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申请/专利权人：华中科技大学同济医学院附属同济医院

摘要：本发明公开了一种MBD2条件性基因敲除小鼠模型、构建方法及其应用，属于基因工程技术领域。本发明通过将Cas9mRNA、sgRNA和含有loxP位点的donorDNA片段显微注射到C57BL6J小鼠的受精卵中，并将该受精卵移植至假孕母鼠，获得F0代小鼠；将含有打靶序列的F0代小鼠与野生型小鼠杂交，得到含有打靶序列的稳定遗传杂合性小鼠；将得到的含有打靶序列的杂合性小鼠与CD8‑Cre阳性小鼠杂交，得到CD8+T淋巴细胞MBD2基因敲除小鼠模型。本发明获得的条件性基因敲除ConditionalKnockout，CKO动物，为研究MBD2基因影响CD8+T活化及耗竭在自身免疫性疾病机制相关研究提供了便捷、可靠、经济的小鼠模型。

主权项：1.一种MBD2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括以下步骤：S1：根据MBD2基因的结构确定敲除exon2区域，在敲除区域的上游和下游分别设计两对sgRNA；上游的sgRNA分别为具有SEQIDNo.1所示序列的Mbd2-sgRNA-L-1，以及具有SEQIDNo.2所示序列的Mbd2-sgRNA-L-2；下游的sgRNA分别为具有SEQIDNo.3所示序列的Mbd2-sgRNA-R-1，以及具有SEQIDNo.4所示序列的Mbd2-sgRNA-R-2；S2：使用所述sgRNA和其引物，通过线性化载体、寡核苷酸链的退火、连接、重组质粒的转化，构建sgRNACas9表达载体；S3：将S2中所述sgRNACas9表达载体线性化并纯化后，作为模板进行体外转录，合成sgRNA和Cas9mRNA；S4：显微注射受精卵：使用显微注射仪器将S3中合成的所述sgRNA和Cas9mRNA以及含有loxP位点的donorDNA片段按一定浓度比例混匀后，一同注射进入小鼠受精卵的胞浆部分，构建形成特定的小鼠受精卵；S5：体外培养1-2小时后将存活的受精卵移植入假孕母鼠的输卵管，产出F0代小鼠；对F0代小鼠进行鉴定，确定插入位点，从后代中筛选得到flox阳性的小鼠；S6：将阳性的F0代小鼠与野生型小鼠交配获得F1代小鼠，对F1代小鼠进行鉴定；S7：将S6得到的含有打靶序列的杂合性F1代小鼠与CD8-Cre重组酶阳性小鼠杂交获得F2代小鼠，对F2代小鼠进行鉴定，得到MBD2条件性基因敲除小鼠模型，记为CD8cre-MBD2flfl。

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