacccggcagaagattgta21821DNA人工序列PAX6反向引物8tgtctcggatttcccaagcaa21921DNA人工序列SOX1正向引物9gaacgccttcatggtgtggtc211021DNA人工序列SOX1反向引物10tgtaatccgggtgctccttca211121DNA人工序列OTX2正向引物11ccagacatcttcatgcgagag211221DNA人工序列OTX2反向引物12ggcaggtctcactttgttttg211320DNA人工序列CORIN正向引物13aatcccacaacagagcatcg201420DNA人工序列CORIN反向引物14ggagcagttgacctcgtcag201520DNA人工序列FOXA2正向引物15ggggtagtgcatcacctgtt201620DNA人工序列FOXA2反向引物16ccgttctccatcaacaacct201719DNA人工序列MAP2正向引物17cgaagcgccaatggattcc191822DNA人工序列MAP2反向引物18tgaactatccttgcagacacct221922DNA人工序列TH正向引物19tgtctgaggagcctgagattcg222020DNA人工序列TH反向引物20gcttgtccttggcgtcactg202120DNA人工序列PITX3正向引物21ccaaccttagtccgtgccag202220DNA人工序列PITX3反向引物22tgtgtagggcctagtccacc202320DNA人工序列EN1正向引物23tctcgctgtctctccctctc202420DNA人工序列EN1反向引物24cgtggcttactccccattta202519DNA人工序列EN2正向引物25ccggcgtgggtctactgta192622DNA人工序列EN2反向引物26cctctttgttcgggttcttctt222720DNA人工序列NURR1正向引物27gctggactccccattgcttt202820DNA人工序列NURR1反向引物28cggagctgtattctcccgaa202921DNA人工序列LMX1A正向引物29acgtccgagaaccatcttgac213019DNA人工序列LMX1A反向引物30caccaccgtttgtctgagc193119DNA人工序列LMX1B正向引物31cggactgcgccaagatgtt193220DNA人工序列LMX1B反向引物32ttgactcgcatcaggaagcg203321DNA人工序列DDC正向引物33attcatctgccctgagttccg213421DNA人工序列DDC反向引物34ccaatagccatttgtggggat213520DNA人工序列ALDH1A1正向引物35ccgtggcgtactatggatgc203622DNA人工序列ALDH1A1反向引物36gcagcagacgatctctttcgat223722DNA人工序列ALDH1A2正向引物37gggtgtgttcttcaatcaaggt223819DNA人工序列ALDH1A2反向引物38tggtggggtcaaagggact193920DNA人工序列GIRK2正向引物39cacatcagccgagatcggac204021DNA人工序列GIRK2反向引物40ggtagcgataggtctccctca214121DNA人工序列KCNS3正向引物41aggagctgtgcgtattctcat214221DNA人工序列KCNS3反向引物42cttgcgttcctggtagcgatt214319DNA人工序列SOX6正向引物43agggagtcttgccgatgtg194422DNA人工序列SOX6反向引物44caggctctcaggtgtaccttta224523DNA人工序列OXR1正向引物45ttcgaccaaacctaagtgatccc234622DNA人工序列OXR1反向引物46ggggtgtctaaacctgtcattg224720DNA人工序列SNCG正向引物47tgagcagcgtcaacactgtg204820DNA人工序列SNCG反向引物48gaggtgaccgcgatgttctc204923DNA人工序列SATB1正向引物49agagctgtcagtggaaggaaaca235024DNA人工序列SATB1反向引物50gtggcactgttgaacgaaacaaat245119DNA人工序列ZDHHC2正向引物51tcccggtggtgttcatcac195222DNA人工序列ZDHHC2反向引物52caacttgttcgccagtgttttc225319DNA人工序列RAB3C正向引物53ggaagacgagcgggtcatc195423DNA人工序列RAB3C反向引物54ctctctgacattttgtcgcagat235521DNA人工序列FGF1正向引物55acaccgacgggcttttatacg215621DNA人工序列FGF1反向引物56cccattcttcttgaggccaac215721DNA人工序列GAD1正向引物57gcggaccccaataccactaac215821DNA人工序列GAD1反向引物58cacaaggcgactcttctcttc215922DNA人工序列CALB1fowardprimer59tgtggatcagtatgggcaaaga226023DNA人工序列CALB1反向引物60ctcagtttctatgaagccactgt236119DNA人工序列CALB2正向引物61agcgccgagtttatggagg196221DNA人工序列CALB2反向引物62tggtttgggtgtattcctgga216319DNA人工序列TACR3正向引物63ctctggtccctggcgtatg196422DNA人工序列TACR3反向引物64tgaagcgcgtagatgaaattga226520DNA人工序列CARTPT正向引物65ccgagccctggacatctact206623DNA人工序列CARTPT反向引物66atgggaacacgtttactcttgag236720DNA人工序列VGF正向引物67cgctgacccgagtgaatctg206819DNA人工序列VGF反向引物68catacgcgcctggaattga196924DNA人工序列VIP正向引物69ccaaaacaaaccagaacagtcagc247023DNA人工序列VIP反向引物70tgagaagagtcaggagcacaagg237121DNA人工序列LPL正向引物71tcattcccggagtagcagagt217219DNA人工序列LPL反向引物72ggccacaagttttggcacc197321DNA人工序列EFNB3正向引物73ctcggcgaataagaggttcca217420DNA人工序列EFNB3反向引物74gtgaagcggagatccaggtc207519DNA人工序列EGR1正向引物75ggtcagtggcctagtgagc197620DNA人工序列EGR1反向引物76gtgccgctgagtaaatggga207723DNA人工序列FZD1正向引物77atcgaagccaactcacagtattt237819DNA人工序列FZD1反向引物78cacgttgttaagccccacg197919DNA人工序列ADCYAP1正向引物79ccactcggacgggatcttc198022DNA人工序列ADCYAP1反向引物80gccgccaagtatttcttgacag228121DNA人工序列SDC2正向引物81tggaaaccacgacgctgaata218222DNA人工序列SDC2反向引物82ataactccaccagcaatgacag228322DNA人工序列NEFM正向引物83gaaatcgctgcgtacagaaaac228421DNA人工序列NEFM反向引物84taatggctgtcagggcctctt218523DNA人工序列LRRK2正向引物85ttttgatgccatgcactcatttc238623DNA人工序列LRRK2反向引物86ggaatcgctagggaatgtaaaca238721DNA人工序列PARK2正向引物87cccacctctgacaaggaaaca218821DNA人工序列PARK2反向引物88tcgtgaacaaactgccgatca218919DNA人工序列PARK7正向引物89aaccggaagggcctgatag199021DNA人工序列PARK7反向引物90gcaagagggtgtgttgtaact219123DNA人工序列SNCA正向引物91aagagggtgttctctatgtaggc239222DNA人工序列SNCA反向引物92gctcctccaacatttgtcactt229321DNA人工序列NCAM正向引物93ggctccttggactcatctttc219421DNA人工序列NCAM反向引物94gacatcacctgctacttcctg219523DNA人工序列MAPT正向引物95gaagattgggtccctggacaata239620DNA人工序列MAPT反向引物96aggtcagcttgtgggtttca209724DNA人工序列GAD2正向引物97caaacatttatcaacatgcgcttc249821DNA人工序列GAD2反向引物98ctatgacactggagacaaggc219922DNA人工序列VGAT正向引物99agatgatgagaaacaaccccag2210020DNA人工序列VGAT反向引物100cacgacaagcccaaaatcac2010122DNA人工序列DLX5正向引物101acagagacttcacgactcccag2210220DNA人工序列DLX5反向引物102tgtggggctgctctggtcta2010325DNA人工序列DLX6正向引物103tggtgaaagagaagcattttggact2510424DNA人工序列DLX6反向引物104agagaagggctgttatgtgaggaa2410520DNA人工序列SERT正向引物105tgctggcttttgctagctac2010620DNA人工序列SERT反向引物106gaagctcgtcatgcagttca2010721DNA人工序列TPH2正向引物107atggctcagatcccctctaca2110821DNA人工序列TPH2反向引物108ggatccgcaagtagtggaaca2110920DNA人工序列VGLUT1正向引物109tcaagtccccgattccgtgc2011022DNA人工序列VGLUT1反向引物110tgcgattttggttgtttcccca2211120DNA人工序列VGLUT2正向引物111tggggctacatcatcactca2011220DNA人工序列VGLUT2反向引物112gaagtatggcagctccgaaa20

权利要求：1.一种衍生和维持中脑样类器官的方法，包括：a培养多能干细胞以获得神经元谱系类胚体；b培养来自a的所述神经元谱系类胚体以获得中脑区域化组织；c在细胞外基质中包埋和培养来自b的所述中脑区域化组织以获得发育中的神经上皮组织；和d培养来自c的所述神经上皮组织以获得中脑样类器官。2.根据权利要求1所述的方法，其中，在第一细胞培养基中培养步骤a中的所述多能干细胞，其中所述第一细胞培养基包含：aTGF-β抑制剂和或SMAD23抑制剂；bWNT信号激活剂。3.根据权利要求1所述的方法，其中，在第二细胞培养基中培养步骤b的所述神经元谱系类胚体，其中所述第二细胞培养基包含：aTGF-β抑制剂和或SMAD23抑制剂；bWNT信号激活剂；c刺猬信号蛋白；和d成纤维细胞生长因子。4.根据权利要求1所述的方法，其中，在第三细胞培养基中培养步骤c的所述中脑区域化组织，其中所述第三细胞培养基包含：a刺猬信号蛋白；和b成纤维细胞生长因子。5.根据权利要求1或4中任一项所述的方法，其中所述细胞外基质促进细胞分化和或可维持三维培养和或促进复杂组织的发育，并且所述细胞外基质由选自由以下组成的组的物质制成：基底膜基质、明胶、甲基纤维素、胶原、藻酸盐、藻酸盐微球、琼脂糖、纤维蛋白、纤维蛋白胶、纤维蛋白原、血浆纤维蛋白珠、全血浆或其组分、层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白多糖、HSP、壳聚糖、肝素、其他合成聚合物或聚合物支架和固体支撑材料。6.根据权利要求1所述的方法，其中，在第四种细胞培养基中培养步骤d的所述神经上皮组织，其中所述第四种细胞培养基包含：a神经营养因子；b抗坏血酸；和ccAMP依赖性通路的激活剂。7.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述TGF-β抑制剂和或SMAD23抑制剂选自由以下组成的组：4-[4-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺SB431542、1R,4r-4-R-1-氨基乙基-N-吡啶-4-基环己烷甲酰胺ROCK抑制剂Y27632及其衍生物。8.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述WNT信号激活剂是GSK3抑制剂。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述GSK3抑制剂是CHIR-990216-[2-[[4-2,4-二氯苯基-5-5-甲基-1H-咪唑-2-基嘧啶-2-基]氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈或其衍生物。10.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述刺猬信号蛋白选自由以下组成的组：沙漠刺猬因子同源物DHH、印度刺猬因子同源物IHH和音猬因子SHH。11.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述成纤维细胞生长因子是FGF8。12.根据权利要求6所述的方法，其中所述神经营养因子选自以下组成的组：神经营养蛋白、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子家族配体GFL和神经生成细胞因子。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述神经营养蛋白选自以下组成的组：神经生长因子NGF、脑源性神经营养因子BDNF、神经营养蛋白-3NT-3和神经营养蛋白-4NT-4。14.根据权利要求12所述的方法，其中所述GFL选自以下组成的组：神经胶质细胞系衍生的神经营养因子GDNF、神经秩蛋白NRTN、ArteminARTN和人PSPPSPN。15.根据权利要求6所述的方法，其中所述cAMP依赖性通路的激活剂是二丁酰基-cAMPdbCAMP。16.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一细胞培养基还包含百分比为40％至50％的基础细胞生长培养基、百分比为40％至50％的基底胚胎神经细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％的非必需氨基酸NEAA补充剂、百分比为0.5％至3％的抗生素、百分比为0.05％至0.05％的还原剂、百分比为0.5％至3％的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％的用于维持神经元的补充剂和浓度为0.1μgml至5μgml的用于细胞增殖的补充剂。17.根据权利要求3所述的方法，其中所述第二细胞培养基还包含百分比为40％至50％的基础细胞生长培养基、百分比为40％至50％的基底胚胎神经细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％的非必需氨基酸NEAA补充剂、百分比为0.5％至3％的抗生素、百分比为0.05％至0.5％的还原剂、百分比为0.5％至3％的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％的用于维持神经元的补充剂和浓度为0.1μgml至5μgml的用于细胞增殖的补充剂。18.根据权利要求4所述的方法，其中所述第三细胞培养基还包含百分比为90％至95％的基底胚胎神经细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％的非必需氨基酸NEAA补充剂、百分比为0.5％至3％的抗生素、百分比为0.05％至0.5％的还原剂、百分比为0.5％至3％的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％的用于维持神经元的补充剂、浓度为0.5μgml至10μgml的生长补充剂、以及浓度为50ngml至500ngml的干细胞生长促进剂。19.根据权利要求6所述的方法，其中所述第四细胞培养基还包含百分比为90％至95％的基底胚胎神经细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％的非必需氨基酸NEAA补充剂、百分比为0.5％至3％的抗生素、百分比为0.05％至0.5％的还原剂、百分比为0.5％至3％的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％的用于维持神经元的补充剂、浓度为0.5μgml至10μgml的生长补充剂、以及浓度为50ngml至500ngml的干细胞生长促进剂。20.根据权利要求16或17中任一项所述的方法，其中所述基础细胞生长培养基是达尔伯克改良伊格尔培养基DMEMNutrientF-12。21.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述基础胚胎神经元细胞生长培养基是Neurobasal培养基。22.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述谷氨酰胺补充剂是GlutaMAXL-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。23.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述抗生素是青霉素链霉素。24.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述还原剂是β-巯基乙醇。25.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述用于扩增未分化细胞的补充剂是N-2补充剂。26.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述用于维持神经元的补充剂是不含维生素A的B27。27.根据权利要求16-17中任一项所述的方法，其中所述用于细胞增殖的补充剂是肝素。28.根据权利要求18的方法，其中所述生长补充剂是胰岛素。29.根据权利要求18的方法，其中所述干细胞生长促进剂是层粘连蛋白。30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法是三维方法。31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在a下的培养为3至5天。32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在b下的培养为3至5天。33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在c下的培养为1至2天。34.一种分离的中脑样类器官，通过前述权利要求中任一项所述的方法获得。35.根据权利要求34所述的分离的中脑样类器官，包含中脑特异性细胞。36.一种用于衍生和维持神经元谱系类胚体的培养基，包含：aTGF-β抑制剂和或SMAD23抑制剂；和bWNT信号激活剂。37.一种用于衍生和维持中脑区域化组织的培养基，包含：aTGF-β抑制剂和或SMAD23抑制剂；bWNT信号激活剂；c刺猬信号蛋白；和d成纤维细胞生长因子。38.一种用于衍生和维持发育中的神经上皮组织的培养基，包含：a刺猬信号蛋白；和b成纤维细胞生长因子。39.一种用于衍生和维持中脑样类器官的培养基，包含：a神经营养因子；b抗坏血酸；和ccAMP依赖性通路的激活剂。40.根据权利要求36所述的培养基，其中所述用于衍生和维持神经元谱系类胚体的培养基还包含百分比为40％至50％的基础细胞生长培养基、百分比为40％至50％的基底胚胎神经细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％的非必需氨基酸NEAA补充剂、百分比为0.5％至3％的抗生素、百分比为0.05％至0.5％的还原剂、百分比为0.5％至3％的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％的用于维持神经元的补充剂和浓度为0.1μgml至5μgml的用于细胞增殖的补充剂。41.根据权利要求37所述的培养基，其中所述用于衍生和维持中脑区域化组织的培养基还包含百分比为40％至50％的基础细胞生长培养基、百分比为40％至50％的基底胚胎神经细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％的非必需氨基酸NEAA、百分比0.5％至3％的抗生素、百分比为0.05％至0.5％的还原剂、百分比为0.5％至5％的用于维持神经元的补充剂和浓度为0.1μgml至5μgml的用于细胞增殖的补充剂。42.根据权利要求38所述的方法，其中所述用于衍生和维持发育中的神经上皮组织的培养基还包含百分比为90％至95％的基底胚胎神经细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％的非必需氨基酸NEAA补充剂、百分比为0.5％至3％的抗生素、百分比为0.05％至0.5％的还原剂、百分比为0.5％至3％的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％的用于维持神经元的补充剂、浓度为0.5μgml至10μgml的生长补充剂、以及浓度为50ngml至500ngml的干细胞生长促进剂。43.根据权利要求39所述的培养基，其中用于衍生和维持中脑样类器官的培养基还包含百分比为90％至95％的基底胚胎神经细胞生长培养基、百分比为0.5％至3％的谷氨酰胺补充剂、百分比为0.5％至3％的非必需氨基酸NEAA补充剂，百分比为0.5％至3％的抗生素、百分比为0.05％至0.5％的还原剂、百分比为0.5％至3％的用于扩增未分化细胞的补充剂、百分比为0.5％至5％的用于维持神经元的补充剂、浓度为0.5μgml至10μgml的生长补充剂、以及浓度为50ngml至500ngml的干细胞生长促进剂。44.根据权利要求40或41中任一项所述的培养基，其中所述基础细胞生长培养基是达尔伯克改良伊格尔培养基DMEMNutrientF-12。45.根据权利要求40-43中任一项所述的培养基，其中所述基础胚胎神经元细胞生长培养基是Neurobasal培养基。46.根据权利要求40-43中任一项所述的培养基，其中所述谷氨酰胺补充剂是GlutaMAXL-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽。47.根据权利要求40-43中任一项所述的培养基，其中所述抗生素是青霉素G链霉素。48.根据权利要求40-43中任一项所述的培养基，其中所述还原剂是β-巯基乙醇。49.根据权利要求40-43中任一项所述的培养基，其中所述用于扩增未分化细胞的补充剂是N-2补充剂。50.根据权利要求40-43中任一项所述的培养基，其中所述用于维持神经元的补充剂是不含维生素A的B27。51.根据权利要求40-41中任一项所述的培养基，其中所述用于细胞增殖的补充剂是肝素。52.根据权利要求42所述的培养基，其中所述生长补充剂是胰岛素。53.根据权利要求42所述的培养基，其中所述干细胞生长促进剂是层粘连蛋白。54.根据权利要求40和权利要求44至51中任一项所述的培养基，其中所述培养基包含40％至50％的DMEMF12培养基、40％至50％的Neurobasal培养基、0.5％至3％的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、0.5％至3％非必需氨基酸NEAA补充剂、0.5％至3％青霉素G和链霉素、0.05％至0.5％的β-巯基乙醇、0.5％至3％的N-2补充剂、0.5％至5％的不含维生素A的B27、0.1μgml至5μgml的肝素，30nM至20μM的SB431542、30nM至约20μM的CHIR99021、30nM至20μM的Y27632和100ngml至300ngml的头蛋白。55.根据权利要求41和权利要求44至51中任一项所述的培养基，其中所述培养基包含40％至50％的DMEMF12培养基、40％至50％的Neurobasal培养基、0.5％至3％的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、0.5％至3％非必需氨基酸NEAA补充剂、0.5％至3％青霉素G和链霉素、0.05％至0.5％的β-巯基乙醇、0.5％至3％的N-2补充剂、0.5％至5％的不含维生素A的B27、0.1μgml至5μgml的肝素、30nM至20μM的SB431542、30nM至约20μM的CHIR99021、30nM至20μM的Y27632、100ngml至300ngml的头蛋白、100ngml至300ngmlSHH-C25II和100ngml至300ngmlFGF8。56.根据权利要求42、权利要求45至50和权利要求52至53中任一项所述的培养基，其中所述培养基包含80％至100％的Neurobasal培养基、0.5％至3％的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、0.5％至3％的非必需氨基酸NEAA补充剂、0.5％至3％的青霉素G和链霉素、0.05％至0.5％的β-巯基乙醇、0.5％至3％的N-2补充剂、0.5％至5％的不含维生素A的B27、0.5μgml至10μgml胰岛素、50ngml至500ngml层粘连蛋白、100ngml至300ngmlSHH-C25II和100ngml至300ngmlFGF8。57.根据权利要求43和权利要求45-50中任一项所述的培养基，其中所述培养基包含80％-100％的Neurobasal培养基、0.5％-3％的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、0.5％-3％的非必需氨基酸NEAA补充剂、0.5％至3％的青霉素G和链霉素、0.05％至0.5％的β-巯基乙醇、0.5％至3％的N-2补充剂、0.5％至5％的不含维生素A的B27、5ngml至50ngmlBDNF、5ngml至50ngmlGDNF、70μM至600μM抗坏血酸和20μM至850μM的dc-cAMP。

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