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申请/专利权人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)

摘要：本发明提供SIV、PRRSV与PVC3三重TaqMan荧光定量RT‑PCR检测方法，涉及荧光定量RT‑PCR检测方法技术领域。该SIV、PRRSV与PVC3三重TaqMan荧光定量RT‑PCR检测方法，具体包括以下步骤，S1.引物特异性检测，S2.单重荧光定量PCR反应条敏感性试验和标准曲线的建立，S3.多重荧光定量PCR反应体系和条件优化结果，S4.多重荧光定量PCR反应条特异性试验结果，S5.多重荧光定量PCR反应条敏感性试验结果，S6.多重荧光定量PCR反应条重复性试验结果，S7.多重荧光定量PCR的验证。通过采用以上方法，可为荧光定量RT‑PCR检测操作进行简化，解决了现有的荧光定量RT‑PCR检测方法虽然很多，但是操作复杂，无法满足于临床对该病的快速诊断要求，提升该方法使用时的检测速度，提升该方法的实用性。

主权项：1.SIV、PRRSV与PVC3三重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1.引物特异性检测以SIV，PCV3，PRRSV，CSFV，PRV,SS,HPS,PAM细胞基因组为模板，对三对引物和探针进行单重PCR扩增；S2.单重荧光定量PCR反应条敏感性试验和标准曲线的建立以不同稀释度的质粒作为模板，对三对引物和探针进行敏感性试验并建立标准曲线，建立的标准方程：SIVY＝-3.244logx+38.609R2＝0.994Eff％＝103.345PRRSVY＝-3.55logx+40.203R2＝0.995Eff％＝91.279PCV3Y＝-3.338logx+37.501R2＝0.994Eff％＝99.35；S3.多重荧光定量PCR反应体系和条件优化结果为提高多重反应体系的性能，减少不同荧光之间的干扰，对引物浓度，探针浓度，退火温度等条件进行优化，以未出现非特异性扩增时循环数值小的条件为优先选择条件，出现近似数值时选择荧光强度高、引物和探针使用量少的条件，根据不同退火温度选择未出现显著差异的温度作为最终优化条件，退火温度设置为：52℃、54℃、56℃、58℃、60℃和62℃6个梯度，最终选择60℃退火，TanMan荧光定量PCR中引物探针固定为10μM，使用0.2-0.8μL引物，0.4-1.2μL探针以矩阵法进行交叉反应；S4.多重荧光定量PCR反应条特异性试验结果以SIVPRRSVPCV3CSFVPRVSSHPSPAM细胞基因组为模板，在优化好的条件，对三对引物和探针进行多重荧光定量PCR扩增；S5.多重荧光定量PCR反应条敏感性试验结果将构建好的三个阳性质粒标准品均稀释到108copiesμL放入一个200μL混合体系中,然后进行10倍倍比稀释，以108copiesμL为初始浓度稀释到101copiesμL，同时以ddH2O为阴性对照，进行三重荧光定量PCR扩增反应，用于确定该方法的敏感性；S6.多重荧光定量PCR反应条重复性试验结果对103-106稀释的质粒拷贝数进行重复性试验，计算平均值以及标准差，批间和批内试验的变异系数小于5％，证明方法重复性较好；S7.多重荧光定量PCR的验证用于本实验所建立的TaqMan多重荧光定量PCR检测方法对110份临床样本进行了检测，以验证其在临床应用中的性能，为了进行验证，所有样本都进一步通过常规PCR和测序进行了鉴定。

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百度查询： 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心) SIV、PRRSV与PVC3三重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法