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申请/专利权人：XENCOR股份有限公司

摘要：本发明涉及双特异性异源二聚体检查点抗体。

主权项：1.一种异源二聚体抗体，其由以下组成：a由以下序列组成的第一单体：EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVSFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSDTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVKHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCDVSGFYPSDIAVEWESDGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWEQGDVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK；b由以下序列组成的第二单体：EIVLTQSPATLSASPGERVTLTCRASQSVGNDVAWYQQKPGQAPRLLINYASHRYTGVPDRFTGSGYGTEFTLTISSVQSEDFGVYYCQQDFSSPRTFGGGTKVEIKGKPGSGKPGSGKPGSGKPGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCVASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWVAEIRLYSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNNLKTEDTGVYYCTRYYGNYGGYFDVWGRGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVKHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREQMTKNQVKLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK；和c由以下序列组成的轻链：EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

全文数据：双特异性检查点抑制剂抗体相关申请的交叉引用本申请要求于2016年6月14日提交的美国临时专利申请号62350,145、于2016年6月22日提交的美国临时专利申请号62353,511以及于2016年11月10日提交的美国临时专利申请号62420,500的优先权，所述美国临时专利申请的内容通过引用以其全文明确地完全合并。序列表本申请含有呈ASCII格式以电子方式提交并且通过引用以其全文结合在此的序列表。于2017年6月9日创建的所述ASCII文本被命名为067461_5191WO_SL.txt并且大小为32,442,145千字节。背景技术如CTLA-4、PD-1程序性细胞死亡1、TIM-3T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域3、LAG-3淋巴细胞-活化基因3、TIGIT具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体等检查点受体抑制T细胞和其它细胞类型的活化、增殖和或效应子活性。根据检查点受体遏制针对肿瘤细胞的内源T细胞应答的假设，对抗CTLA4和抗PD1抗体包含纳武单抗nivolumab、派姆单抗pembrolizumab、伊匹单抗ipilimumab和替西木单抗tremelimumab的临床前和临床研究已经确实证明，检查点阻断产生了令人难忘的抗肿瘤应答，刺激内源性T细胞攻击肿瘤细胞，从而使患有各种恶性肿瘤的一小部分患者有了长期癌症缓解。不幸的是，仅一小部分患者回应了这些疗法，其中各个疗法的应答率总体上从10％到30％变动并且有时更高，这取决于适应症和其它因素。这些药剂的疗法组合例如伊匹单抗加上纳武单抗产生了甚至更高的应答率，在一些情况下接近60％。临床前研究已经示出了抗PD-1抗体和或抗CTLA-4抗体之间的额外协同，阻断了更多最近鉴定的检查点受体，包含LAG-3、TIM-3、BTLA和TIGIT。虽然多个检查点阻断的可能性非常大，但是利用此类药剂的组合疗法预期会带来较高的财政负担。而且，与单一疗法相比，组合疗法例如纳武单抗加上伊匹单抗的自身免疫毒性大大升高，从而使许多患者止步于疗法。检验肿瘤浸润性淋巴细胞TIL的多项研究Ahmadzadeh等人，《血液Blood》114：15372009、Matsuzaki等人，《美国国家科学院院刊PNAS》10717：7875-78802010、Fourcade等人，《癌症研究CancerRes.》724：887-8962012以及Gros等人，《临床研究杂志J.ClinicalInvest.》1245：22462014已经示出了TIL共同表达多个检查点受体。而且，表达多个检查点的TIL事实上有可能最具肿瘤反应性。相比之下，外围的非肿瘤反应性T细胞更有可能表达单个检查点。对于去阻遏假设促进自身免疫毒性的肿瘤反应性TIL相比于自身抗原反应性单表达T细胞，利用单特异性全长抗体的检查点阻断可能并无差别。因此，本发明涉及与两种不同的检查点抑制蛋白结合的双特异性抗体。发明内容本发明提供了与两个不同的检查点细胞表面受体结合的双特异性异源二聚体抗体，如人PD-1、人CTLA-4、人TIM-3、人LAG-3和人TIGIT。因此，在一些方面，适合的双特异性抗体结合PD-1和CTLA-4、PD-1和TIM-3、PD-1和LAG-3、PD-1和TIGIT、PD-1和BTLA、CTLA-4和TIM-3、CTLA-4和LAG-3、CTLA-4和TIGIT、CTLA-4和BTLA、TIM-3和LAG-3、TIM-3和TIGIT、TIM-3和BTLA、LAG-3和TIGIT、LAG-3和BTLA、以及TIGIT和BTLA。在一方面，本发明提供了开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体“scFv单体”，有时被称为“scFv重链”，其包括具有使用带电荷scFv连接子连接的可变重结构域和可变轻结构域的scFv图7的+H序列在一些实施例中是优选的、包括倾斜变体S364KE357Q和消融变体E233PL234VL235AG236delS267K的Fc结构域、以及与如本文所概述的检查点受体结合的Fv；b第二单体“Fab单体”或“重链”，其包括具有倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D和消融变体E233PL234VL235AG236delS267K的Fc结构域以及可变重结构域，所述可变重结构域与可变轻结构域构成与如本文所概述的第二检查点抑制剂结合的Fv；以及c轻链。在这个特定实施例中，适合的单体Fv对包含Fab首先被列出，scFv第二个被列出PD-1和CTLA-4、CTLA-4和PD-1、PD-1和TIM-3、TIM-3和PD-1、PD-1和LAG-3、LAG-3XPD1、PD-1和TIGIT、TIGIT和PD-1、PD-1和BTLA、BTLA和PD-1、CTLA-4和TIM-3、TIM-3和CTLA-4、CTLA-4和LAG-3、LAG-3和CTLA-4、CTLA-4和TIGIT、TIGIT和CTLA-4、CTLA-4和BTLA、BTLA和CTLA-4、TIM-3和LAG-3、LAG-3和TIM-3、TIM-3和TIGIT、TIGIT和TIM-3、TIM-3和BTLA、BTLA和TIM-3、LAG-3和TIGIT、TIGIT和LAG-3、LAG-3和BTLA、BTLA和LAG-3、BTLA和TIGIT、以及TIGIT和BTLA。本文中提供了本发明的其它方面。附图说明图1A到图1I描绘了本发明的几种格式。第一种是“开瓶器bottleopener”格式，具有第一和第二抗抗原结合结构域。另外，示出了mAb-Fv格式、mAb-scFv格式、中央scFv格式、中央Fv格式、单臂中央scFv格式、单scFv-mAb格式、scFv-mAb和双scFv格式。对于所描绘的所有scFv结构域，其可以是N-末端到C-末端可变重-任选连接子-可变轻，或相反。另外，对于所有单臂scFv-mAb，scFv可以与重链单体的N-末端或轻链的N-末端相连。图2图2A、图2B、图2C和图2D描绘了用于本发明的多个抗原的抗原序列，在许多情况下包含人和食蟹猴，以促进与人和食蟹猴两者均结合的抗原结合结构域的发展以便于临床开发的。图3A到图3F描绘了有用对异源二聚体化变体组包含倾斜和pI变体。图3E中，存在并无相应“单体2”变体的变体；这些是可以单独用在单体上或例如包含在开瓶器的Fab侧上的pI变体，并且适当带电荷的scFv连接子可以用在将scFv用作第二抗原结合结构域的第二单体上。适合的带电荷连接子示出在图7中。图4描绘了同配变体抗体恒定区和其对应取代的列表，pI_-指示较低pI变体，而pI_+指示较高pI变体。这些可以与本发明的其它异源二聚体化变体以及其它变体类型，如本文所概述的任选地以及独立地组合。图5描绘了消融FcγR结合的有用消融变体有时被称为“敲除”或“KO”变体。通常，消融变体发现于这两个单体上，但是在一些情况下，消融变体可以仅在一个单体上。图6示出了本发明的可以用于图1A或图1F的格式的两个特别有用的实施例。对于图1A的格式，这个实施例的“非Fv”组分示出在图37A中，但是也可以使用其它格式以及图38的格式。图7描绘了用于增大或减小利用一个或多个scFv作为组分的异源二聚体抗体的pI的多个带电荷scFv连接子。+H阳性连接子特别用于本文中，具体来说本文中示出了抗CD3vl和vh序列。引用具有单个电荷的单个现有技术scFv连接子作为“Whitlow”，来自Whitlow等人《蛋白质工程ProteinEngineering》68：989-9951993。应注意，这个连接子用于减少聚合并且增强scFv的蛋白水解稳定性。图8描绘了具有异源二聚体产率通过HPLC-CIEX来确定和热稳定性通过DSC来确定的工程化异源二聚体倾斜Fc变体列表。未确定的热稳定性用“n.d.”来指代。图9A到图9E描绘了选择数量的PD-1ABD，其中额外的抗PD-1ABD被列为SEQIDNO：6209到11464、SEQIDNO：11465到17134、SEQIDNO：33003到33072、SEQIDNO：33073到35394和SEQIDNO：36127到36146。CDR加下划线，scFv连接子加双下划线在序列中，scFv连接子是带正电荷的scFvGKPGS4连接子SEQIDNO：37755，但是如本领域技术人员将了解的，这个连接子可以被其它连接子代替，包含不带电荷的连接子或带负电荷的连接子，其中一些描绘在图7中，并且斜线指示可变结构域的一个或多个边界。另外，命名约定展示了scFv从N-末端到C-末端的朝向。即，“H1.279_L1.194”示出了，朝向为vh-scFv连接子-vl从N-末端到C-末端，其中在一侧或两侧上有任选的结构域连接子，这取决于所使用的格式，但是这些序列也可以相反朝向从N-末端到C-末端vl-连接子-vh使用。类似地，“L1.194_H1.279”示出了，朝向为vl-scFv连接子-vh从N-末端到C-末端，再次具有任选的结构域连接子，相反朝向也包含在本发明中。如本文中所指出的并且如本文中含有CDR的每个序列的真实情况那样，对CDR位置的精确鉴定可以根据如表1所示使用的编号而略有不同，并且因此本文中所包含的不仅有加下划线的CDR，还有使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包含的CDR。此外，如对于附图中的所有序列，这些vh和vl序列可以scFv格式或Fab格式使用。图10A到图10PP描绘了多个的CTLA-4ABD，其中额外的抗CTLA-4ABD被列为SEQIDNO：21到2918、SEQIDNO：2919到6208、SEQIDNO：36739到36818和SEQIDNO：35395到35416。CDR加下划线，scFv连接子加双下划线在序列中，scFv连接子是带正电荷的scFvGKPGS4连接子SEQIDNO：37755，但是如本领域技术人员将了解的，这个连接子可以被其它连接子代替，包含不带电荷的连接子或带负电荷的连接子，其中一些描绘在图7中，并且斜线指示可变结构域的一个或多个边界。如上，命名约定展示了scFv从N-末端到C-末端的朝向；在本附图所列出的序列中，其均朝向为vh-scFv连接子-vl从N-末端到C-末端，但是这些序列还可以相反朝向从N-末端到C-末端vl-连接子-vh使用；另外，SEQIDNO：21到2918、SEQIDNO：2919到6208、SEQIDNO：36739到36818和SEQIDNO：35395到35416中的一些序列处于相反朝向。如本文中所指出的并且如本文中含有CDR的每个序列的真实情况那样，对CDR位置的精确鉴定可以根据如表1所示使用的编号而略有不同，并且因此本文中所包含的不仅有加下划线的CDR，还有使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包含的CDR。此外，如对于附图中的所有序列，这些vh和vl序列可以scFv格式或Fab格式使用。具体地说，所述附图中的许多包含scFv格式以及Fab格式的XENP标识符；参见例如示出XENP19235是使用Fab格式的分子并且XENP19769是scFv分子的图10A。图11A到图11N描绘了多个LAG-3ABD，其中额外的抗LAG-3ABD被列为SEQIDNO：17135到20764、SEQIDNO：36819到36962、SEQIDNO：35417到35606、SEQIDNO：25194到32793和SEQIDNO：32794到33002。CDR加下划线，scFv连接子加双下划线在序列中，scFv连接子是带正电荷的scFvGKPGS4连接子，但是如本领域技术人员将了解的，这个连接子可以被其它连接子代替，包含不带电荷的连接子或带负电荷的连接子，其中一些描绘在图7中，并且斜线指示可变结构域的一个或多个边界。如上，命名约定展示了scFv从N-末端到C-末端的朝向；在本附图所列出的序列中，其均朝向为vh-scFv连接子-vl从N-末端到C-末端，但是这些序列还可以相反朝向从N-末端到C-末端vl-连接子-vh使用；另外，SEQIDNO：17135到20764、SEQIDNO：36819到36962、SEQIDNO：35417到35606、SEQIDNO：25194到32793和SEQIDNO：32794到33002中的一些序列处于相反朝向。如本文中所指出的并且如本文中含有CDR的每个序列的真实情况那样，对CDR位置的精确鉴定可以根据如表1所示使用的编号而略有不同，并且因此本文中所包含的不仅有加下划线的CDR，还有使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包含的CDR。此外，如对于附图中的所有序列，这些vh和vl序列可以scFv格式或Fab格式使用。图12A到图12C描绘了多个BTLAABD，其中额外的抗BTLAABD被列为SEQIDNO：20885到21503和SEQIDNO：36707到36738。CDR加下划线，scFv连接子加双下划线在序列中，scFv连接子是带正电荷的scFvGKPGS4连接子，但是如本领域技术人员将了解的，这个连接子可以被其它连接子代替，包含不带电荷的连接子或带负电荷的连接子，其中一些描绘在图7中，并且斜线指示可变结构域的一个或多个边界。如上，命名约定展示了scFv从N-末端到C-末端的朝向；在本附图所列出的序列中，其均朝向为vh-scFv连接子-vl从N-末端到C-末端，但是这些序列还可以相反朝向从N-末端到C-末端vl-连接子-vh使用；另外，SEQIDNO：20885到21503和SEQIDNO：36707到36738中的一些序列处于相反朝向。如本文中所指出的并且如本文中含有CDR的每个序列的真实情况那样，对CDR位置的精确鉴定可以根据如表1所示使用的编号而略有不同，并且因此本文中所包含的不仅有加下划线的CDR，还有使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包含的CDR。此外，如对于附图中的所有序列，这些vh和vl序列可以scFv格式或Fab格式使用。图13A到图13I描绘了多个TIM-3ABD，其中额外的抗TIM-3ABD被列为SEQIDNO：20765到20884、SEQIDNO：37587到37698和SEQIDNO：36347到36706。CDR加下划线，scFv连接子加双下划线在序列中，scFv连接子是带正电荷的scFvGKPGS4连接子，但是如本领域技术人员将了解的，这个连接子可以被其它连接子代替，包含不带电荷的连接子或带负电荷的连接子，其中一些描绘在图7中，并且斜线指示可变结构域的一个或多个边界。如上，命名约定展示了scFv从N-末端到C-末端的朝向；在本附图所列出的序列中，其均朝向为vh-scFv连接子-vl从N-末端到C-末端，但是这些序列还可以相反朝向从N-末端到C-末端vl-连接子-vh使用；另外，SEQIDNO：20765到20884、SEQIDNO：37587到37698和SEQIDNO：36347到36706中的一些序列处于相反朝向。如本文中所指出的并且如本文中含有CDR的每个序列的真实情况那样，对CDR位置的精确鉴定可以根据如表1所示使用的编号而略有不同，并且因此本文中所包含的不仅有加下划线的CDR，还有使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包含的CDR。此外，如对于附图中的所有序列，这些vh和vl序列可以scFv格式或Fab格式使用。图14A到图14I描绘了开瓶器格式Fab-scFv-Fc的特异性抗CTLA-4X抗PD-1抗体的氨基酸序列。抗体使用以下进行命名：通过破折号分开的首先Fab可变区和其次scFv可变区，随后是链名称Fab-Fc重链、scFv-Fc重链或轻链。CDR加下划线，并且斜线指示可变区的一个或多个边界。scFv结构域具有如所示不同朝向N-末端到C-末端vh-连接子-vl或vl-连接子-vh，但是这可以颠倒。另外，本文所概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地这两个Fc结构域中的M428LN434S变体，这产生了较长的血清半衰期。图15A到图15I描绘了特异性抗LAG-3X抗PD-1Fab-scFv-Fc双特异性抗体的氨基酸序列。抗体使用以下进行命名：通过破折号分开的首先Fab可变区和其次scFv可变区，随后是链名称Fab-Fc重链、scFv-Fc重链或轻链。CDR加下划线，并且斜线指示可变区的一个或多个边界。scFv结构域具有朝向N-末端到C-末端vl-连接子-vh，但是这可以颠倒。另外，本文所概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地这两个Fc结构域中的M428LN434S变体，这产生了较长的血清半衰期。图16描绘了特异性抗BTLAX抗PD-1Fab-scFv-Fc双特异性抗体的氨基酸序列。抗体使用以下进行命名：通过破折号分开的首先Fab可变区和其次scFv可变区，随后是链名称Fab-Fc重链、scFv-Fc重链或轻链。CDR加下划线，并且斜线指示可变区的一个或多个边界。scFv结构域具有朝向N-末端到C-末端vl-连接子-vh，但是这可以颠倒。另外，本文所概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地这两个Fc结构域中的M428LN434S变体，这产生了较长的血清半衰期。图17描绘了特异性抗LAG-3X抗CTLA-4Fab-scFv-Fc双特异性抗体的氨基酸序列。抗体使用以下进行命名：通过破折号分开的首先Fab可变区和其次scFv可变区，随后是链名称Fab-Fc重链、scFv-Fc重链或轻链。CDR加下划线，并且斜线指示可变区的一个或多个边界。scFv结构域具有朝向N-末端到C-末端vh-连接子-vl，但是这可以颠倒。另外，本文所概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地这两个Fc结构域中的M428LN434S变体，这产生了较长的血清半衰期。图18示出了一些抗LAG-3杂交瘤筛选的结果。将10μL中的1pg人LAG-3-hIg与50μL杂交瘤上清液在RPMI培养基中用10％FBS进行2倍稀释8次在室温下混合20分钟。加入40μLDaudi或Ramos细胞所述细胞内源地表达MHC-II并在4℃下孵育30分钟。然后洗涤细胞并用抗人-Fc-Alexa647第二抗体孵育30分钟。然后洗涤细胞并针对Alexa647通过FACS进行分析。图19A和图19B描绘了在对人PBMC进行SEB刺激和用抗CTLA-4X抗PD-1双特异性抗体进行处理后的细胞因子释放测定A：IL-2，B：IFNγ。图20A到图20C描绘了在人PBMC在第0天移植到NGS小鼠中、随后在第1天用所示测试品给药之后第14天的CD45+事件和CD8+事件。图21A和图21B描绘了在SEB刺激的PBMC测定中通过从抗TIM-3杂交瘤生成的嵌合抗体进行的T细胞结合。图22描绘了来自三个实验的一些抗TIM-3抗原结合结构域工程化数据。这描绘了二价实施例的XENP编码、衍生的克隆、vh和vl工程化结构域的名称、KD结合常数、如通过八隅体Octet测量的人TIM-3的缔合常数和解离常数。图23A到图23N描绘了一些抗PD-1抗原结合结构域工程化数据。这描绘了二价和scFv实施例的XENP编码、vh和vl工程化结构域的名称、scFv朝向N-末端到C-末端、通过八隅体测量的人PD-1的KD结合常数、以及scFv的Tm。图24A到图24G描绘了一些抗CTLA-4Fab筛选的结果。这描绘了Fab和scFv实施例的XENP编码、vh和vl工程化结构域的名称、通过八隅体测量的人和食蟹猴CTLA-4的KD结合常数、以及scFv和Fab的Tm。另外，与至少一个人VH或VL种系精确匹配的多个序列9聚体被描绘成Fab和scFv的可变区的人源性的量度。图25A和图25B描绘了通过以下来增强IL-2释放的混合淋巴细胞反应：单独的纳武单抗抗PD-1单克隆抗体，作为销售、单独的伊匹单抗抗CTLA-4单克隆抗体，作为销售、基于纳武单抗和伊匹单抗臂的原型抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体、以及“单臂”组合对照物。图26描绘了通过以下来增强IL-2释放的混合淋巴细胞反应：具有变体抗CTLA-4Fab臂和变体抗PD-1scFv臂的抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体、以及单独的纳武单抗、单独的伊匹单抗以及基于纳武单抗和伊匹单抗的原型抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体作为对照物。图27示出了抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体增强了人PBMC移植的NSG小鼠的移植如通过人CD45计数测量的。此增强大于单独利用纳武单抗XENP16432看到的增强虚线。图28描绘了移植物抗宿主疾病中体重与CD45细胞计数之间的相关性，从而证明了CD45细胞水平预示疾病。图29描绘了图27所描绘的研究中CD45细胞计数与IFNγ释放之间的相关性。图30示出了抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体增强了人PBMC移植的NSG小鼠的移植如通过人CD45计数测量的。此增强大于单独利用纳武单抗XENP16432看到的增强虚线。图31描绘了图30所描绘的研究中CD45细胞计数与IFNγ释放之间的相关性。图32示出了图27和图30所描绘的研究之间的测试品效果比较，从而证明了抗PD-1x抗CTLA-4双特异性检查点抗体相比于单独的纳武单抗具有一致优势。图33A和图33B示出了混合淋巴细胞反应的结果以评估抗CTLA-4x抗PD-1、抗LAG-3x抗PD-1和抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性抗体。将分析物水平归一化到通过纳武单抗单独诱导的那些大于一的值表示相对于纳武单抗增强。图34示出了SEB反应以评估抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性抗体。相对于对照物，抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性抗体本身增强了IL-2应答，但是其不如单独的纳武单抗。然而，与纳武单抗组合的抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性抗体产生了比单独的任一者显著更高的IL-2应答。图35示出了抗CTLA-4x抗PD-1、抗LAG-3x抗PD-1、抗BTLAx抗PD-1和抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性抗体增强了人PBMC移植的NSG小鼠的移植如通过人CD45计数测量的。此增强大于单独利用纳武单抗XENP16432看到的增强。而且，抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性抗体与纳武单抗组合以产生最高移植水平。图36A和图36B示出了抗BTLAx抗PD-1双特异性抗体需要破坏HVEMBTLA相互作用以拥有与纳武单抗相等的去阻遏活性。图37A到图37E示出了基于人IgG1的几个有用开瓶器格式主链的序列，无Fv序列例如，scFV以及在Fab侧的vh和vl。开瓶器主链1基于人IgG1356E358M同种异型，并且包含S364KE357Q：L368DK370S倾斜变体、在Fab侧的N208DQ295EN384DQ418EN421DpI变体和在两种链上的E233PL234VL235AG236delS267K消融变体。开瓶器主链2基于人IgG1356E358M同种异型，并且包含不同的倾斜变体、在Fab侧的N208DQ295EN384DQ418EN421DpI变体和在两种链上的E233PL234VL235AG236delS267K消融变体。开瓶器主链3基于人IgG1356E358M同种异型，并且包含不同的倾斜变体、在Fab侧的N208DQ295EN384DQ418EN421DpI变体和在两种链上的E233PL234VL235AG236delS267K消融变体。开瓶器主链4基于人IgG1356E358M同种异型，并且包含不同的倾斜变体、在Fab侧的N208DQ295EN384DQ418EN421DpI变体和在两种链上的E233PL234VL235AG236delS267K消融变体。开瓶器主链5基于人IgG1356D358L同种异型，并且包含S364KE357Q：L368DK370S倾斜变体、在Fab侧的N208DQ295EN384DQ418EN421DpI变体和在两种链上的E233PL234VL235AG236delS267K消融变体。开瓶器主链6基于人IgG1356E358M同种异型，并且包含S364KE357Q：L368DK370S倾斜变体、在Fab侧的N208DQ295EN384DQ418EN421DpI变体和在两种链上的E233PL234VL235AG236delS267K消融变体以及在两种链上的N297A变体。除了突变是N297S外，开瓶器主链7与开瓶器主链7相同。开瓶器主链6和开瓶器主链7的替代格式可以不包含两种链中的消融变体E233PL234VL235AG236delS267K。主链8基于人IgG4，并且包含S364KE357Q：L368DK370S倾斜变体、在Fab侧的N208DQ295EN384DQ418EN421DpI变体和在两种链上的E233PL234VL235AG236delS267K消融变体以及在两种链上的如本领域已知的那样消融Fab臂交换的S228PEU编号，这是Kabat中的S241P变体。开瓶器主链8的替代格式可以不包含两种链中的消融变体E233PL234VL235AG236delS267K。主链9基于人IgG2，并且包含S364KE357Q：L368DK370S倾斜变体、在Fab侧的N208DQ295EN384DQ418EN421DpI变体。主链10基于人IgG2，并且包含S364KE357Q：L368DK370S倾斜变体、在Fab侧的N208DQ295EN384DQ418EN421DpI变体以及在两种链上的S267K变体。如本领域技术人员将了解的并且如下文所概述的，这些序列可以与本文所概述的任何vh和vh对一起使用，一个单体包含scFv任选地包含带电荷scFv连接子并且另一个单体包含Fab序列例如，vh与“Fab侧重链”连接并且vl与“恒定轻链”连接。即，无论是作为scFv再次，任选地具有带电荷scFv连接子还是作为Fab，本文所概述的用于抗CTLA-4、抗PD-1、抗LAG-3、抗TIM-3、抗TIGIT和抗BTLA的任何Fv序列均可以任何组合并入图37的这些主链中。图37A所描绘的恒定轻链可以用于此图中的所有构建体，但是κ恒定轻链也可以被取代。应注意，这些开瓶器主链用于图1F的中央scFv格式，其中具有与第一Fab相同的抗原结合的第二Fabvh-CH1和vl-恒定轻加入到在“开瓶器侧”的scFv的N-末端。这些主链中的每一个内包含如本文所定义的与所列举序列90％、95％、98％和99％相同的序列，和或含有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个额外的氨基酸取代如与附图的“亲本”相比，所述亲本如本领域技术人员将了解的如与亲本人IgG1或IgG2或IgG4，这取决于主链相比已经含有多个氨基酸修饰。即，除了此图的主链内所含的倾斜变体、pI变体和消融变体之外，所列举主链可以含有额外的氨基酸修饰通常是氨基酸取代。图38A到图38D示出了本发明所使用的mAb-scFv主链的序列，本发明的Fv序列加入到所述序列。mAb-scFv主链1基于人IgG1356E358M同种异型，并且包含S364KE357Q：L368DK370S倾斜变体、在Fab侧的N208DQ295EN384DQ418EN421DpI变体和在两种链上的E233PL234VL235AG236delS267K消融变体。主链2基于人IgG1356D358L同种异型，并且包含S364KE357Q：L368DK370S倾斜变体、在Fab侧的N208DQ295EN384DQ418EN421DpI变体和在两种链上的E233PL234VL235AG236delS267K消融变体。主链3基于人IgG1356E358M同种异型，并且包含S364KE357Q：L368DK370S倾斜变体、在Fab侧的N208DQ295EN384DQ418EN421DpI变体和在两种链上的E233PL234VL235AG236delS267K消融变体以及在两种链上的N297A变体。除了突变是N297S外，主链4与主链3相同。mAb-scFv主链3和mAb-scFv主链4的替代格式可以不包含两种链中的消融变体E233PL234VL235AG236delS267K。主链5基于人IgG4，并且包含S364KE357Q：L368DK370S倾斜变体、在Fab侧的N208DQ295EN384DQ418EN421DpI变体和在两种链上的E233PL234VL235AG236delS267K消融变体以及在两种链上的如本领域已知的那样消融Fab臂交换的S228PEU编号，这是Kabat中的S241P变体。主链6基于人IgG2，并且包含S364KE357Q：L368DK370S倾斜变体、在Fab侧的N208DQ295EN384DQ418EN421DpI变体。主链7基于人IgG2，并且包含S364KE357Q：L368DK370S倾斜变体、在Fab侧的N208DQ295EN384DQ418EN421DpI变体以及在两种链上的S267K变体。如本领域技术人员将了解的并且如下文所概述的，这些序列可以与本文所概述的任何vh和vh对一起使用，一个单体包含Fab和scFv任选地包含带电荷scFv连接子并且另一个单体包含Fab序列例如，vh与“Fab侧重链”连接并且vl与“恒定轻链”连接。即，无论是作为scFv再次，任选地具有带电荷scFv连接子还是作为Fab，本文所概述的用于抗CTLA-4、抗PD-1、抗LAG-3、抗TIM-3、抗TIGIT和抗BTLA的任何Fv序列均可以任何组合并入图38的这个主链中。单体1侧是Fab-scFvpI负侧，并且包含异源二聚体化变体L368DK370S、同配pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K均相对于IgG1。单体2侧是scFvpI正侧，并且包含异源二聚体化变体364KE357Q。但是，其它倾斜变体对可以被取代，尤其是[S364KE357Q：L368DK370S]、[L368DK370S：S364K]、[L368EK370S：S364K]、[T411TE360EQ362E：D401K]、[L368DK370S：S364KE357L]、[K370S：S364KE357Q]、[T366SL368AY407V：T366W]和[T366SL368AY407VY394C：T366WS354C]。图38A所描绘的恒定轻链可以用于此图中的所有构建体，但是κ恒定轻链也可以被取代。应注意，这些mAb-scFv主链用于图1H的mAb-Fv格式其中，一个单体包括C-末端处的vl并且另一个包括C-末端处的vh以及图1E的scFv-mAb格式scFv结构域加入到所述单体中的一个的C-末端。这些主链中的每一个内包含如本文所定义的与所列举序列90％、95％、98％和99％相同的序列，和或含有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个额外的氨基酸取代如与附图的“亲本”相比，所述亲本如本领域技术人员将了解的如与亲本人IgG1或IgG2或IgG4，这取决于主链相比已经含有多个氨基酸修饰。即，除了此图的主链内所含的倾斜变体、pI变体和消融变体之外，所列举主链可以含有额外的氨基酸修饰通常是氨基酸取代。图39A和图39B描绘了本发明的双特异性检查点抗体的可能组合的矩阵。在图39A中，组合不受格式限制，并且可以使用图1的任何格式。框中的“A”意指来自X轴上列出的第一ABD的CDR可以与Y轴上列出的第二ABD的CDR。框中的“B”意指来自第一ABD的vh链和vl链可以与来自第二ABD的vh链和vl链组合。框中的“C”意指来自第一ABD的CDR可以与来自第二ABD的vh链和vl链组合。框中的“D”意指来自第一ABD的vh链和vl链可以与来自第二ABD的CDR组合。框中的“E”意指PD-1ABD选自以下的群组：1G6_H1.279_L1.194；1G6_H1.280_L1.224；1G6_L1.194_H1.279；1G6_L1.210_H1.288；以及2E9H1L1。框中的“F”意指CTLA-4ABD选自以下的群组：[CTLA-4]_H0.25_L0；[CTLA-4]_H0.26_L0；[CTLA-4]_H0.27_L0；[CTLA-4]_H0.29_L0；[CTLA-4]_H0.38_L0；[CTLA-4]-H0.39_L0；0[CTLA-4]_H0.40_L0；[CTLA-4]_H0.70_L0；[CTLA-4]_H0-L0.22；[CTLA-4]_H2_L0；[CTLA-4]_H3.21_L0.124；[CTLA-4]_H3.21_L0.129；[CTLA-4]_H3.21_L0.132；[CTLA-4]_H3.23_L0.124；[CTLA-4]_H3.23_L0.129；[CTLA-4]_H3.23-L0.132；[CTLA-4]_H3.25_L0.124；[CTLA-4]_H3.25_L0.129；[CTLA-4]_H3.25_L0.132；[CTLA-4]_H3.4_L0.118；[CTLA-4]_H3.4_L0.119；[CTLA-4]_H3.4_L0.12；[CTLA-4]_H3.4_L0.121；[CTLA-4]_H3.4_L0.122；[CTLA-4]_H3.4_L0.123；[CTLA-4]_H3.4_L0.124；[CTLA-4]_H3.4_L0.125；[CTLA-4]_H3.4_L0.126；[CTLA-4]_H3.4_L0.127；[CTLA-4]_H3.4_L0.128；[CTLA-4]_H3.4_L0.129；[CTLA-4]_H3.4_L0.130；[CTLA-4]_H3.4_L0.131；[CTLA-4]_H3.4_L0.132；[CTLA-4]_H3.5_L2.1；[CTLA-4]_H3.5_L2.2；[CTLA-4]_H3.5_L2.3；[CTLA-4]_H3_L0；[CTLA-4]_H3_L0.22；[CTLA-4]_H3_L0.44；[CTLA-4]_H3_L0.67；以及[CTLA-4]_H3_L0.74。框中的“G”意指TIM-3ABD选自以下的群组：1D10H0L0；1D12H0L0；3H3_H1_L2.1；6C8_H0L0；6D9_H0_1D12_L0；7A9_H0L0；7B11_H0L0；7B11var_H0L0；以及7C2_H0L0。框中的“H”意指LAG-3ABD选自以下标识符的群组：2A11_H0L0；2A11_H1.125_L2.113；2A11_H1.144_L2.142；2A11_H1_L2.122；2A11_H1_L2.123；2A11_H1_L2.124；2A11_H1_L2.25；2A11_H1_L2.47；2A11_H1_L2.50；2A11_H1_L2.91；2A11_H1_L2.93；2A11_H1_L2.97；2A11_H1L1；2A11_H1L2；2A11_H2L2；2A11_H3L1；2A11_H3L2；2A11_H4L1；2A11_H4L2；7G8_H0L0；7G8_H1L1；7G8_H3.18_L1.11；7G8_H3.23_L1.11；7G8_H3.28_L1；7G8_H3.28_L1.11；7G8_H3.28_L1.13；7G8_H3.30_L1.34；7G8_H3.30_L1.34；以及7G8_H3L1。框中的“I”意指框中的“J”意指BTLAABD选自群组：9C6_H0L0；9C6_H1.1_L1；以及9C6_H1.11_L1。除了图39B是针对开瓶器格式之外，图39B与图39A相同。在图39B中，当第一ABD结合PD-1时，第一ABD是scFv单体，并且其它ABDCTLA-4、LAG-3、TIGIT、TIM-3和BTLA处于Fab单体中。在图39B中，当第一ABD结合CTLA-4时，其处于scFv单体中当其是Fab侧时，与PD-1组合时除外，其它ABDCTLA-4、LAG-3、TIGIT、TIM-3和BTLA处于Fab单体中。图40描绘了可能的开瓶器格式组合的矩阵。框中的“Q”意指再次，X轴上列出的第一ABD结构域是scF并且再次，Y轴上列出的第二ABD是Fab侧。框中的“R”意指第一ABD是Fab侧并且第二ABD是scFv。框中的“S”意指第一ABD是抗PD-1并且是scFv侧。框中的“T”意指第一ABD是抗CTLA-4并且是scFv侧。框中的“U”意指第一ABD是抗TIM-3并且是scFv侧。框中的“V”意指第一ABD是抗LAG-3并且是scFv侧。框中的“W”意指第一ABD是抗TIGIT并且是scFv侧。框中的“X”意指第一ABD是抗BTLA并且是scFv侧。另外，图39中的每个组合可以使用图38的CDR、scFv以及vh和vl组合。另外，图39的开瓶器主链的特定实施例是图36的序列。图41A和图41B描绘了与使用两种不同的抗体或药物的组合疗法相比，双特异性检查点抗体可以提供的益处所关联的示意图。图42描绘了类似示意图，示出了因为肿瘤TIL共同表达多个检查点，因此二价结合增加了亲和力，从而增强了抗肿瘤活性并避免了外围毒性。图43示出了本发明的双特异性检查点抗体例如，抗LAG-3x抗CTLA-4可以与其它单特异性检查点抗体例如，纳武单抗、派姆单抗组合。图44示出了PD-1和CTLA-4以各种肿瘤类型进行共同表达，包含膀胱癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤和卵巢癌。图45A到图45C描绘了对IL-2增强的比较：在SEB刺激的PBMC测定中，B抗PD-1二价抗体与抗CTLA-4x抗PD-1的比较和C单臂抗PD-1+单臂抗CTLA-4与抗CTLA-4x抗PD-1的比较、以及C在没有SEB刺激的情况下的对照实验。图46A和图46B描绘了相比于单臂抗PD-1抗体和单臂抗CTLA-4抗体，PD-1通过示例性抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体对配体PD-L1和PD-L2的阻断。图47描绘了SEB刺激的PBMC测定中通过示例性抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体进行的T细胞结合。图48示出了抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体增强了人PBMC移植的NSG小鼠的移植如通过人CD45计数测量的。此增强大于单独利用纳武单抗XENP16432看到的增强。图49示出了在SEB刺激的PBMC测定中，相比于“单臂”对照物，抗BTLAx抗PD-1双特异性候选物更亲和地结合T细胞。图50A和图50B示出了抗BTLAx抗PD-1嵌合双特异性抗体促进IL-2从SEB刺激的PBMC分泌。通过所示测试品用10ngmLSEB刺激PBMC3天。收集细胞上清液并通过MSD来测定所述细胞上清液中的所示分析物。A：20μgmL测试品；B：5μgmI测试品。图51A和图51B示出了抗BTLAx抗PD-1嵌合双特异性抗体促进IFNγ从SEB刺激的PBMC分泌。通过所示测试品用10ngmLSEB刺激PBMC3天。收集细胞上清液并通过MSD来测定所述细胞上清液中的所示分析物。A：20μgmL测试品；B：5μgmL测试品。图52A和图52B示出了抗BTLAx抗PD-1双特异性抗体是嵌合的并且具有人源化优化的抗BTLAFab臂促进IL-2和IFN-γ从SEB刺激的PBMC分泌。两个图均是通过所示20μgmL测试品用10ngmLSEB刺激3天的PBMC。72小时后收集细胞上清液并测定所述细胞上清液中的所示分析物。图53A到图53F示出了GVHD研究中通过示例性抗BTLAx抗PD-1双特异性抗体进行的CD45细胞计数增强和IFNγ分泌时程第10天、第14天和第22天。图54描绘了一些9C6抗BTLA抗原结合结构域工程化数据。这描绘了二价实施例的XENP编码、vh和vl工程化结构域的名称和如通过八隅体测量的人BTLA的KD结合常数。图55A到图55E描绘了一些2A11抗LAG-3抗原结合结构域工程化数据。这描绘了Fab实施例的XENP编码、vh和vl工程化结构域的名称、如通过八隅体测量的人LAG-3的KD结合常数以及Fab的Tm。图56A到图56K描绘了一些7G8抗LAG-3抗原结合结构域工程化数据。这描绘了Fab实施例的XENP编码、vh和vl工程化结构域的名称、如通过八隅体测量的人LAG-3的KD结合常数以及Fab的Tm。图57A和图57B描绘了如通过八隅体测量的基于优化2A11或7G8抗LAG-3Fab臂的抗LAG-3X抗CTLA-4双特异性异源二聚体开瓶器格式的Kd。图58示出了抗LAG-37G8x抗CTLA-4和抗LAG-32A11x抗CTLA-4双特异性抗体比单臂抗LAG-3对照物更亲和地结合。用100ngmLSEB刺激PBMC3天。然后将细胞在4℃下用所示测试品处理30分钟并洗涤两次。然后用抗CD3-FITC和抗人-Fc-APC抗体来处理细胞。然后将细胞洗涤两次并通过流式细胞术进行分析。图59A和图59B示出了如IL-2增强和IFNγ释放所示，基于7G8的抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性抗体对PBMC展现出比基于2A11的抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性抗体更有选择性的功能。用500ngmLSEB刺激PBMC2天。然后将细胞在培养基中洗涤两次并结合所示量的测试品用500ngmLSEB进行刺激。处理后24小时，测定细胞的所示分析物IL-2或IFN-γ。每个点表示在技术单线态下测试的唯一供体。图60A和图60B描绘了与抗LAG-3X抗CTLA-4双特异性抗体的混合淋巴细胞反应MLR。在20ugmL所示测试品存在的情况下进行40个独特的MLR反应。然后在处理6天后通过MSD来测定细胞上清液的A：IL-2和B：IFNγ。图61A和图61B示出了SEB测定中通过额外的抗LAG-3X抗CTLA-4候选物进行的IL-2增强和IFNγ释放。用500ngmLSEB刺激PBMC2天。然后将细胞在培养基中洗涤两次并结合所示量的测试品用500ngmLSEB进行刺激。处理后24小时，测定细胞的所示分析物IL-2或IFN-γ。每个点表示在技术单线态下测试的唯一供体。图62A和图62B描绘了如通过八隅体测量的基于优化2A11或7G8抗LAG-3Fab臂的抗LAG-3X抗PD-1双特异性异源二聚体开瓶器格式的Kd。图63A和图63B描绘了人源化优化7G8和2A11抗LAG-3克隆阻断LAG-3与同源性地表达MHC-II的细胞的结合的能力。图64A和图64B描绘了针对SEB刺激的T细胞的抗LAG-3x抗PD-1候选物功能。用500ngmlSEB刺激PBMC2天。然后将细胞在培养基中洗涤两次并结合所示量的测试品用500ngmLSEB进行刺激。处理后24小时，测定细胞的所示分析物。每个点表示在技术单线态下测试的唯一供体。图65是示出肿瘤浸润性淋巴细胞TIL共同表达各个肿瘤中的多个检查点受体的图。具体地说，图示出了各种肿瘤共同表达PD-1和CTLA-4、PD-1和BTLA、PD-1和LAG-3；以及LAG-3和CTLA-4。所示结果基于通过TCGA研究网TCGAResearchnetwork生成的数据：http：cancergenome.nih.gov图66示出了本文所提供的受试者双特异性抗体选择性地靶向双重检查点阳性T细胞。如相比于阴性对照物，双特异性PD-1xLAG-3抗体用于示出通过葡萄球菌肠毒素BSEB刺激的CD3+T细胞中的PD-1和LAG-3受体占用。图67A到图67F是示出本文所提供的受试者抗体的组分抗体结构域能够阻断检查点受体配体相互作用的图。具体地说，包括1G6抗PD-1scFv臂的双特异性抗体能够阻断PD-1PD-L1相互作用和PD-1PD-L2相互作用；7G8抗LAG-3单臂能够阻断LAG-3MHCII相互作用；包括示例性抗PD-1Fab臂的双特异性抗体能够阻断CTLA-4CD80相互作用和CTLA-4CD86相互作用；并且包括9C6抗BTLAFab臂的双特异性抗体能够阻断BTLAHVEM相互作用。图68比较了通过示例性抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体和纳武单抗进行的IL-2释放增强。图69比较了通过示例性抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性抗体、相同双特异性抗体结合纳武单抗以及单独的纳武单抗进行的IL-2释放增强。图70比较了通过示例性抗LAG-3x抗PD-1双特异性抗体和纳武单抗进行的IL-2释放增强。图71比较了通过示例性抗BTLAx抗PD-1双特异性抗体和纳武单抗进行的IL-2释放增强。图72比较了通过示例性抗PD-1x抗CTLA-4双特异性抗体、单独的纳武单抗以及纳武单抗结合伊匹单抗进行的GVHD增强如CD45细胞计数所示。图73比较了通过示例性抗BTLAx抗PD-1双特异性抗体和纳武单抗进行的GVHD增强如CD45细胞计数所示。图74比较了通过示例性抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性抗体、相同双特异性抗体结合纳武单抗以及单独的纳武单抗进行的GVHD增强如CD45细胞计数所示。图75比较了通过示例性抗LAG-3x抗PD-1双特异性抗体和纳武单抗进行的GVHD增强如CD45细胞计数所示。图76A到图76D描绘了两个研究，从而示出了抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体可以促进体内T细胞介导的抗肿瘤功效。将KGla-luc癌细胞移植到小鼠中。二十一天后，将huPMC移植到相同小鼠中并施用每周抗体治疗抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体；抗PD-1二价抗体；或抗PD-1二价抗体+抗CTLA-4二价抗体。如通过肿瘤通量变化确定的，对小鼠实施IVIS癌细胞成像以估计癌细胞大小。具体实施方式A.材料合并1.附图和图例USSN62,350,145、62353,511和62420,500的所有附图和所附图例均明确且独立地通过引用以其全文并入本文中，特别用于其中所描绘的氨基酸序列。2.序列参考所附序列表如下：适于用作ABD的抗PD-1序列包含SEQIDNO：6209到11464PD-1scFv序列，但是其中的Fv序列可以格式化为Fab、SEQIDNO：11465到17134PD-1Fab序列，但是其中的Fv序列可以格式化为scFv、SEQIDNO：33003到33072额外的PD-1Fab序列，但是其中的Fv序列可以格式化为scFv、SEQIDNO：33073到35394额外的PD-1scFv序列，但是其中的Fv序列可以格式化为Fab和SEQIDNO：36127到36146PD-1二价构建体，所述PD-1二价构建体可以格式化为scFv或Fab。适于用作ABD的抗CTLA-4序列包含SEQIDNO：21到2918CTLA-4scFv序列，但是其中的Fv序列可以格式化为Fab、SEQIDNO：2919到6208CTLA-4Fab序列，但是其中的Fv序列可以格式化为scFv、SEQIDNO：36739到36818额外的CTLA-4Fab序列，但是其中的Fv序列可以格式化为scFv和SEQIDNO：35395到35416CTLA-4单臂构建体，所述CTLA-4单臂构建体可以格式化为scFv或Fab。适于用作ABD的抗LAG-3序列包含SEQIDNO：17135到20764LAG-3Fab，但是其中的Fv序列可以格式化为scFv、SEQIDNO：36819到36962额外的LAG-3Fab，但是其中的Fv序列可以格式化为scFv、SEQIDNO：35417到35606额外的LAG-3Fab，但是其中的Fv序列可以格式化为scFv、SEQIDNO：25194到32793额外的LAG-3Fab，但是其中的Fv序列可以格式化为scFv和SEQIDNO：32794到33002单臂LAG-3构建体，所述单臂LAG-3构建体可以格式化为Fab或scFv。适于用作ABD的抗TIM-3序列包含SEQIDNO：20765到20884TIM-3Fab，但是其中的Fv序列可以格式化为scFv、SEQIDNO：37587到37698额外的TIM-3Fab，但是其中的Fv序列可以格式化为scFv和SEQIDNO：36347到36706二价TIM-3构建体，所述二价TIM-3构建体可以格式化为Fab或scFv。适于用作ABD的抗BTLA序列包含SEQIDNO：20885到21503BTLAFab，但是其中的Fv序列可以格式化为scFv和SEQIDNO：36707到36738额外的BTLAFab，但是其中的Fv序列可以格式化为scFv。适于用作ABD的抗TIGIT序列包含SEQIDNO：21504到21523TIGITFab，但是其中的Fv序列可以格式化为scFv和SEQIDNO：37435到37586额外的TIGITFab，但是其中的Fv序列可以格式化为scFv。本发明的双特异性抗体包含SEQIDNO：35607到35866和SEQIDNO：21524到22620的LAG3XCTLA4构建体。PD-1XCTLA4构建体包含列为SEQIDNO：36167到36346和SEQIDNO：23316到23735的那些。PD-1XTIM3构建体包含列为SEQIDNO：25174到25193的那些。PD-1XLAG3构建体包含列为SEQIDNO：35867到36126和SEQIDNO：23736到25133的那些。PD-1XTIGIT构建体包含列为SEQIDNO：25134到25173的那些。PD-1XBTLA构建体包含列为SEQIDNO：22724到23315和SEQIDNO：36147到36166的那些。CTLA4XBTLA构建体包含列为SEQIDNO：22624到22723的那些。最终，非故意遗漏的以下的名称均本应已在标题中包含符号“M428LN434S”：XENP23552、XENP22841、XENP22842、XENP22843、XENP22844、XENP22845、XENP22846、XENP22847、XENP22848、XENP22849、XENP22850、XENP22851、XENP22852、XENP22858、XENP22854、XENP22855。B.综述针对如PD-1等免疫检查点抑制剂的治疗性抗体在临床上、在有限情况下、在治疗癌症方面示出了很大希望。癌症可被视为患者不能识别和消除癌细胞。在许多情形下，这些转化的例如，癌性的细胞抵消免疫监视。存在限制体内T细胞活化以阻止无限制的T细胞活性的天然控制机制，所述天然控制机制可以被癌细胞用于规避或遏制免疫应答。恢复免疫效应细胞-尤其是T细胞-识别和消除癌症的能力是免疫疗法的目标。有时被称为“免疫疗法”的免疫肿瘤学领结构域正在迅速进化，最近获批了几种T细胞检查点抑制抗体如Yervoy、Keytruda和Opdivo。这些抗体通常被称为“检查点抑制剂”，因为其阻断了T细胞免疫的正常负调节物。通常应理解，共刺激且共抑制的各种免疫调节信号可以用于协调最佳抗原特异性免疫应答。通常，这些单克隆抗体与如CTLA-4和PD-1等检查点抑制蛋白结合，所述检查点抑制蛋白在正常情况下阻止或遏制细胞毒性T细胞CTL活化。通过抑制检查点蛋白，例如通过使用结合那些蛋白质的抗体，可以实现针对肿瘤增加的T细胞应答。即，这些癌症检查点蛋白遏制免疫应答；当蛋白质被阻断时，例如使用针对检查点蛋白的抗体，免疫系统活化，产生免疫刺激，从而引起对如癌症和传染性疾病等病状的治疗。然而，如上文所讨论的，研究已经示出了TIL共同表达多个检查点受体；这可以表明，单个检查点阻断可能不足以促进T细胞完全应答。而且，表达多个检查点的TIL事实上有可能最具肿瘤反应性，从而表明涉及多于一种检查点抗原的疗法可能非常有用。因此，本发明提供了与表达两种抗原的细胞结合的双特异性检查点抗体以及活化T细胞和或NK细胞以治疗如癌症和传染性疾病等疾病以及其中增加的免疫活性引起治疗的其它病状的方法。因此，在一些情形下，本发明涉及解决通过提供与单个细胞上的两种不同的检查点抑制剂分子结合的双特异性抗体来施用多种抗体并且有利地需要施用仅一种治疗性物质的毒性和费用问题。可以同时结合两种不同的靶标的双特异性抗体提供了提高靶向TIL与外围T细胞的选择性同时也降低疗法的成本的可能。抗体与细胞表面上的两个靶标的二价相互作用应当-在一些情况下-产生相对于一次与一个靶标的单价相互作用而言更高的结合亲和力。因为这样，正常的二价抗体倾向于对其在细胞表面上的靶标具有高亲和力。通过双特异性抗体，存在创建对同时表达两个不同的靶标的细胞的更高选择性的可能，从而利用通过与这两个靶标同时结合而提供的更高亲和力。因此，本发明涉及用于提供允许与多于一种检查点抗原或配体结合例如允许双特异性结合的异源二聚体抗体的新型构建体。因此，例如，抗PD1x抗CTLA4PD1xCTLA4双特异性抗体有望对PD1+CTLA4+双阳性TIL相比于单个阳性仅PD1或仅CTLA4T细胞更具选择性。双阳性TIL相比于单阳性T细胞的选择性阻断因此有望提高组合检查点阻断的治疗指数。如本文所概述的其它可能组合也类似是这样。因此，本发明的适合的双特异性抗体结合PD-1和CTLA-4、PD-1和TIM-3、PD-1和LAG-3、PD-1和TIGIT、PD-1和BTLA、CTLA-4和TIM-3、CTLA-4和LAG-3、CTLA-4和TIGIT、CTLA-4和BTLA、TIM-3和LAG-3、TIM-3和TIGIT、TIM-3和BTLA、LAG-3和TIGIT、LAG-3和BTLA以及TIGIT和BTLA。应注意，针对每一对，这些双特异性抗体通常被命名为“抗PD-1X抗CTLA-4”或通常简化地或为方便起见并且因此可互换地被命名为“PD-1XCTLA-4”等。本发明的异源二聚体双特异性检查点抗体可用于治疗各种类型的癌症。如本领域技术人员将连接的，相比于与肿瘤抗原结合的传统单克隆抗体或结合例如CD3和肿瘤抗原的更新类别的双特异性抗体如例如USSN15141,350所述，检查点抗体用于增加免疫应答但通常在其作用中并不具有肿瘤特异性。即，本发明的双特异性检查点抗体抑制对免疫系统的遏制，通常产生T细胞活化，这进而产生了对癌细胞的更大免疫应答并且因此产生治疗。此类抗体可能因此有望用于治疗各种肿瘤类型。例如，FDA最近批准了基于遗传特征的抗PD-1单特异性抗体而非肿瘤型。如下文所讨论的，存在各种方式可以测量T细胞活化。可以通过测量以下参数的变化来在体外并且在一些情况下是在体内，如下文更加充分地描述的估计双特异性检查点抗体对NK细胞和T细胞的功能效应：增殖、细胞因子释放和细胞表面标志。对于NK细胞，细胞增殖的增加、细胞毒性杀伤靶细胞的能力，如通过CD107a、粒酶和穿孔素表达的增加测量的，或通过直接测量靶细胞杀伤、细胞因子产生例如，IFN-γ和TNF和细胞表面受体表达例如，CD25指示免疫调节，例如增强的癌细胞杀伤。对于T细胞，增殖的增加、对活化的细胞表面标志的表达例如，CD25、CD69、CD137和PD1的增加、细胞毒性能够杀伤靶细胞和细胞因子产生例如，IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-17A指示免疫调节，例如增强的癌细胞杀伤。因此，可以使用评估以下中的一种或多种的测定法来评估治疗：i免疫应答增加；iiαβ和或γδT细胞的活化增加；iii细胞毒性T细胞活性增加；ivNK和或NKT细胞活性增加；vαβ和或γδT细胞遏制缓解；vi促炎细胞因子分泌增加；viiIL-2分泌增加；viii干扰素-γ产生增加；ixThl应答增加；xTh2应答减少；xi调节T细胞和细胞中的至少一种的细胞数目和或活性减少；xii肿瘤免疫浸润物增加。因此，在一些实施例中，本发明提供了使用双特异性检查点抗体来来对有需要的受试者执行以下中的一种或多种：a上调促炎细胞因子；b增加T细胞增殖、扩增或肿瘤浸润；c通过T细胞来增加干扰素-γ、TNF-α和其它细胞因子产生；d增加IL-2分泌；e刺激抗体应答；f抑制癌细胞生长；g促进抗原特异性T细胞免疫；h促进CD4+和或CD8+T细胞活化；i缓解T细胞遏制；j促进NK细胞活性；k促进癌细胞的细胞凋亡或溶解；和或l对癌细胞的细胞毒性效应或细胞生长抑制效应。因此，本发明提供了双特异性异源二聚体检查点抗体。异源二聚体抗体构建体是基于抗体的重链的两个Fc结构域的自组装性，例如组装成“二聚体”的两个“单体”。通过更改每个单体的氨基酸序列来形成异源二聚体抗体，如下文中更加充分地讨论的。因此，本发明总体上涉及创建异源二聚体抗体，所述异源二聚体抗体可以通过多种方式共同接合检查点抗原，这依赖于在每个链上有所不同以促进异源二聚体形成和或允许相比于同源二聚体易于纯化异源二聚体的、在恒定区中的氨基酸变体。因此，本发明提供了双特异性检查点抗体。抗体技术中始终存在的问题是期望“双特异性”抗体，所述双特异性抗体与两种或更多种不同的抗原同时结合，通常因此允许使不同抗原接近并产生新功能和新疗法。通常，这些抗体通过使每个重链和轻链的基因包含在宿主细胞中来形成在本发明中通常是指如本文所概述的两个重链单体和轻链的基因。这通常导致形成期望的异源二聚体A-B以及两个同源二聚体A-A和B-B。然而，形成双特异性抗体的主要阻碍是难以纯化异源二聚体抗体远离同源二聚体抗体和或相比于同源二聚体的形成偏置异源二聚体的形成。为了解决这个问题，存在多种机制可以用于生成本发明的异源二聚体。另外，如本领域技术人员将了解的，这些机制可以组合以确保高异源二聚体化。因此，导致异源二聚体抗体产生的氨基酸变体被称为“异源二聚体化变体”。如下文所讨论的，异源二聚体化变体可以包含空间变体例如，下文所述“隆突与空穴knobsandholes”或“倾斜”变体和下文所述“电荷对”以及“pI变体”，这允许纯化同源二聚体远离异源二聚体。还可以任选地使用指创建空间和或静电影响以有利于异源二聚体形成并且不利于同源二聚体形成的氨基酸工程、在本领域通常被称为“隆突与空穴”“KIH”或在本文中有时被称为“倾斜”变体的一种机制，如以下所述：Ridgway等人，《蛋白质工程ProteinEngineering》97：6171996；Atwell等人，《分子生物学杂志J.Mol.Biol.》1997270：26；美国专利号8,216,805；US20120149876，以上均通过引用以其全文并入本文。附图标识了包含“隆突与空穴”氨基酸取代的多对“单体A-单体B”。另外，如Merchant等人《自然生物技术NatureBiotech.》16：6771998所述，这些“隆突与空穴”突变可以与二硫键组合以使形成向异源二聚体化倾斜。本发明所使用的是与T366W配对的T366SL368AY407V以及与桥接二硫化物配对的这个变体、与T366WS354C成对的T366SL368AY407VY349C，尤其是结合如下文所概述的包含pI变体的其它异源二聚体化变体。用于生成异源二聚体抗体的额外机制有时被称为“静电转向electrostaticsteering”或“电荷对”，如通过引用以其全文合并在此的Gunasekaran等人《生物化学杂志J.Biol.Chem.》28525：196372010所述。这在本文中有时被称为“电荷对”。在这个实施例中，静电用于使形成向异源二聚体化倾斜。如本领域技术人员将了解的，这些电荷对还可以对pI有作用并因此对纯化有作用，并且因此在一些情况下还可以被视为pI变体。然而，由于这些电荷对被生成为迫使异源二聚体化并且不用作纯化工具，因此其被分类为“空间变体”。这些电荷对包含但不限于与D221RP228RK409R配对的D221EP228EL368E例如，这些是“单体对应组”和与C220RE224RP228RK409R配对的C220EP228E368E以及附图所示的其它电荷对。在本发明中，在一些实施例中，pI变体用于更改单体中的一个或两个的pI并且因此允许等电分离A-A、A-B和B-B二聚体蛋白。在本发明中，存在几种基本机制可以导致易于纯化异源二聚体化蛋白质；一种机制依赖于使用pI变体，使得每个单体具有不同pI，从而允许等电纯化A-A、A-B和B-B二聚体蛋白。可替代地，一些支架格式如“三重F”格式”也允许基于大小进行分离。如下文中进一步概述的，还可能相比于同源二聚体“倾斜”异源二聚体的形成。因此，空间异源二聚体化变体与pI或电荷对变体的组合特别用于本发明。另外，如下文中更加充分地概述的，利用如三重F格式等一个或多个scFv的支架可以包含出于纯化的目的给出另外的pI助推的带电荷scFv连接子带正电荷或负电荷。如本领域技术人员将了解的，一些三重F格式可与仅带电荷scFv连接子一起使用而无额外的pI调整，但是本发明还提供了一起使用倾斜变体与带电荷scFv连接子以及本文所讨论的Fc、FcRn和KO变体的组合。在将pI用作分离机制以允许纯化异源二聚体蛋白的本发明中，可以将氨基酸变体引入到单体多肽中的一个或两个中；即，可以使单体中的一个为了简便在本文中被称为“单体A”的pI工程化远离单体B，或可以改变单体A和单体B两者，其中单体A的pI增加并且单体B的pI减少。如下文中更加充分地概述的，任一个或两个单体的pI变化可以通过以下来完成：去除或添加带电荷残基例如，用带正电荷或带负电荷的氨基酸残基来代替中性氨基酸，例如甘氨酸到谷氨酸、将带电荷残基从带正电或带负电改变为相反电荷例如，天冬氨酸到赖氨酸或将带电荷残基改变为中性残基例如，电荷损失；赖氨酸到丝氨酸。多种这些变体示出在附图中。另外，本文中用于创建异源二聚体抗体的适合的pI变体是属于同种型的那些，例如从不同的IgG同种型输入pI，使得在未引入显著的免疫原性的情况下改变pI；参见通过引用以其全文合并在此的美国公开号US20140288275的图29。因此，本发明的这个实施例中提供了产生单体中的至少一个的充分pI变化，从而使得异源二聚体可以与同源二聚体分离。如本领域技术人员将了解的并且如下文中进一步讨论的，这可以通过以下来完成：使用“野生型”重链恒定区和已经工程化以增大或减小其pI的变体区wtA-+B或wtA--B或增大一个区并减小另一个区A+-B-orA-B+。因此，通常，本发明的一些实施例的组分是抗体的恒定区中的氨基酸变体，所述氨基酸变体涉及通过将氨基酸取代“pI变体”或“pI取代”合并到单体中的一个或两个中来更改单体中的至少一个如果不是两个的话的等电点pI以形成“pI异源二聚体”当蛋白质是抗体时，这些pI异源二聚体被称为“pI抗体”。如本文所示，异源二聚体与这两个同源二聚体的分离可以在这两个单体的pI相差少至0.1个pH单位时完成，0.2个、0.3个、0.4个和0.5个或更多个pH单位均用于本发明。如本领域技术人员将了解的，每一个或两个单体上要包含的用于得到良好分离的pI变体数目将部分地取决于所关注的scFv和Fab的起始pI。即，为了确定工程化哪个单体或处于哪个“方向”例如，更具阳性或更具阴性，计算这两个靶抗原的Fv序列并据此作出决定。如本领域所已知的，不同的Fv将具有不同的起始pI，本发明中运用了所述起始pI。通常，如本文所概述的，将pI工程化以使各个单体的总pI差为至少约0.1logS，如本文所概述的优选0.2logS到0.5logS。此外，如本领域技术人员将了解的并且如本文所概述的，在一些情况下根据格式，可以基于大小例如，分子量来使异源二聚体与同源二聚体分离。例如，如图1的一些实施例所示，一些格式产生了具有不同大小的同源二聚体和异源二聚体例如，对于开瓶器，一个同源二聚体是“双scFv”格式，一个同源二聚体是标准抗体，并且异源二聚体具有一个Fab和一个scFv。另外，如图1所描绘的，将认识到，一些抗原可能二价结合例如，单个抗原的两个抗原结合位。如将了解的，可以利用Fab和scFv的任何组合以实现期望的结果和组合。在pI变体用于实现相对于同源二聚体优化的异源二聚体的情况下，通过使用一个或多个重链的一个或多个恒定区，提供了用于设计和纯化多特异性蛋白质包含抗体的更模块化方法。因此，在一些实施例中，异源二聚体化变体包含倾斜和纯化异源二聚体化变体并不包含在可变区中，使得每个单独的抗体必须工程化。另外，在一些实施例中，通过从不同的IgG同种型输入pI变体，由pI变体造成免疫原性的可能性显著降低，使得在未引入显著免疫原性的情况下改变pI。因此，要解决的另一个问题是阐明具有较高人序列含量的低pI恒定结构域，例如最小化或避免任何特定位置处的非人残基。可能与这个pI工程化一起发生的负效应同样是血清半衰期延长和FcRn结合增加。即，如USSN13194,904通过引用以其全文并入所述，降低抗体恒定结构域包含在抗体和Fc融合中找到的那些的pI可能导致血清保留在体内更长时间。具有增加的血清半衰期的这些pI变体也促进了pI变化以进行纯化。另外，应注意，异源二聚体化变体的pI变体给予了双特异性抗体的分析和质量控制过程额外益处，因为在同源二聚体存在时消除、最小化和进行区分的能力较为显著。类似地，能够可靠地测试异源二聚体蛋白产生的可重现性很重要。如本领域技术人员将了解的并且如下文更加充分地讨论的，本发明的异源二聚体融合蛋白可以采取各种配置，如图1中总体上描绘的。一些附图描绘了“单端”配置，其中分子的一个“臂”上有一种类型的特异性并且另一个“臂”上有不同的特异性。其它附图描绘了“双端”配置，其中分子的“顶部”有至少一种类型的特异性并且分子的“底部”有一种或多种不同的特异性。因此，本发明涉及共同接合第一抗原和第二抗原的新型免疫球蛋白组成物。本发明的第一抗原和第二抗原在本文中分别被称为抗原1和抗原2或“检查点1”和“检查点2”。特别用于本发明的一种异源二聚体支架是如图1A所描绘的“三重F”或“开瓶器”支架格式。在这个实施例中，抗体的一个重链含有单链Fv“scFv”，如下文所定义的并且另一个重链是包括可变重链和轻链的“常规”FAb格式。此结构在本文中有时被称为“三重F”格式scFv-FAb-Fc或“开瓶器”格式，这是由于与开瓶器具有大致视觉相似性参见图1A。通过使用恒定区例如，Fc结构域和或铰链区中的如下文更加充分地描述的促进异源二聚体抗体形成的氨基酸变体，这两个链被放在一起。本发明的“三重F”格式存在几个明显优势。如本领域所已知的，依赖于两个scFv构建体的抗体类似物常常具有稳定性和聚合问题，在本发明中可以通过添加“常规”的重链和轻链配对来缓解所述稳定性和聚合问题。另外，如与依赖于两个重链和两个轻链的格式相反，不存在重链和轻链错误配对例如，重链1与轻链2配对等的问题。此外，如本文所概述的，可以将额外的氨基酸变体引入到本发明的双特异性抗体中以添加额外的功能。例如，可以加入Fc区内的氨基酸变化到一个单体或两个单体以促进增加的ADCC或CDC例如，与Fcγ受体的更改结合以及增加与FcRn的结合和或增加所得分子的血清半衰期。如本文中进一步描述的并且如本领域技术人员将了解的，本文所概述的任何以及所有变体可以与其它变体任选且独立地组合。类似地，另一类别的功能变体是“Fcγ消融变体”或“Fc敲除FcKO或KO变体”。在这些实施例中，对于一些治疗性应用，期望减少或去除Fc结构域与Fcγ受体例如，FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等中的一个或多个或所有的正常结合以避免额外的动作机制。即，例如，通常期望消融FcγRIIIa结合以消除或显著降低ADCC活性。适合的消融变体示出在图5中。C.命名法本发明的双特异性抗体以几种不同的格式列出。给予每种多肽唯一的“XENP”编号，但是如本领域中将了解的，较长的序列可能含有较短的XENP编号。例如，给定序列的开瓶器格式的scFv侧单体的重链将具有第一XENP编号，而scFv域将具有不同的XENP编号。一些分子具有三个多肽，因此在具有组分的情况下，XENP编号用作名称。因此，处于开瓶器格式的分子XENP20717包括三个序列，通常被称为“XENP20717HC-Fab”、“XENP20717HC-scFv”和“XENP20717LC”或等同物，但是本领域技术人员可能能够通过序列比对容易地鉴定这些。这些XENP编号在序列表以及标识符中，并且用在附图中。另外，包括三个组分的一个分子产生多个序列标识符。例如，Fab单体的列表具有全长序列、可变重序列和可变重序列的三个CDR；轻链具有全长序列、可变轻序列和可变轻序列的三个CDR；并且scFv-Fc结构域具有全长序列、scFv序列、可变轻序列、3个轻CDR、scFv结构、可变重序列和3个重CDR；应注意，本文中具有scFv结构域的所有分子使用单个带电荷scFv连接子+H，但也可以使用其它的。另外，特定可变结构域的命名法使用“Hx.xx_Ly.yy”类型的格式，数字是特定可变链序列的唯一标识符。因此，XENP22841的Fab侧的可变结构域是“7G8_H3.30_L1.34”，这指示可变重结构域H3.30与轻结构域LI.34组合。在这些序列用作scFv的情况下，名称“7G8_H3.30_L1.34”指示可变重结构域H3.30与轻结构域L1.34组合并且处于从N-末端到C-末端vh-连接子-vl朝向。具有与重和轻可变结构域相同的序列但是处于颠倒顺序的这个分子可被称为“7G8_L1.34_H3.30”。类似地，不同构建体可以“混合并匹配”重链和轻链，如根据序列表和附图将显而易见的。D.定义为了可以更加彻底地理解本申请，下文中阐述了几个定义。此类定义意在涵盖语法等同物。本文中的“消融”意指减小或去除活性。因此，例如，“FcγR消融结合”意指Fc区氨基酸变体与不含特异性变体的Fc区相比具有少于50％的起始结合，优选多于70％到80％到90％到95％到98％的活性损失，并且通常，活性低于Biacore、SPR或BLI测定中的可检测结合的水平。特别用于消融FcγR结合的是图5所示的那些变体，所述变体通常加入到两个单体中。如本文所使用的，“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”意指其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞溶解的细胞介导反应。ADCC与结合FcγRIIIa相关；与FcγRIIIa增加的结合导致ADCC活性增加。如本文所使用的，“ADCP”或抗体依赖性细胞介导的吞噬意指其中表达FcγR的非特异性吞噬细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞吞噬的细胞介导反应。本文中的“抗原结合结构域”或“ABD”意指一组六个互补决定区CDR在作为多肽序列的一部分存在时如本文所讨论的特异性地结合靶抗原。因此，“检查点抗原结合结构域”如本文所概述的结合靶检查点抗原。如本领域所已知的，这些CDR通常作为第一组可变重CDRvhCDR或VHCDR和第二组可变轻CDRvlCDR或VLCDR存在，各自包括三个CDR：重链的vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3以及轻链的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3。CDR分别存在于可变重结构域和可变轻结构域中并且一起形成Fv区。CDR编号方案参见表1和上文相关讨论。因此，在一些情况下，抗原结合结构域的六个CDR源自可变重结构域和可变轻结构域。在“Fab”格式中，一组6个CDR源自两个不同的多肽序列、可变重结构域vh或VH；含有vhCDRl、vhCDR2和vhCDR3和可变轻结构域vl或VL；含有vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3，vh结构域的C-末端与重链的CH1结构域的N-末端连接并且vl结构域的C-末端与恒定轻结构域的N-末端连接并且因此形成轻链。在scFv格式中，vh结构域和vl结构域通常通过使用如本文所概述的连接子“scFv连接子”二价连接到单个多肽序列中，这可以是从N-末端开始vh-连接子-vl或vl-连接子-vh，通常优选的是前者包含各侧上的任选结构域连接子，这取决于所使用的格式例如，根据图1。通常，scFv结构域的C-末端与第二单体中的铰链的N-末端连接。本文中的“修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和或缺失或对与蛋白质化学连接的部分的更改。例如，修饰可以是与蛋白质连接的经更改的碳水化合物或PEG结构。本文中的“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和或缺失。为清楚起见，除非另外指出，否则氨基酸修饰总是用于由DNA编码的氨基酸，例如在DNA和RNA中具有密码子的20个氨基酸。本文中的“氨基酸取代”或“取代”意指用不同的氨基酸来代替亲本多肽序列中的特定位置处的氨基酸。具体地说，在一些实施例中，取代是用于并非天然发生在特定位置处或并非天然发生在生物体内或任何生物体中的氨基酸。例如，取代E272Y是指变体多肽，在这一情况下是指Fc变体，其中位置272处的谷氨酸用酪氨酸代替。为清楚起见，已经被工程化以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸例如，将CGG编码精氨酸换成CGA仍然编码精氨酸以增加宿主生物体表达水平的蛋白质不是“氨基酸取代”；即，尽管产生了编码相同蛋白质的新基因，但是如果蛋白质在其开始的特定位置处具有相同氨基酸，则所述蛋白质不是氨基酸取代。如本文所使用的，“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置处添加氨基酸序列。例如，-233E或233E指代在位置233之后且在位置234之前插入谷氨酸。另外，-233ADE或A233ADE指代在位置233之后且在位置234之前插入AlaAspGlu。如本文所使用的，“氨基酸缺失”或“缺失”意指去除亲本多肽序列中的特定位置处的氨基酸序列。例如，E233-或E233#、E233或E233del指代位置233处的谷氨酸的缺失。另外，EDA233-或EDA233#指代开始于位置233的序列GluAspAla缺失。如本文所使用的，“变体蛋白质”或“蛋白质变体”或“变体”意指借助于与亲本蛋白质相差至少一个氨基酸修饰的蛋白质。与亲本蛋白质相比，蛋白质变体具有至少一个氨基酸修饰，但并没有多得使得变体蛋白质使用如下所述比对程序将不与亲本蛋白质比对。通常，使用下文所述比对程序如BLAST，变体蛋白质如本文所概述的变体Fc结构域等与亲本蛋白质通常至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。如下所述，在一些实施例中，亲本多肽例如Fc亲本多肽是人野生型序列，如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重恒定结构域或Fc区，但是具有变体的人序列还可以用作“亲本多肽”，例如可以包含US公开20060134105的IgG12杂交体。本文中的蛋白质变体将与亲本蛋白质序列优选地拥有至少约80％同一性并且最优选地至少约90％同一性，更优选地至少约95％到98％到99％同一性。因此，如本文所使用的，“抗体变体”或“变体抗体”意指与亲本抗体相差至少一个氨基酸修饰的抗体，如本文所使用的，“IgG变体”或“变体IgG”意指与亲本IgG再次，在一些情况下，来自人IgG序列相差至少一个氨基酸修饰的抗体，并且如本文所使用的，“免疫球蛋白变体”或“变体免疫球蛋白”意指与亲本免疫球蛋白序列相差至少一个氨基酸修饰的免疫球蛋白序列。如本文所使用的，“Fc变体”或“变体Fc”意指包括如与人IgG1、IgG2或IgG4的Fc结构域相比Fc结构域的氨基酸修饰的蛋白质。本发明的Fc变体根据构成其的氨基酸修饰进行定义。因此，例如，N434S或434S是相对于亲本Fc多肽具有位置434处的丝氨酸取代的Fc变体，其中编号是根据EU索引。同样地，M428LN434S定义了相对于亲本Fc多肽具有取代M428L和N434S的Fc变体。WT氨基酸的同一性可能未指明，在此情况下，上述变体被称为428L434S。应注意，提供取代的顺序是任意的，也就是说，例如，N434SM428L是与M428LN434S相同的Fc变体等。对于本发明所讨论的涉及抗体的所有位置，除非另外指出，否则氨基酸位置编号是根据EU索引。EU索引或如Kabat或EU编号方案中的EU索引是指EU抗体的编号。Kabat等人收集了重链和轻链的可变区的多个一级序列。基于，序列的保守度，其将各个一级序列分类成CDR和框架并且做出其列表参见通过引用全文并入的《免疫学上关注的序列SEQUENCESOFIMMUNOLOGICALINTEREST》第5版，NIH出版，号91-3242，E.A.Kabat等人。还参见通过引用全文合并在此的Edelman等人，1969，《美国国家科学院院刊ProcNatlAcadSciUSA》63：78-85。修饰可以是添加、缺失或取代。本文中的“蛋白质”意指至少两个共价连接氨基酸，包含蛋白质、多肽、寡肽和肽。另外，构成本发明的抗体的多肽可以包含一个或多个侧链或末端的合成衍生化、糖基化、聚乙二醇化、循环变换、环化、其它分子的连接子、与蛋白质或蛋白质结构域的融合以及肽标签或标记的加入。如本文所使用的，“残基”意指蛋白质中的位置或其关联氨基酸同一性。例如，天冬酰胺297还被称为Asn297或N297是人类抗体IgG1中位置297处的残基。如本文所使用的，“Fab”或“Fab区”意指包括通常在两个不同的多肽链上的VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽例如，VH-CH1在一个链上并且VL-CL在另一个链上。Fab可以指分离情况下的这个区或本发明的双特异性抗体的上下文中的这个区。在Fab的上下文中，除了CH1和CL结构之外，Fab还包括Fv区。如本文所使用的，“Fv”或“Fv片段”意指包括ABD的VL和VH结构域的多肽。Fv区可以格式化为Fab如上文所讨论的，通常是还包含如上文所概述的恒定区的两个不同的多肽和scFv两者，其中vl和vh结构域组合通常是与如本文所讨论的连接子组合形成scFv。本文中的“单链Fv”或“scFv”意指通常使用如本文所讨论的scFv连接子来与可变轻结构域共价连接以形成scFv或scFv结构域的可变重结构域。scFv结构域可以从N-末端到C-末端处于任一朝向vh-连接子-vl或vl-连接子-vh。在序列表和附图所描绘的序列中，vh和vl结构域的顺序以名称指示，例如，H.XL.Y意指N-末端到C-末端为vh-连接子-vl，并且L.YH.X为vl-连接子-vh。如本文所使用的，“IgG亚类修饰”或“同种型修饰”意指将一个IgG同种型的一个氨基酸转换为不同的比对IgG同种型中的对应氨基酸的氨基酸修饰。例如，因为IgG1包括酪氨酸并且IgG2包括EU位置296处的苯基丙氨酸，因此IgG2的F296Y取代被视为IgG亚类修饰。如本文所使用的，“非天然发生修饰”意指不是同种型的氨基酸修饰。例如，因为人IgG均不包括位置434处的丝氨酸，因此IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其杂交体的取代434S被视为非天然发生修饰。如本文所使用的，“氨基酸”和“氨基酸同一性”意指由DNA和RNA编码的20个天然发生的氨基酸中的一个。如本文所使用的，“效应子功能”意指造成抗体Fc区与FC受体或配置相互作用的生物化学事件。效应子功能包含但不限于ADCC、ADCP和CDC。如本文所使用的，“IgGFc配体”意指来自与IgG抗体的Fc区结合形成FcFc配体复合物的任何生物体的分子尤其是多肽。Fc配体包含但不限于FcγRI、FcγRII、FcγRIII、FcRn、Clq、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒性FcγR。Fc配体还包含Fc受体同源物FcRH，所述Fc受体同源物是与FcγR同源的Fc受体家族Davis等人，2002，《免疫学评论ImmunologicalReviews190：123-136。Fc配体可以包含结合Fc的未发现的分子。特别的IgGFc配体是FcRn和Fcγ受体。如本文所使用的，“Fc配体”意指来自与抗体的Fc区结合形成FcFc配体复合物的任何生物体的分子尤其是多肽。如本文所使用的，“Fcγ受体”或“FcγRFcgammaR”意指结合IgG抗体Fc区并由FcγR基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人类中，这个家族包含但不限于：FcγRICD64，包含同型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRIICD32，包含同种型FcγRIIa包含同种异型H131和R131、FcγRIIb包含FcγRIIb-1和FcγRIIb-2和FcγRIIc；以及FcγRIIICD16，包含同种型FcγRIIIa包含V158和F158和FcγRIIIb包含同种异型FcγRIIb-NAl和FcγRIIb-NA2Jefferis等人，2002，《免疫学快报ImmunolLett82：57-65》以及任何未发现的人FcγR或FcγR同种型或同种异型。FcγR可以来自任何生物体，包含但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包含但不限于FcγRICD64、FcγRIICD32、FcγRIIICD16和FcγRIII-2CD16-2以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同种型或同种异型。如本文所使用的，“FcRn”或“新生的Fc受体”意指结合IgG抗体Fc区并至少部分地由FcRn基因编码的蛋白质。FcRn可以来自任何生物体，包含但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。如本领域已知的，功能FcRn蛋白包括两种肽，常常被称为重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白并且重链由FcRn基因编码。除非本文中另外指出，否则FcRn或FcRn蛋白是指FcRn重链与β-2-微球蛋白的复合物。各种FcRn变体用于增加与FcRn受体的结合并且在一些情况下用于增加血清半衰期。“FcRn变体”是增加与FcRn受体的结合的变体，并且下文中示出了适合的FcRn变体。如本文所使用的，“亲本多肽”意指随后修饰以生成变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然发生的多肽或者天然发生的多肽的变体或工程化版本。因此，如本文所使用的，“亲本免疫球蛋白”意指被修饰以生成变体的未修饰免疫球蛋白多肽，并且如本文所使用的，“亲本抗体”意指被修饰以生成变体抗体的未修饰抗体。应注意，“亲本抗体”包含如下文所概述的、已知商用重组产生抗体。在这个上下文中，“亲本Fc结构域”将是相对于所列变体；因此，将“变体人IgG1Fc结构域”与人IgG1的亲本Fc结构域相比较，将“变体人IgG4Fc结构域”与亲本Fc结构域人IgG4相比较，等等。如本文所使用的，“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”意指包括IgG分子的CH2-CH3结构域并且在一些情况下包含铰链的多肽。在对人IgG1进行EU编号时，CH2-CH3结构域包括氨基酸231到447，并且铰链为216到230。因此，“Fc结构域”的定义包含氨基酸231到447CH2-CH3或216到447铰链-CH2-CH3或其片段。在这个上下文中，“Fc片段”可以从N-末端和C-末端中的任一者或两者含有较少氨基酸但仍保持能够与另一个Fc结构域或Fc片段形成二聚体，如可以使用通常基于大小的标准方法例如，非变性色谱法、大小排阻色谱法等检测到的。人IgGFc结构域特别用于本发明，并且可以是来自人IgG1、IgG2或IgG4的Fc结构域。如与亲本Fc结构域相比，“变体Fc结构域”包含氨基酸修饰。因此，“变体人IgGFc结构域”是如与人IgG1Fc结构域相比含有氨基酸修饰通常是氨基酸取代，但是在消融变体的情况下，包含氨基酸缺失的变体Fc结构域。通常，变体Fc结构域与对应的亲本人IgGFc结构域具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性使用下文所讨论的同一性算法，其中一个实施例利用如本领域已知的BLAST算法，使用默认参数。可替代地，变体Fc结构域如与亲本Fc结构域相比可以具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸修饰。另外，如本文所讨论的，本文中的变体Fc结构域仍然保持与另一个Fc结构域形成二聚体的能力，如使用本文所述已知技术如非变性凝胶电泳所测量的。本文中的“重链恒定区”意指抗体或其片段的CH1-铰链-CH2-CH3部分，不包含可变重结构域；在人IgG1的EU编号中，这是氨基酸118到447.本文中的“重链恒定片段”意指从N-末端和C-末端中的任一者或两者含有较少氨基酸但仍保持能够与另一个重链恒定区形成二聚体的重链恒定区。如本文所使用的“位置”意指蛋白质的序列中的位置。位置可以顺序地或根据已建立格式例如抗体编号EU索引进行编号。如本文所使用的，“靶抗原”意指通过包括可变区或给定抗体的抗原结合结构域来特异性地结合的分子。如下文所讨论的，在此情况下，靶抗原是检查点抑制蛋白。在本文中，在本发明的异源二聚体抗体的单体的上下文中，“链型strandedness”意指，类似于DNA的“相匹配”的两个链，异源二聚体化变体合并到每个单体中以保存“相匹配”以形成异源二聚体的能力。例如，如果一些pI变体被工程化为单体A例如，使pI更高，则属于也可以利用的“电荷对”的空间变体不干扰pI变体，例如使pI更高的电荷变体被放在同一个“链”或“单体”上以保存两者的功能。类似地，对于如下文更充分地概述的以成对的组出现的“倾斜”变体，技术人员将认为pI决定所述对中的一组将会进入的链或单体，从而使得还使用倾斜变体的pI使pI分离最大化。如本文所使用的，“靶细胞”意指表达靶抗原的细胞。在本文中，在产生根据本发明的双特异性抗体的上下文中，“宿主细胞”意指含有编码双特异性抗体的组分的外源性核酸并且能够在适合条件下表达双特异性抗体的细胞。下文中讨论了适合的宿主细胞。如本文所使用的，“可变区”或“可变结构域”意指包括基本上由分别构成κ、λ和重链免疫球蛋白基因位点的Vκ、Vλ、和或VH基因编码的一个或多个Ig结构域并且含有赋予抗原特异性的CDR的免疫球蛋白。因此，“可变重结构域”与“可变轻结构域”配对以形成抗原结合结构域“ABD”。另外，每个可变结构域包括从氨基-末端到羧基-末端按以下顺序安排的三个高变区“互补决定区”、“CDR”可变重结构域的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3和以及可变轻结构域的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3和四个框架区FR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。在本文中，“野生型或WT”意指在自然界发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包含等位变异。WT蛋白质具有尚未有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。本发明提供了与人类抗体结构域具有序列同一性的多个抗体结构域。两个类似序列之间的序列同一性例如，抗体可变结构域可以通过如以下的算法等算法测量：Smith，T.F.和Waterman，M.S.1981“生物序列比较ComparisonOfBiosequences”《应用数学进展Adv.Appl.Math.》2：482[局部同源性算法]；Needleman，S.B.和Wunsch，CD.1970“适用于搜索两种蛋白质的氨基酸序列的相似性的通用方法AGeneralMethodApplicableToTheSearchForSimilaritiesInTheAminoAcidSequenceOfTwoProteins”，《分子生物学杂志J.Mol.Biol.》48：443[同源性比对算法]；Pearson，W.R.和Lipman，D.J.1988“用于生物学序列比较的改进工具ImprovedToolsForBiologicalSequenceComparison”《美国国家科学院院刊Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.》85：2444[相似性搜索方法]；或Altschul，S.F.等人，1990“基础局部比对搜索工具BasicLocalAlignmentSearchTool”《分子生物学杂志J.Mol.Biol.》215：403-10，“BLAST”算法，参见https：blast.nchi.nlm.nih.govBlast.cgi。在使用任何上述算法时，使用默认参数针对窗口长度、空位罚分等。在一个实施例中，使用默认参数用BLAST算法来完成序列同一性。本发明的抗体是通常是分离的或重组的。在用于描述本文所公开的各种多肽时，“分离”意指已经被鉴定出来并且与表达其的细胞或细胞培养物分离和或从其恢复的多肽。一般而言，分离多肽将通过至少一个纯化步骤来制备。“分离抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体。“重组”意指在外源性宿主细胞使用重组核酸技术生成抗体，并且也可以分离抗体。“特异性结合”或“特异性地结合”或“特异于”特定抗原或表位意指可测量地不同于非特异性相互作用的结合。可以例如通过相比于对照分子的结合确定分子的结合来测量特异性结合，所述对照分子通常是具有无结合活性的类似结构的分子。例如，可以通过与类似于靶标的对照分子竞争来确定特异性结合。特定抗原或表位的特异性结合可以例如通过具有KD为以下的抗原或表位的抗体来展现：至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、可替代地至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M或更大，其中KD是指特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。典型地，相对于抗原或表位，特异性地结合抗原的抗体将具有比对照分子大20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍的KD。而且，特定抗原或表位的特异性可以例如通过具有KA或Ka为以下的抗原或表位的抗体来展现：相对于对照物，比表位大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍，其中KA或Ka是指特定的抗体-抗原相互作用的缔合速率。结合亲和力通常使用Biacore、SPR或BLI测定法来测量。E.抗体如本文所讨论的，本发明涉及生成结合两种不同的检查点抗原的双特异性检查点抗体。如下文所讨论的，通常使用术语“抗体”。用于本发明的抗体可以采取如本文所描述的多种格式，包含本文所描述的和附图所描绘的传统抗体以及抗体衍生物、片段和模拟物。传统抗体结构单位通常包括四聚体。每个四聚体通常由两对相同的多肽链构成，每对具有一条“轻”链通常，分子量为约25kDa和一条“重”链通常，分子量为约50kDa到70kDa。人轻链分类为κ和λ轻链。本发明涉及通常基于IgG类的双特异性抗体，所述IgG类具有多个亚类，包含但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。通常，IgG1、IgG2和IgG4比IgG3使用得更频繁。应注意，IgG1在356D或E和358L或M具有带多态现象的不同同种异型。本文所描绘的序列使用356E358M同种异型，然而，其它同种异型也包含在本文中。即，包含本文所包含的IgG1Fc结构域的任何序列可以具有代替356E358M同种异型的356D358L。另外，本文中的许多抗体具有被丝氨酸代替的在位置220处的半胱氨酸中的至少一个；通常，这是在本文所描绘的大多数序列的“scFv单体”侧上，但是其也可以是在“Fab单体”侧上或在两者上以减少二硫化物形成。在本文中，被代替的这些半胱氨酸C220S中的一个或两个特异性地包含在序列中。因此，如本文所使用的，“同种型”意指免疫球蛋白的由其恒定区的化学和抗原特性定义的任何亚类。应理解，治疗性抗体还可以包括同种型和会亚类的杂交体。例如，如通过引用合并的美国公开20090163699所示，本发明使用人IgG1G2杂交体。高变区通常涵盖从轻链可变区中的约氨基酸残基24到34LCDR1；“L”表示轻链、50到56LCDR2和89到97LCDR3的氨基酸残基和在重链可变区中的约31到35BHCDR1；“H”表示重链、50到65HCDR2和95到102HCDR3周围的氨基酸残基；Rabat等人，《免疫学上关注的蛋白质序列SEQUENCESOFPROTEINSOFIMMUNOLOGICALINTEREST》第5版，公共卫生署PublicHealthService，国立卫生研究院NationalInstitutesofHealth，贝塞斯达Bethesda，马里兰州Md.1991和或形成高变环的那些残基例如，在轻链可变区中的残基26到32LCDR1、50到52LCDR2和91到96LCDR3以及在重链可变区中的26到32HCDR1、53到55HCDR2和96到101HCDR3；Chothia和Lesk1987《分子生物学杂志J.Mol.Biol.》196：901-917。下文中描述了本发明的特异性CDR。如本领域技术人员将了解的，在不同的编号系统中，CDR的精确编号和放置可以有所不同。然而，应理解，可变重和或可变轻序列的公开内容包含关联固有CDR的公开内容。因此，每个可变重区的公开内容是vhCDR的公开内容例如，vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3，并且每个可变轻区的公开内容是vlCDR的公开内容例如，vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3。CDR编号的有用比较如下，参见Lafranc等人，《发展免疫学与比较免疫学Dev.Comp.Immunol.》271：55-772003：表1Kabat+ChothiaIMGTRabatAbMChothiaContactXencorvhCDR126-3527-3831-3526-3526-3230-3527-35vhCDR250-6556-6550-6550-5852-5647-5854-61vhCDR395-102105-11795-10295-10295-10293-101103-116vlCDR124-3427-3824-3424-3424-3430-3627-38vlCDR250-5656-6550-5650-5650-5646-5556-62vlCDR389-97105-11789-9789-9789-9789-9697-105贯穿本说明书，在提及可变结构域中的残基大致上，轻链可变区的残基1到107和重链可变区的残基1到113时通常使用Kabat编号系统，并且EU编号系统用于Fc区例如，Kabat等人，同上1991。重链的另一种类型的Ig结构域是铰链区。在本文中，“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”意指包括抗体的第一恒定结构域与第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgGCH1结构域在EU位置215处结束，并且IgGCH2结构域开始于残基EU位置231。因此，对于IgG，抗体铰链在本文中被定义为包含位置216IgG1中的E216到230IgG1中的p230，其中编号是根据如Kabat的EU索引。在一些情况下，使用“铰链片段”，所述铰链片段在铰链结构域的N-末端和C-末端中的任一者或两者处含有较少氨基酸。如本文所指出的，pI变体也可以处于铰链区中。轻链通常包括可变轻结构域含有轻链CDR并且与与可变重结构域一起形成Fv区和恒定轻链区常被称为CL或Cκ这两个结构域。下文所概述的、额外取代所关注的另一个区是Fc区。本发明提供了大量不同的CDR组。在此情况下，“完整的CDR组”包括三个可变轻CDR和三个可变重CDR，例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3。郑重地，这些可以是较大的可变轻结构域或可变重结构域的一部分。另外，如本文中更充分地概述的，在使用重链和轻链时例如，在使用Fab时，可变重结构域和可变轻结构域可以在各自的多肽链上，或者在scFv序列的情况下，在多肽单链上。CDR促进了抗原结合或更具体地抗体的表位结合位的形成。“表位”是指与被称为互补位的抗体分子的可变轻中的特异性抗原结合位相互作用的决定簇。表位是如氨基酸或糖侧链等分子的基团grouping并且通常具有特定结构特性以及特定电荷特性。单个抗原可以具有多于一个表位。表位可以包括直接参与结合的氨基酸残基还被称为表位的免疫显性组分以及不直接参与结合的其它氨基酸残基，如被特异性地抗原结合的肽有效地阻断的氨基酸；换句话说，氨基酸残基在特异性地抗原结合的肽的足迹内。表位可以是构象的或线性的。构象表位由来自线性多肽链的不同片段的在空间上并列的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构象表位与非构象表位的区别可以在于，在变性溶剂的存在下，丧失了与前者而非后者的结合。在独特的空间构象中，表位典型地包含至少3个并且更常见地至少5个或8个到10个氨基酸。识别相同表位的抗体可以用简单的免疫测定法来验证，所述免疫测定法示出了一个抗体阻断另一个抗体结合靶抗原的能力，例如“分仓”。如下文所概述的，本发明不仅包含本文中枚举的抗原结合结构域和抗体，还包含竞争结合枚举的抗原结合结构域所结合的表位的那些。因此，本发明提供了不同的抗体结构域。如本文所述以及本领域已知的，本发明的异源二聚体抗体包括重链和轻链内的不同结构域，所述结构域也可以重叠。这些结构域包含但不限于Fc结构域、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、铰链结构域、重恒定结构域CH1-铰链-Fc结构域或CH1-铰链-CH2-CH3、可变重结构域、可变轻结构域、轻恒定结构域、Fab结构域和scFv结构域。因此，“Fc结构域”包含-CH2-CH3结构域以及任选地铰链结构域-H-CH2-CH3。在本文中的实施例中，在scFv与Fc结构域连接时，scFv构建体的C-末端与Fc结构域的铰链的全部或部分连接；例如，其通常与铰链的开始即序列EPKS连接。重链包括可变重结构域和恒定结构域，所述恒定结构域包含包括CH2-CH3的CH1-任选铰链-Fc结构域。轻链包括可变轻链和轻恒定结构域。scFv包括可变重链、scFv连接子和可变轻结构域。在本文所概述的大多数构建体和序列中，可变重链的C-末端与scFv连接子的N-末端连接，scFv连接子的C-末端与可变轻链的N-末端连接N-vh-连接子-vl-C，但是可以切换N-vl-连接子-vh-C。本发明的一些实施例包括至少一个scFv结构域，所述至少一个scFv结构域虽然不是天然发生的但是通常包含通过scFv连接子连接在一起的可变重结构域和可变轻结构域。如本文所概述的，虽然scFv结构域通常从N-末端到C-末端朝向成vh-scFv连接子-vl，但是对于任何scFv结构域或使用Fab的vh和vl序列构建的那些，这可以颠倒成vl-scFv连接子-vh，一端或两端处的任选连接子取决于格式通常参见图1。如本文所示，存在可以用于共价连接所列结构域的多个适合的连接子用于用作结构域连接子或scFv连接子，包含通过重组技术生成的传统肽键。在一些实施例中，连接子肽可以主要包含以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。连接子肽应当具有足够以这样的方式连接两个分子的长度：所述分子假设相对于彼此的正确构象使得其保留期望活性。在一个实施例中，连接子在长度上为约1个到50个氨基酸，在长度上优选地约1个到30个氨基酸。在一个实施例中，可以使用长度为1个到20个氨基酸的连接子，在一些实施例中使用约5个到约10个氨基酸。有用的连接子包含：甘氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其它柔性连接子，所述甘氨酸-丝氨酸聚合物包含例如GSn、GSGGSnSEQIDNO：37756、GGGGSnSEQIDNO：37757和GGGSnSEQIDNO：37758，其中n是至少为一并且通常为3到4的整数。可替代地，各种非蛋白质聚合物可以用作连接子，包含但不限于聚乙二醇PEG、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。其它连接子序列可以包含具有任何长度的CLCH1结构域的任何序列，但并非CLCH1结构域的所有残基；例如，CLCH1结构域的前5个到12个氨基酸残基。连接子可以衍生自免疫球蛋白轻链，例如Cκ或Cλ。连接子可以衍生自任何同种型免疫球蛋白重链，包含例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε和Cμ。连接子序列还可以衍生自其它蛋白质，如类Ig蛋白例如，TCR、FcR、KIR、铰链区衍生序列以及来自其它蛋白质的其它天然序列。在一些实施例中，连接子是“结构域连接子”，用于将如本文所概述的任何两个结构域连接在一起。例如，在图1F中，可以有将Fab的CH1结构域的C-末端与scFv的N-末端连接的结构域连接子，另一个任选的结构域连接子将scFv的C-末端与CH2结构域连接但是，在许多实施例中，铰链用作此结构域连接子。虽然可以使用任何适合的连接子，但是许多实施例利用甘氨酸-丝氨酸聚合物作为结构域连接子以及允许以足够允许每个域保持其生物学功能的长度和柔性来重组连接这两个结构域的任何肽序列，所述甘氨酸-丝氨酸聚合物包含例如GSn、GSGGSnSEQIDNO：37756、GGGGSnSEQIDNO：37757和GGGSnSEQIDNO：37758，其中n是至少为一并且通常为3到4到5的整数。在一些情况下并且在注意“链型”时，如下文所概述的，可以使用如scFv连接子的一些实施例中所使用的带电荷结构域连接子。在一些实施例中，连接子是scFv连接子，用于共价连接如本文所讨论的vh和vl结构域。在一些情况下，scFv连接子是带电荷scFv连接子，多个带电荷scFv连接子示出在图7中。因此，本发明进一步提供了带电荷scFv连接子以用于促进第一单体与第二单体之间的pI分离。即，通过并入带正电荷或带负电荷或在使用不同单体上的scFv的支架的情况下两者皆有的带电荷scFv连接子，这允许包括带电荷连接子的单体更改pI而不对Fc结构域做出进一步改变。这些带电荷连接子可以被取代到含有标准连接子的任何scFv中。再次，如本领域技术人员将了解的，根据期望的pI变化，带电荷scFv连接子用在正确的“链”或单体上。例如，如本文所讨论的，为了形成三重F格式的异源二聚体抗体，计算每个期望抗原结合结构域的Fv区的原始pI，并且一个被选择成形成scFv，并且根据pI，选择正或负连接子。带电荷结构域连接子还可以用于增加本发明的单体的pI分离，并且因此图7所包含的那些在本文中可以用于利用连接子的任何实施例中。具体来说，图1所描绘的格式是抗体，通常被称为“异源二聚体抗体”，意指蛋白质具有自组装成异源二聚体Fc结构域的至少两个关联Fc序列的以及至少两个Fv区，无论是作为Fab还是作为scFv。F.嵌合抗体和人源化抗体在某些实施例中，本发明的抗体包括来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。例如，此类抗体可以包括包含是特定种系序列的“产物”或“衍生自”特定种系序列的重链区或轻链区的人类抗体或由其构成。是人类种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生自”人类种系免疫球蛋白序列的人类抗体可以通过以下而被鉴定为是这样：将人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，并选择在序列上最接近即，最大％同一性人类抗体的序列的人类种系免疫球蛋白序列。是特定人类种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生自”特定人类种系免疫球蛋白序列的人类抗体与种系序列相比，可能由于例如天然发生的体细胞突变或故意引入的定点突变而含有氨基酸差异。然而，人源化抗体典型地与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上具有至少90％的同一性，并且在与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列例如，鼠类种系序列进行比较时，含有将抗体鉴定为衍生自人类序列的氨基酸残基。在某些情况下，人源化抗体可以与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上至少95％、96％、97％、98％或99％，或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。典型地，衍生自特定人类种系序列的人源化抗体将显示出与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不多于10个到20个氨基酸差异在引入本文中的任何倾斜变体、pI变体和消融变体之前；即，在引入本发明的变体之前，变体数目通常较低。在某些情况下，人源化抗体可以显示出与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不多于5个或甚至不多于4个、3个、2个或1个氨基酸差异再次，在引入本文中的任何倾斜变体、pI变体和消融变体之前；即，在引入本发明的变体之前，变体数目通常较低。在一些实施例中，亲本抗体已经亲和力成熟，如本领域已知的。可以对人源化和亲和力成熟采用基于结构的方法，例如如USSN11004,590所述。可以采用基于选择的方法来使抗体可变区人源化和或亲和力成熟，包含但不限于均通过引用以其全文合并的以下所描述的方法：Wu等人，1999，《分子生物学杂志J.Mol.Biol.》294：151-162；Baca等人，1997，《生物化学杂志J.Biol.Chem.》27216：10678-10684；Rosok等人，1996《生物化学杂志J.Biol.Chem.》27137：22611-22618；Rader等人，1998，《美国国家科学院院刊Proc.Natl.Acad.Sci.USA》95：8910-8915；Krauss等人，2003，《蛋白质工程ProteinEngineering》1610：753-759。其它人源化方法可以涉及CDR的仅一部分的移植，包含但不限于均通过引用以其全文并入的以下所描述的方法：USSN09810,510；Tan等人，2002，《免疫学杂志J.Immunol.》169：1119-1125；DePascalis等人，2002，《免疫学杂志J.Immunol.》169：3076-3084。IV.异源二聚体抗体因此，在一些实施例中，本发明提供了依赖于使用将自组装形成异源二聚体Fc结构域和异源二聚体抗体的两个不同的重链变体Fc序列的异源二聚体检查点抗体。本发明涉及用于提供允许与多于一种检查点抗原或配体结合例如允许双特异性结合的异源二聚体抗体的新型构建体。异源二聚体抗体构建体是基于抗体的重链的两个Fc结构域的自组装性，例如组装成“二聚体”的两个“单体”。通过更改每个单体的氨基酸序列来形成异源二聚体抗体，如下文中更加充分地讨论的。因此，本发明总体上涉及创建异源二聚体检查点抗体，所述异源二聚体检查点抗体可以通过多种方式共同接合抗原，这依赖于在每个链上有所不同以促进异源二聚体形成和或允许相比于同源二聚体易于纯化异源二聚体的、在恒定区中的氨基酸变体。因此，本发明提供了双特异性抗体。抗体技术中始终存在的问题是期望“双特异性”抗体，所述双特异性抗体与两种不同的抗原同时结合，通常因此允许使不同抗原接近并产生新功能和新疗法。通常，这些抗体通过包含每个重链和轻链的基因而形成在宿主细胞中。这通常导致期望的异源二聚体A-B以及两个同源二聚体A-A和B-B不包含轻链异源二聚体问题形成。然而，形成双特异性抗体的主要阻碍是难以纯化异源二聚体抗体远离同源二聚体抗体和或相比于同源二聚体的形成偏置异源二聚体的形成。存在多种机制可以用于生成本发明的异源二聚体。另外，如本领域技术人员将了解的，这些机制可以组合以确保高异源二聚体化。因此，导致异源二聚体产生的氨基酸变体被称为“异源二聚体化变体”。如下文所讨论的，异源二聚体化变体可以包含空间变体例如，下文所述“隆突与空穴”或“倾斜”变体和下文所述“电荷对”以及“pI变体”，这允许纯化同源二聚体远离异源二聚体。如通过引用以其全文合并在此并且特别如下文用于讨论“异源二聚体化变体”的WO2014145806中总体上描述的，用于异源二聚体化的有用机制包含“隆突与空穴”“KIH”；在本文中有时被称为“倾斜”变体参见WO2014145806中的讨论、如WO2014145806中所描述的“等电转向”或“电荷对”、如WO2014145806中所描述的pI变体以及如WO2014145806中和下文所概述的一般额外Fc变体。在本发明中，存在几种基本机制可以导致易于纯化异源二聚体化抗体；一种机制依赖于使用pI变体，使得每个单体具有不同pI，从而允许等电纯化A-A、A-B和B-B二聚体蛋白。可替代地，一些支架格式如“三重F”格式”也允许基于大小进行分离。如下文中进一步概述的，还可能相比于同源二聚体“倾斜”异源二聚体的形成。因此，空间异源二聚体化变体与pI或电荷对变体的组合特别用于本发明。通常，特别用于本发明的实施例依赖于包含倾斜变体的变体组，所述倾斜变体相比于同源二聚体化形成鼓励异源二聚体化形成、与pI变体偶联，所述pI变体增加两个单体之间的pI差异以促进纯化异源二聚体远离同源二聚体。另外，如下文更充分地概述的，根据异源二聚体抗体的格式，单体的恒定和或Fc结构域内可以含有pI变体，或者可以使用带电荷连接子，结构域连接子或scFv连接子。即，利用如三重F格式等一个或多个scFv的支架可以包含出于纯化的目的给出另外的pI助推的带电荷scFv连接子带正电荷或负电荷。如本领域技术人员将了解的，一些三重F格式可与仅带电荷scFv连接子一起使用而无额外的pI调整，但是本发明还提供了在单体中的一个或两个上的pI变体和或带电荷结构域连接子。另外，用于替代性功能的额外氨基酸工程还可以赋予pI变化，如Fc、FcRn和KO变体。在将pI用作分离机制以允许纯化异源二聚体蛋白的本发明中，可以将氨基酸变体引入到单体多肽中的一个或两个中；即，可以使单体中的一个为了简便在本文中被称为“单体A”的pI工程化远离单体B，或可以改变单体A和单体B两者，其中单体A的pI增加并且单体B的pI减少。如所讨论的，任一个或两个单体的pI变化可以通过以下来完成：去除或添加带电荷残基例如，用带正电荷或带负电荷的氨基酸残基来代替中性氨基酸，例如甘氨酸到谷氨酸、将带电荷残基从带正电或带负电改变为相反电荷例如，天冬氨酸到赖氨酸或将带电荷残基改变为中性残基例如，电荷损失；赖氨酸到丝氨酸。多种这些变体示出在附图中。因此，本发明的这个实施例提供了产生单体中的至少一个的充分pI变化，从而使得异源二聚体可以与同源二聚体分离。如本领域技术人员将了解的并且如下文中进一步讨论的，这可以通过以下来完成：使用“野生型”重链恒定区和已经工程化以增大或减小其pI的变体区wtA-+B或wtA--B或增大一个区并减小另一个区A+-B-orA-B+。因此，通常，本发明的一些实施例的组分是抗体的恒定区中的氨基酸变体，所述氨基酸变体涉及通过将氨基酸取代“pI变体”或“pI取代”合并到单体中的一个或两个中来更改单体中的至少一个如果不是两个的话的等电点pI以形成“pI抗体”。如本文所示，异源二聚体与两个同源二聚体的分离可以在两个单体的pI相差少至0.1个pH单位时完成，0.2个、0.3个、0.4个和0.5个或更多个pH单位均用于本发明。如本领域技术人员将了解的，每一个或两个单体上要包含的用于得到良好分离的pI变体数目将部分地取决于组分的起始pI，例如在三重F格式中，所关注的scFv和Fab的起始pI。即，为了确定工程化哪个单体或处于哪个“方向”例如，更具阳性或更具阴性，计算这两个靶抗原的Fv序列并据此作出决定。如本领域所已知的，不同的Fv将具有不同的起始pI，本发明中运用了所述起始pI。通常，如本文所概述的，将pI工程化以使各个单体的总pI差为至少约0.1logS，如本文所概述的优选0.2logS到0.5logS。此外，如本领域技术人员将了解的并且如本文所概述的，在一些实施例中，可以基于大小来使异源二聚体与同源二聚体分离。如图1所示，例如，几种格式允许基于大小来分离异源二聚体和同源二聚体。A.异源二聚体化变体本发明提供了异源二聚体蛋白，包含各种形式的异源二聚体抗体，所述异源二聚体抗体利用了异源二聚体变体以允许异源二聚体形成和或纯化远离同源二聚体。存在适合的多对异源二聚体化倾斜变体组。这些变体以成“对”的“组”出现。即，所述对中的一组并入第一单体中并且所述对中的另一组并入第二单体中。应注意，这些组不一定表现为“隆突入空穴”变体，一个单体上的残基与另一个单体上的残基一一对应；即，这些对组形成了两个单体之间的相互作用，所述相互作用鼓励异源二聚体形成并且阻止同源二聚体形成，从而允许在生物学条件下自发形成的异源二聚体的百分比超过90％，而非预期的50％25％同源二聚体AA：50％异源二聚体AB：25％同源二聚体BB。B.空间变体在一些实施例中，可以通过添加空间变体来促进异源二聚体形成。即，通过改变每个重链中的氨基酸，相比于与相同的Fc氨基酸序列形成同源二聚体，不同的重链更有可能相关联形成异源二聚体结构。附图中包含了适合的空间变体。一种机制在本领域中通常被称为“隆突与空穴”，是指创建空间影响以有利于异源二聚体形成并且不利于同源二聚体形成的氨基酸工程也可以任选地使用；这有时被称为“隆突与空穴”，如以下所描述的：USSN61596,846；Ridgway等人，《蛋白质工程ProteinEngineering》97：6171996；Atwell等人，《分子生物学杂志J.Mol.Biol.》1997270：26；美国专利号8,216,805，以上均通过引用以其全文并入本文。附图标识了依赖于“隆突与空穴”的多对“单体A-单体B”。另外，如Merchant等人《自然生物技术NatureBiotech.》16：6771998所述，这些“隆突与空穴”突变可以与二硫键组合以使形成向异源二聚体化倾斜。用于生成异源二聚体的额外机制有时被称为“静电转向”，如通过引用以其全文合并在此的Gunasekaran等人《生物化学杂志J.Biol.Chem.》28525：196372010所述。这在本文中有时被称为“电荷对”。在这个实施例中，静电用于使形成向异源二聚体化倾斜。如本领域技术人员将了解的，这些电荷对还可以对pI有作用并因此对纯化有作用，并且因此在一些情况下还可以被视为pI变体。然而，由于这些电荷对被生成为迫使异源二聚体化并且不用作纯化工具，因此其被分类为“空间变体”。这些电荷对包含但不限于与D221RP228RK409R配对的D221EP228EL368E例如，这些是“单体对应组”和与C220RE224RP228RK409R配对的C220EP228E368E。可以任选且独立地以任何数量与其它变体如本文所概述的pI变体或US20120149876的图37所示的其它空间变体组合的额外的单体A和单体B变体，US20120149876的附图和图例以及SEQIDNO通过引用明确地并入本文中。在一些实施例中，本文所概述的空间变体可以任选且独立地与任何pI变体或其它变体，如Fc变体、FcRn变体等合并到一个或两个单体中，并且可以独立且任选地包含在内或并不包含在本发明的蛋白质中。适合的倾斜变体的列表见于图3和图8，示出了在一些实施例中的一些成对的特定用途。包含但不限于以下的成对的组特别用于一些实施例中：S364KE357Q：L368DK370S；L368DK370S：S364K；L368EK370S：S364K；T411TE360EQ362E：D401K；L368DK370S：S364KE357L；K370S：S364KE357Q和T366SL368AY407V：T366W任选地包含桥接二硫化物T366SL368AY407VY349C：T366WS354C。就命名法而言，“S364KE357Q：L368DK370S”对意指单体中的一个具有双变体组S364KE357Q并且另一个具有双变体组L368DK370S；如上，这些“链型”对取决于起始pI。C.异源二聚体的pI等电点通常，如本领域技术人员将了解的，存在两种一般类别的pI变体：增大蛋白质的pI碱性变化的那些和减小蛋白质的pI酸性变化的那些。如本文所述，可以完成这些变体的所有组合：一个单体可以属于野生型或是不显示出与野生型显著不同的pI的变体，并且另一个可以更具碱性或更具酸性。可替代地，改变各个单体，一个改为更具碱性并且一个改为更具酸性。pI变体的优选组合示出在图4中。如本文所概述的和附图所示的，这些变化是相对于IgG1示出的，但是可以以此方式更改所有同种型以及同种型杂交体。在重链恒定结构域来自IgG2到IgG4的情况下，也可以使用R133E和R133Q。在一个实施例中，例如在图1A、图1E、图1F、图1G、图1H和图1I的格式中，pI变体的优选组合具有包括208D295E384D418E421D变体在相对于人IgG1时是N208DQ295EN384DQ418EN421D的一个单体负Fab侧和包括带正电荷的scFv连接子的第二单体正scFv侧，所述带正电荷的scFv连接子包含GKPGS4SEQIDNO：37755。然而，如本领域技术人员将了解的，第一单体包含CH1结构域，所述CH1结构域包含位置208。因此，在不包含CH1结构域的构建体例如，针对不在结构域中的一个上利用CH1结构域的抗体，例如以双scFv格式或“单臂”格式，如图1B、图1C或图1D所描绘的那些格式中，优选的负pI变体Fc组包含295E384D418E421D变体在相对于人IgG1时是Q295EN384DQ418EN421D。因此，在一些实施例中，一个单体具有来自图4的一组取代并且另一个单体具有带电荷连接子呈带电荷scFv形式，因为那个单体包括如格式所指示的scFv或带电荷结构域连接子，所述带电荷结构域连接子可以选自图7所描绘的那些。1.同种型变体另外，本发明的许多实施例依赖于特定位置处的pI氨基酸从一个IgG同种型到另一个的“输入”，由此降低或消除将不想要的免疫原性引入变体中的可能性。多个这些示出在通过引用合并在本文中的美国公开20140370013的图21中。即，出于各种原因，IgG1是治疗性抗体的常用同种型，包含高效应子功能。然而，IgG1的重恒定区具有比IgG2的pI更高的pI8.10相比于7.31。通过将特定位置处的IgG2引入到IgG1主链中，所得单体的pI降低或增高并且另外展现出更长的血清半衰期。例如，IgG1具有位置137处的甘氨酸pI为5.97，并且IgG2具有谷氨酸pI为3.22；输入谷氨酸将影响所得蛋白质的pI。如下文所描述的，通常需要多个氨基酸取代来显著影响变体抗体的pI。然而，应注意，如下文所讨论的，即便是IgG2分子发生变化也允许血清半衰期增加。在其它实施例中，作出了非同种型氨基酸改变，以便降低所得蛋白质的总电荷状态例如，通过将较高pI氨基酸改为较低pI氨基酸或为了稳定而允许调节结构等，如下文中更进一步描述的。另外，通过pI工程化重和轻恒定结构域，可以看到异源二聚体的每个单体的显著变化。如本文所讨论的，使两个单体的pI相差至少0.5可以允许通过离子交换色谱法或等电聚焦或对等电点敏感的其它方法进行分离。D.计算pI每个单体的pI可以取决于变体重链恒定结构域的pI和总单体的pI，所述总单体包含变体重链恒定结构域和融合配偶体。因此，在一些实施例中，使用美国公开20140370013的图19中的图表、基于变体重链恒定结构域来计算pI变化。如本文所讨论的，要工程化哪个单体通常由Fv和支架区的固有pI来决定。可替代地，可以比较各个单体的pI。E.还赋予了更好的FcRn体内结合的pI变体在pI变体减小单体的pI的情况下，其可以具有提高体内血清固位的额外益处。尽管仍是在检查的情况下，据信，Fc区具有更长的体内半衰期，因为在核内体中、在pH为6时与FcRn的结合螯合了FcGhetie和Ward，1997《今日免疫学ImmunolToday.》1812：592-598，通过引用全部并入。核内体隔区然后使Fc循环到细胞表面。一旦隔区向胞外空间打开，则约7.4的较高pH诱导将Fc释放回到血液中。在小鼠中，Dall′Acqua等人示出了，在pH为6和pH为7.4时具有增加的FcRn结合的Fc突变体实际上具有降低的血清浓度和与野生型Fc相同的半衰期Dall′Acqua等人，2002，《免疫学杂志J.Immunol.》169：5171-5180，通过引用全部并入。据认为，在pH为7.4时FcRn的Fc的增加的亲和力阻止将Fc释放回到血液中。因此，会增加Fc的体内半衰期的Fc突变将理想地增加较低pH时的FcRn结合，同时仍允许在较高pH时释放Fc。氨基酸组氨酸改变了其在6.0到7.4的pH范围下的电荷状态。因此，在FcFcRn复合物中的重要位置处发现His残基不足为奇。最近，已经提出，带具有较低等电点的可变区的抗体也可以具有较长的血清半衰期Igawa等人，2010《PEDS.》235：385-392，通过引用全部并入。然而，对其机制仍知之甚少。而且，可变区因抗体而有所不同。具有降低的pI和延长的半衰期的恒定区将会提供更具模块化的方法来提高抗体的药代动力学性质，如本文所描述的。F.用于额外功能的额外Fc变体除了pI氨基酸变体之外，存在出于各种原因可以作出的许多有用的Fc氨基酸修饰，包含但不限于更改与一个或多个FcγR受体的结合、与FcRn受体的更改结合等。因此，本发明的蛋白质可以包含氨基酸修饰，包含本文所概述的异二聚体化变体，所述异二聚体化变体包含pI变体和空间变体。每组变体可以独立且任选地包含在内或不包含在任何特定异源二聚体蛋白中。G.FcγR变体因此，存在可以作出以更改与FcγR受体中的一个或多个的结合的多个有用Fc取代。导致增加的结合以及减少的结合的取代可以是有用的。例如，已知与FcγRIIIa增加的结合导致了增加的ADCC抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；其中表达FcγR的非特异性毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞溶解的细胞介导的反应。类似地，与FcγRIIb抑制性受体的减少结合在一些情形下也可以是有益的。用于本发明的氨基酸取代包含USSN11124,620尤其是图41、11174,287、11396,495、11538,406所列出的那些，其均通过引用以其全文明确地合并在本文中并且特别用于本文所公开的变体。所使用的特定变体包含但不限于236A、239D、239E、332E、332D、239D332E、267D、267E、328F、267E328F、236A332E、239D332E330Y、239D、332E330L、243A、243L、264A、264V和299T。另外，如通过引用以其全文合并在此的USSN12341,769所具体公开的，存在用于与FcRn增加的结合以及增加的血清半衰期的额外Fc取代，包含但不限于434S、434A、428L、308F、2591、428L434S、259I308F、436I428L、4361或V434S、436V428L和259I308F428L。H.消融变体类似地，另一类别的功能变体是“FcγR消融变体”或“Fc敲除FcKO或KO变体”。在这些实施例中，对于一些治疗性应用，期望减少或去除Fc结构域与Fcγ受体例如，FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等中的一个或多个或所有的正常结合以避免额外的动作机制。即，例如，在许多实施例中，尤其是在使用双特异性检查点抗体时，期望消融FcγRIIIa结合以消除或显著降低ADCC活性使得Fc结构域中的一个包括一个或多个Fcγ受体消融变体。图5中描绘了这些消融变体，并且各自可以独立且任选地包含在内或不包含在内，优选方面利用了选自由以下组成的群组的消融变体：G236RL328R、E233PL234VL235AG236delS239K、E233PL234VL235AG236delS267K、E233PL234VL235AG236delS239KA327G、E233PL234VL235AG236delS267KA327G和E233PL234VL235AG236del。应注意，本文所引用的消融变体消融FcγR结合但通常不消融FcRn结合。如本领域所已知的，人IgG1的Fc结构域具有与Fcγ受体的最高结合，并且因此，在异源二聚体抗体的主链中的恒定结构域或Fc结构域为IgG1时，可以使用消融变体。例如，可替代地或除了IgG1背景下的消融变体之外，糖基化位置297处的突变通常突变成A或S可以显著消融与FcγRIIIa的结合。人IgG2和IgG4具有与Fcγ受体天然减少的结合，并且因此那些主链可以在有或无消融变体的情况下使用。I.异源二聚体变体和Fc变体的组合如本领域技术人员将了解的，所有所列异源二聚体化变体包含倾斜变体和或pI变体可以任何方式任选且独立地组合，只要其保持器“链型”或“单体分隔”即可。另外，所有这些变体可以组合成任何异源二聚体化格式。在pI变体的情况下，虽然附图中示出了特别有用的实施例，但是可以遵循改变两个单体之间的pI差异以促进纯化的基本规则，生成其它组合。另外，如本文中总体上概述的，异源二聚体化变体倾斜变体和pI变体中的任何也与Fc消融变体、Fc变体、FcRn变体独立且任选地组合。V.本发明的有用格式如本领域技术人员将了解的并且如下文更充分地讨论的，本发明的双特异性异源二聚体抗体可以采取各种配置，如图1中总体上描绘的。一些附图描绘了“单端”配置，其中分子的一个“臂”上有一种类型的特异性并且另一个“臂”上有不同的特异性。其它附图描绘了“双端”配置，其中分子的“顶部”有至少一种类型的特异性并且分子的“底部”有一种或多种不同的特异性。因此，本发明涉及共同接合不同的第一抗原和第二抗原的新型免疫球蛋白组成物。如本领域技术人员将了解的，本发明的异源二聚体格式可以具有不同的化合价并且可以是双特异性的。即，本发明的异源二聚体抗体可以是二价的且双特异性的，其中一个检查点靶标由一个ABD结合并且另一个检查点靶标由第二ABD结合。异源二聚体抗体还可以是三价的且双特异性的，其中第一抗体由两个ABD结合并且第二抗体由第二ABD结合。A.开瓶器格式特别用于本发明的一种异源二聚体支架是如图1A所示的“三重F”或“开瓶器”支架格式。在这个实施例中，抗体的一个重链含有单链Fv“scFv”，如下文所定义的并且另一个重链是包括可变重链和轻链的“常规”Fab格式。此结构在本文中有时被称为“三重F”格式scFv-Fab-Fc或“开瓶器”格式，这是由于与开瓶器具有大致视觉相似性参见图1A。通过使用恒定区例如，Fc结构域、CH1结构域和或铰链区中的如下文更加充分地描述的促进异源二聚体抗体形成的氨基酸变体，这两个链被放在一起。本发明的“三重F”格式存在几个明显优势。如本领域所已知的，依赖于两个scFv构建体的抗体类似物常常具有稳定性和聚合问题，在本发明中可以通过添加“常规”的重链和轻链配对来缓解所述稳定性和聚合问题。另外，如与依赖于两个重链和两个轻链的格式相反，不存在重链和轻链错误配对例如，重链1与轻链2配对等的问题。本文所概述的许多实施例通常依赖于包括第一单体的开瓶器格式，所述第一单体包括scFv，所述scFv包括使用scFv连接子在许多但并非所有情况下，带电荷进行共价连接的可变重结构域和可变轻结构域，其中scFv常通过结构域连接子如本文所概述的，所述结构域连接子可以是不带电荷的或带电荷的并且可以是外源的或内源的例如，天然铰链结构域的全部或一部分与第一Fc结构域的N-末端共价连接。开瓶器格式的第二单体是重链，并且组成物进一步包括轻链。另外，开瓶器格式的Fc结构域通常包括倾斜变体例如，如图3和图8中所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的倾斜变体选自由以下组成的群组：S364KE357Q：L368DK370S；L368DK370S：S364K；L368EK370S：S364K；T411TE360EQ362E：D401K；L368DK370S：S364KE357L、K370S：S364KE357Q、T366SL368AY407V：T366W和T366SL368AY407VY349C：T366WS354C、任选地消融变体包含图5所示的那些、任选地带电荷scFv连接子包含图7所示的那些，并且重链包括pI变体包含图4所示的那些。在一些实施例中，开瓶器格式包含倾斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体“scFv单体”，其包括带电荷scFv连接子图7的+H序列在一些实施例中是优选的、倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K和与如本文所概述的检查点受体结合的Fv；b第二单体“Fab单体”，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K和可变重结构域，所述可变重结构域与可变轻结构域构成与如本文所概述的第二检查点受体结合的Fv；以及c轻链。在这个特定实施例中，适合的单体Fv对包含Fab首先被列出，scFv第二个被列出PD-1和CTLA-4、CTLA-4和PD-1、PD-1和TIM-3、TIM-3和PD-1、PD-1和LAG-3、LAG-3XPD1、PD-1和TIGIT、TIGIT和PD-1、PD-1和BTLA、BTLA和PD-1、CTLA-4和TIM-3、TIM-3和CTLA-4、CTLA-4和LAG-3、LAG-3和CTLA-4、CTLA-4和TIGIT、TIGIT和CTLA-4、CTLA-4和BTLA、BTLA和CTLA-4、TIM-3和LAG-3、LAG-3和TIM-3、TIM-3和TIGIT、TIGIT和TIM-3、TIM-3和BTLA、BTLA和TIM-3、LAG-3和TIGIT、TIGIT和LAG-3、LAG-3和BTLA、BTLA和LAG-3、BTLA和TIGIT、以及TIGIT和BTLA。在这个特定实施例中，具有这些变体的开瓶器具有包括与具有特别用途的PD-1结合的ABD1G6_L1.194_H1.279的scFv侧。在这个特定实施例中，具有这些变体的开瓶器具有包括与具有特别用途的CTLA-4结合的[CTLA-4]_H3.23_L0.129ABD的scFv侧。尤其是在开瓶器格式下特别用于一些实施例中的是CTLA-4XPD-1、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、TIM-3XPD-1和LAG-3XCTLA-4。这些组合的ABD序列可以如序列表所公开的或如图9到图13所示的，并且处于如图39和图40所示的任何组合。在一些实施例中，开瓶器格式包含倾斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体“scFv单体”，其包括带电荷scFv连接子图7的+H序列在一些实施例中是优选的、倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S和与如本文所概述的检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体“Fab单体”，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S和可变重结构域，所述可变重结构域与可变轻结构域构成与如本文所概述的第二检查点抑制剂结合的Fv；以及c轻链。在这个特定实施例中，适合的Fv对包含Fab首先被列出，scFv第二个被列出PD-1和CTLA-4、CTLA-4和PD-1、PD-1和TIM-3、TIM-3和PD-1、PD-1和LAG-3、LAG-3XPD1、PD-1和TIGIT、TIGIT和PD-1、PD-1和BTLA、BTLA和PD-1、CTLA-4和TIM-3、TIM-3和CTLA-4、CTLA-4和LAG-3、LAG-3和CTLA-4、CTLA-4和TIGIT、TIGIT和CTLA-4、CTLA-4和BTLA、BTLA和CTLA-4、TIM-3和LAG-3、LAG-3和TIM-3、TIM-3和TIGIT、TIGIT和TIM-3、TIM-3和BTLA、BTLA和TIM-3、LAG-3和TIGIT、TIGIT和LAG-3、LAG-3和BTLA、BTLA和LAG-3、BTLA和TIGIT、以及TIGIT和BTLA。在这个特定实施例中，具有这些变体的开瓶器具有包括与具有特别用途的PD-1结合的ABD1G6_L1.194_H1.279的scFv侧。在这个特定实施例中，具有这些变体的开瓶器具有包括与具有特别用途的CTLA-4结合的[CTLA-4]_H3.23_L0.129ABD的scFv侧。尤其是在开瓶器格式下特别用于一些实施例中的是CTLA-4XPD-1、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、TIM-3XPD-1和LAG-3XCTLA-4。具体地说，图37示出了缺少本发明中可以使用的Fv序列的一些开瓶器“主链”序列。即，可以使用来自以下的任何组合的scFv部分和Fab部分的Fv序列：PD-1和CTLA-4、PD-1和TIM-3、PD-1和LAG-3、PD-1和TIGIT、PD-1和BTLA、CTLA-4和TIM-3、CTLA-4和LAG-3、CTLA-4和TIGIT、CTLA-4和BTLA、TIM-3和LAG-3、TIM-3和TIGIT、TIM-3和BTLA、LAG-3和TIGIT、LAG-3和BTLA、以及TIGIT和BTLA。序列可以是序列表和或图9到图13中本文所公开的那些序列中的任何序列。对于图37的开瓶器主链1，用于本发明的特定Fv组合包含PD-1和CTLA-4、PD-1和TIM-3、PD-1和LAG-3、PD-1和TIGIT、PD-1和BTLA、CTLA-4和TIM-3、CTLA-4和LAG-3、CTLA-4和TIGIT、CTLA-4和BTLA、TIM-3和LAG-3、TIM-3和TIGIT、TIM-3和BTLA、LAG-3和TIGIT、LAG-3和BTLA、以及TIGIT和BTLA。序列可以是序列表和或图9到图13中本文所公开的那些序列中的任何序列。对于图37的开瓶器主链1，用于本发明的特定Fv组合包含CTLA-4FabXPD-1scFv、PD-1FabXCTLA-4scFv、LAG-3FabXPD-1scFv、BTLAFabXPD-1scFv和LAG-3FabXCTLA-4scFv。对于图37的开瓶器主链1任选地包含428L434S变体，结合人PD-1的特定ABD包含但不限于1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288和2E9H1L1、以及SEQIDNO：6209到11464、SEQIDNO：11465到17134、SEQIDNO：33003到33072、SEQIDNO：33073到35394和SEQIDNO：36127到36146中列出的那些。对于图37的开瓶器主链1任选地包含428L434S变体，结合人CTLA-4的特定ABD包含但不限于：[CTLA-4]_H0.25_L0；[CTLA-4]_H0.26_L0；[CTLA-4]_H0.27_L0；[CTLA-4]_H0.29_L0；[CTLA-4]_H0.38_L0；[CTLA-4]_H0.39_L0；[CTLA-4]_H0.40_L0；[CTLA-4]_H0.70_L0；[CTLA-4]_H0_L0.22；[CTLA-4]_H2_L0；[CTLA-4]_H3.21_L0.124；[CTLA-4]_H3.21_L0.129；[CTLA-4]_H3.21_L0.132；[CTLA-4]_H3.23_L0.124；[CTLA-4]_H3.23_L0.129；[CTLA-4]_H3.23_L0.132；[CTLA-4]_H3.25_L0.124；[CTLA-4]_H3.25_L0.129；[CTLA-4]_H3.25_L0.132；[CTLA-4]_H3.4_L0.118；[CTLA-4]_H3.4_L0.119；[CTLA-4]_H3.4_L0.12；[CTLA-4]_H3.4__L0.121；[CTLA-4]_H3.4_L0.122；[CTLA-4]_H3.4_L0.123；[CTLA-4]_H3.4_L0.124；[CTLA-4]_H3.4_L0.125；[CTLA-4]_H3.4_L0.126；[CTLA-4]_H3.4_L0.127；[CTLA-4]_H3.4_L0.128；[CTLA-4]_H3.4_L0.129；[CTLA-4]_H3.4_L0.130；[CTLA-4]_H3.4_L0.131；[CTLA-4]_H3.4_L0.132；[CTLA-4]_H3.5_L2.1；[CTLA-4]_H3.5_L2.2；[CTLA-4]_H3.5_L2.3；[CTLA-4]_H3_L0；[CTLA-4]_H3_L0.22；[CTLA-4]_H3_L0.44；[CTLA-4]_H3_L0.67和[CTLA-4]_H3_L0.74；以及SEQIDNO：21到2918、SEQIDNO：2919到6208、SEQIDNO：36739到36818和SEQIDNO：35395到35416中列出的那些。对于图37的开瓶器主链1任选地包含428L434S变体，结合人LAG-3的特定ABD包含但不限于：2A11_H0L0；2A11_H1.125_L2.113；2A11_H1.144_L2.142；2A11_H1_L2.122；2A11_H1_L2.123；2A11_H1_L2.124；2A11_H1_L2.25；2A11_H1_L2.47；2A11_H1_L2.50；2A11_H1_L2.91；2A11_H1_L2.93；2A11_H1_L2.97；2A11_H1L1；2A11_H1L2；2A11_H2L2；2A11_H3L1；2A11_H3L2；2A11_H4L1；2A11_H4L2；7G8_H0L0；7G8_H1L1；7G8_H3.18_L1.11；7G8_H3.23_L1.11；7G8_H3.28_L1；7G8_H3.28_L1.11；7G8_H3.28_L1.13；7G8_H3.30_L1.34；7G8_H3.30_L1.34；和7G8_H3L1；以及SEQIDNO：17135到20764、SEQIDNO：36819到36962、SEQIDNO：35417到35606、SEQIDNO：25194到32793和SEQIDNO：32794到33002中列出的那些。对于图37的开瓶器主链1任选地包含428L434S变体，结合人BTLA的特定ABD包含但不限于：9C6_H0L0；9C6_H1.1_L1；和9C6_H1.11_L1；以及SEQIDNO：20885到21503和SEQIDNO：36707到36738中列出的那些。对于图37的开瓶器主链1任选地包含428L434S变体，结合人TIM-3的特定ABD包含但不限于：1D10_H0L0；1D12_H0L0；3H3_H1_L2.1；6C8_H0L0；6D9_H0_1D12_L0；7A9_H0L0；7B11_H0L0；7B11var_H0L0和7C2_H0L0；以及SEQIDNO：20765到20884、SEQIDNO：37587到37698和SEQIDNO：36347到36706中列出的那些。下文中概述了特定的开瓶器实施例。B.mAb-Fv格式特别用于本发明的一种异源二聚体支架是如图1H所示的mAb-Fv格式。在这个实施例中，格式依赖于使用“额外”可变重结构域的C-末端与一个单体的连接以及“额外”可变轻结构域的C-末端与另一个单体的连接，从而形成第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分结合一个检查点靶标并且“额外”scFv结构域结合不同的检查点靶标。在这个实施例中，第一单体包括第一重链，所述第一重链包括第一可变重结构域和第一恒定重结构域，所述第一恒定重结构域包括第一Fc结构域，第一可变轻结构域使用结构域连接子vh1-CH1-铰链-CH2-CH3-[任选连接子]-vl2来与第一Fc结构域的C-末端共价连接。第二单体包括第二可变重结构域和第三可变重结构域，所述第二可变重结构域属于包括第二Fc结构域的第二恒定重结构域，所述第三可变重结构域使用结构域连接子vh1-CH1-铰链-CH2-CH3-[任选连接子]-vh2来与第二Fc结构域的C-末端共价连接。两个C-末端连接可变结构域构成scFv。这个实施例进一步利用了包括可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链，所述轻链与重链相关联以形成两个相同的Fab。对于本文中的许多实施例，如本文所期望和描述的，这些构建体包含倾斜变体、pI变体、消融变体、额外Fc变体等。在这个实施例中，适合的Fv对包含Fab首先被列出，scFv第二个被列出PD-1和CTLA-4、CTLA-4和PD-1、PD-1和TIM-3、TIM-3和PD-1、PD-1和LAG-3、LAG-3XPD1、PD-1和TIGIT、TIGIT和PD-1、PD-1和BTLA、BTLA和PD-1、CTLA-4和TIM-3、TIM-3和CTLA-4、CTLA-4和LAG-3、LAG-3和CTLA-4、CTLA-4和TIGIT、TIGIT和CTLA-4、CTLA-4和BTLA、BTLA和CTLA-4、TIM-3和LAG-3、LAG-3和TIM-3、TIM-3和TIGIT、TIGIT和TIM-3、TIM-3和BTLA、BTLA和TIM-3、LAG-3和TIGIT、TIGIT和LAG-3、LAG-3和BTLA、BTLA和LAG-3、BTLA和TIGIT、以及TIGIT和BTLA。这些组合的ABD序列可以如序列表所公开的或如图9到图13所示的，并且处于如图39和图40所示的任何组合。另外，mAb-Fv格式的Fc结构域包括倾斜变体例如，如图3和图8中所示出的一组氨基酸取代，其中特别有用的倾斜变体选自由以下组成的群组：S364KE357Q：L368DK370S；L368DK370S：S364K；L368EK370S：S364K；T411TE360EQ362E：D401K；L368DK370S：S364KE357L、K370S：S364KE357Q、T366SL368AY407V：T366W、以及T366SL368AY407VY349C：T366WS354C、任选地消融变体包含图5所示的那些、任选地带电荷scFv连接子包含图7所示的那些，并且重链包括pI变体包含图4所示的那些。在一些实施例中，mAb-Fv格式包含倾斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体，其包括倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及第一可变重结构域和第二可变重结构域，所述第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域构成与第一检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及第一可变重结构域和第二可变轻链，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与如本文所概述的第一检查点抑制剂结合的Fv，所述第二可变轻链与第二可变重链一起形成结合第二检查点抑制剂的FvABD；以及c轻链，其包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域。在这个格式下尤其用于一些实施例中的是Fab-scFv顺序CTLA-4XPD-1、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1和LAG-3XCTLA-4。在一些实施例中，mAb-Fv格式包含倾斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体，其包括倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S、以及第一可变重结构域和第二可变重结构域，所述第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域构成与第一检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S、以及第一可变重结构域和第二可变轻链，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与如本文所概述的第一检查点抑制剂结合的Fv，所述第二可变轻链与第二可变重链一起形成结合第二检查点抑制剂的FvABD；以及c轻链，其包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域。在这个格式下尤其用于一些实施例中的是Fab-scFv顺序CTLA-4XPD-1、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1和LAG-3XCTLA-4。对于类似于图38的mAb-scFv主链1的mAb-Fv序列任选地包含M428LN434S，结合人PD-1的特定ABD包含但不限于：1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288和2E9_H1L1、以及SEQIDNO：6209到11464、SEQIDNO：11465到17134、SEQIDNO：33003到33072、SEQIDNO：33073到35394和SEQIDNO：36127到36146中列出的那些。对于类似于图38的mAb-scFv主链1的mAb-Fv序列任选地包含M428LN434S，结合人CTLA-4的特定ABD包含但不限于：[CTLA-4]_H0.25_L0；[CTLA-4]_H0.26_L0；[CTLA-4]_H0.27_L0；[CTLA-4]_H0.29_L0；[CTLA-4]_H0.38_L0；[CTLA-4]_H0.39_L0；[CTLA-4]_H0.40_L0；[CTLA-4]_H0.70_L0；[CTLA-4]_H0_L0.22；[CTLA-4]_H2_L0；[CTLA-4]_H3.21_L0.124；[CTLA-4]_H3.21_L0.129；[CTLA-4]_H3.21_L0.132；[CTLA-4]_H3.23_L0.124；[CTLA-4]__H3.23_L0.129；[CTLA-4]_H3.23_L0.132；[CTLA-4]_H3.25_L0.124；[CTLA-4]_H3.25_L0.129；[CTLA-4]_H3.25_L0.132；[CTLA-4]_H3.4_L0.118；[CTLA-4]_H3.4_L0.119；[CTLA-4]_H3.4_L0.12；[CTLA-4]_H3.4_L0.121；[CTLA-4]_H3.4_L0.122；[CTLA-4]_H3.4_L0.123；[CTLA-4]_H3.4_L0.124；[CTLA-4]_H3.4_L0.125；[CTLA-4]_H3.4_L0.126；[CTLA-4]_H3.4_L0.127；[CTLA-4]_H3.4_L0.128；[CTLA-4]_H3.4_L0.129；[CTLA-4]_H3.4_L0.130；[CTLA-4]_H3.4_L0.131；[CTLA-4]_H3.4_L0.132；[CTLA-4]_H3.5_L2.1；[CTLA-4]_H3.5_L2.2；[CTLA-4]_H3.5_L2.3；[CTLA-4]_H3_L0；[CTLA-4]_H3_L0.22；[CTLA-4]_H3_L0.44；[CTLA-4]_H3_L0.67和[CTLA-4]_H3_L0.74；以及SEQIDNO：21到2918、SEQIDNO：2919到6208、SEQIDNO：36739到36818和SEQIDNO：35395到35416中列出的那些。对于类似于图38的mAb-scFv主链1的mAb-Fv序列任选地包含M428LN434S，结合人LAG-3的特定ABD包含但不限于：2A11_H0L0；2A11_H1.125_L2.113；2A11_H1.144_L2.142；2A11_H1_L2.122；2A11_H1_L2.123；2A11_H1_L2.124；2A11_H1_L2.25；2A11_H1_L2.47；2A11_H1_L2.50；2A11_H1_L2.91；2A11_H1_L2.93；2A11_H1_L2.97；2A11_H1L1；2A11_H1L2；2A11_H2L2；2A11_H3L1；2A11_H3L2；2A11_H4L1；2A11_H4L2；7G8_H0L0；7G8_H1L1；7G8_H3.18_L1.11；7G8_H3.23_L1.11；7G8_H3.28_L1；7G8_H3.28_L1.11；7G8_H3.28_L1.13；7G8_H3.30_L1.34；7G8_H3.30_L1.34；和7G8_H3L1；以及SEQIDNO：17135到20764、SEQIDNO：36819到36962、SEQIDNO：35417到35606、SEQIDNO：25194到32793和SEQIDNO：32794到33002中列出的那些。对于类似于图38的mAb-scFv主链1的mAb-Fv序列任选地包含M428LN434S，结合人BTLA的特定ABD包含但不限于：9C6_H0L0；9C6_H1.1_L1；和9C6_H1.11_L1；以及SEQIDNO：20885到21503和SEQIDNO：36707到36738中列出的那些。对于类似于图38的mAb-scFv主链1的mAb-Fv序列任选地包含M428LN434S，结合人TIM-3的特定ABD包含但不限于：1D10_H0L0；1D12_H0L0；3H3_H1_L2.1；6C8_H0L0；6D9_H0_1D12_L0；7A9_H0L0；7B11_H0L0；7B11var_H0L0和7C2_H0L0；以及SEQIDNO：20765到20884、SEQIDNO：37587到37698和SEQIDNO：36347到36706中列出的那些。C.mAb-scFv特别用于本发明的一种异源二聚体支架是如图1I所示的mAb-scFv格式。在这个实施例中，格式依赖于使用scFv的C-末端与单体中的一个的连接，从而形成第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分结合一个检查点靶标并且“额外”scFv结构域结合不同的检查点靶标。在这个实施例中，第一单体包括第一重链包括可变重结构域和恒定结构域，其中C-末端共价连接的scFv包括在任一朝向上vh1-CH1-铰链-CH2-CH3-[任选连接子]-vh2-scFv连接子-vl2或vh1-CH1-铰链-CH2-CH3-[任选连接子]-vl2-scFv连接子-vh2的scFv可变轻结构域、scFv连接子和scFv可变重结构域。这个实施例进一步利用了包括可变轻结构域和恒定轻结构域的共有轻链，所述共有轻链与重链相关联以形成与靶抗原中的一个结合的两个相同的Fab。对于本文中的许多实施例，如本文所期望和描述的，这些构建体包含倾斜变体、pI变体、消融变体、额外Fc变体等。在这个实施例中，适合的Fv对包含Fab首先被列出，scFv第二个被列出PD-1和CTLA-4、CTLA-4和PD-1、PD-1和TIM-3、TIM-3和PD-1、PD-1和LAG-3、LAG-3XPD1、PD-1和TIGIT、TIGIT和PD-1、PD-1和BTLA、BTLA和PD-1、CTLA-4和TIM-3、TIM-3和CTLA-4、CTLA-4和LAG-3、LAG-3和CTLA-4、CTLA-4和TIGIT、TIGIT和CTLA-4、CTLA-4和BTLA、BTLA和CTLA-4、TIM-3和LAG-3、LAG-3和TIM-3、TIM-3和TIGIT、TIGIT和TIM-3、TIM-3和BTLA、BTLA和TIM-3、LAG-3和TIGIT、TIGIT和LAG-3、LAG-3和BTLA、BTLA和LAG-3、BTLA和TIGIT、以及TIGIT和BTLA。这些组合的ABD序列可以如序列表所公开的或如图9到图13所示的，并且处于如图39和图40所示的任何组合。另外，mAb-scFv格式的Fc结构域通常包括倾斜变体例如，如图3和图8所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的倾斜变体选自由以下组成的群组：S364KE357Q：L368DK370S；L368DK370S：S364K；L368EK370S：S364K；T411TE360EQ362E：D401K；L368DK370S：S364KE357L、K370S：S364KE357Q、T366SL368AY407V：T366W、以及T366SL368AY407VY349C：T366WS354C、任选地消融变体包含图5所示的那些、任选地带电荷scFv连接子包含图7所示的那些，并且重链包括pI变体包含图4所示的那些。在一些实施例中，mAb-scFv格式包含倾斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体，其包括倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及第一可变重结构域和第二可变重结构域，所述第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域构成与第一检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及第一可变重结构域和第二可变轻链，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与如本文所概述的第一检查点抑制剂结合的Fv，所述第二可变轻链与第二可变重链一起形成结合第二检查点抑制剂的FvABD；以及c轻链，其包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域。在这个格式下尤其用于一些实施例中的是Fab-scFv顺序CTLA-4XPD-1、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1和LAG-3XCTLA-4。在一些实施例中，mAb-scFv格式包含倾斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体，其包括倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S、以及第一可变重结构域和第二可变重结构域，所述第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域构成与第一检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S、以及第一可变重结构域和第二可变轻链，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与如本文所概述的第一检查点抑制剂结合的Fv，所述第二可变轻链与第二可变重链一起形成结合第二检查点抑制剂的FvABD；以及c轻链，其包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域。在mAb-scFv格式中，用于本发明的特定Fv组合包含CTLA-4FabXPD-1scFv、PD-1FabXCTLA-4scFv、LAG-3FabXPD-1scFv、BTLAFabXPD-1scFv和LAG-3FabXCTLA-4scFv。在图38的mAb-scFv主链1任选地包含M428LN434S中，结合人PD-1的特定ABD包含但不限于：1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288和2E9_H1L1、以及SEQIDNO：6209到11464、SEQIDNO：11465到17134、SEQIDNO：33003到33072、SEQIDNO：33073到35394和SEQIDNO：36127到36146中列出的那些。在图38的mAb-scFv主链1任选地包含M428LN434S中，结合人CTLA-4的特定ABD包含但不限于：[CTLA-4]_H0.25_L0；[CTLA-4]_H0.26_L0；[CTLA-4]_H0.27_L0；[CTLA-4]_H0.29_L0；[CTLA-4]_H0.38_L0；[CTLA-4]_H0.39_L0；[CTLA-4]_H0.40_L0；[CTLA-4]_H0.70_L0；[CTLA-4]_H0_L0.22；[CTLA-4]_H2_L0；[CTLA-4]_H3.21_L0.124；[CTLA-4]_H3.21_L0.129；[CTLA-4]_H3.21_L0.132；[CTLA-4]_H3.23_L0.124；[CTLA-4]__H3.23_L0.129；[CTLA-4]_H3.23_L0.132；[CTLA-4]_H3.25_L0.124；[CTLA-4]_H3.25_L0.129；[CTLA-4]_H3.25_L0.132；[CTLA-4]_H3.4_L0.118；[CTLA-4]_H3.4_L0.119；[CTLA-4]_H3.4_L0.12；[CTLA-4]_H3.4_L0.121；[CTLA-4]_H3.4_L0.122；[CTLA-4]_H3.4_L0.123；[CTLA-4]_H3.4_L0.124；[CTLA-4]_H3.4_L0.125；[CTLA-4]_H3.4_L0.126；[CTLA-4]_H3.4_L0.127；[CTLA-4]_H3.4_L0.128；[CTLA-4]_H3.4_L0.129；[CTLA-4]_H3.4_L0.130；[CTLA-4]_H3.4_L0.131；[CTLA-4]_H3.4_L0.132；[CTLA-4]_H3.5_L2.1；[CTLA-4]_H3.5_L2.2；[CTLA-4]_H3.5_L2.3；[CTLA-4]_H3_L0；[CTLA-4]_H3_L0.22；[CTLA-4]_H3_L0.44；[CTLA-4]_H3_L0.67和[CTLA-4]_H3_L0.74；以及SEQIDNO：21到2918、SEQIDNO：2919到6208、SEQIDNO：36739到36818和SEQIDNO：35395到35416中列出的那些。在图38的mAb-scFv主链1任选地包含M428LN434S中，结合人LAG-3的特定ABD包含但不限于：2A11_H0L0；2A11_H1.125_L2.113；2A11_H1.144_L2.142；2A11_H1_L2.122；2A11_H1_L2.123；2A11_H1_L2.124；2A11_H1_L2.25；2A11_H1_L2.47；2A11_H1_L2.50；2A11_H1_L2.91；2A11_H1_L2.93；2A11_H1_L2.97；2A11_H1L1；2A11_H1L2；2A11_H2L2；2A11_H3L1；2A11_H3L2；2A11_H4L1；2A11_H4L2；7G8_H0L0；7G8_H1L1；7G8_H3.18_L1.11；7G8_H3.23_L1.11；7G8_H3.28_L1；7G8_H3.28_L1.11；7G8_H3.28_L1.13；7G8_H3.30_L1.34；7G8_H3.30_L1.34；和7G8_H3L1；以及SEQIDNO：17135到20764、SEQIDNO：36819到36962、SEQIDNO：35417到35606、SEQIDNO：25194到32793和SEQIDNO：32794到33002中列出的那些。在图38的mAb-scFv主链1任选地包含M428LN434S中，结合人BTLA的特定ABD包含但不限于：9C6_H0L0；9C6_H1.1_L1；和9C6_H1.11_L1；以及SEQIDNO：20885到21503和SEQIDNO：36707到36738中列出的那些。在图38的mAb-scFv主链1任选地包含M428LN434S中，结合人TIM-3的特定ABD包含但不限于：1D10_H0L0；1D12_H0L0；3H3_H1_L2.1；6C8_H0L0；6D9_H0_1D12_L0；7A9_H0L0；7B11_H0L0；7B11var_H0L0和7C2_H0L0；以及SEQIDNO：20765到20884、SEQIDNO：37587到37698和SEQIDNO：36347到36706中列出的那些。D.中央scFv特别用于本发明的一种异源二聚体支架是如图1F所示出的中央-scFv格式。在这个实施例中，格式依赖于插入的scFv结构域的使用，从而形成第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分与一个检查点靶标结合，并且“额外”scFv结构域与另一个检查点靶标结合。scFv结构域被插入Fc结构域与单体之一的CH1-Fv区之间，从而提供第三抗原结合结构域。在这个实施例中，一个单体包括第一重链，所述第一重链包括第一可变重结构域、CH1结构域以及任选的绞链和Fc结构域，其中scFv包括scFv可变轻结构域、scFv连接子和scFv可变重结构域。使用任选结构域连接子vh1-CH1-[任选连接子]-vh2-scFv连接子-vl2-[包含铰链的任选连接子]-CH2-CH3或scFv的相反朝向、vh1-CH1-[任选连接子]-vl2-scFv连接子-vh2-[包含铰链的任选连接子]-CH2-CH3来将scFv共价连接在重恒定结构域的CH1结构域的C-末端与第一Fc结构域的N-末端之间。其它单体是标准Fab侧。这个实施例进一步利用了包括可变轻结构域和恒定轻结构域的共有轻链，所述共有轻链与重链相关联以形成结合检查点抑制剂的两个相同的Fab。对于本文中的许多实施例，如本文所期望和描述的，这些构建体包含倾斜变体、pI变体、消融变体、额外Fc变体等。在这个实施例中，适合的Fv对包含Fab首先被列出，scFv第二个被列出PD-1和CTLA-4、CTLA-4和PD-1、PD-1和TIM-3、TIM-3和PD-1、PD-1和LAG-3、LAG-3XPD1、PD-1和TIGIT、TIGIT和PD-1、PD-1和BTLA、BTLA和PD-1、CTLA-4和TIM-3、TIM-3和CTLA-4、CTLA-4和LAG-3、LAG-3和CTLA-4、CTLA-4和TIGIT、TIGIT和CTLA-4、CTLA-4和BTLA、BTLA和CTLA-4、TIM-3和LAG-3、LAG-3和TIM-3、TIM-3和TIGIT、TIGIT和TIM-3、TIM-3和BTLA、BTLA和TIM-3、LAG-3和TIGIT、TIGIT和LAG-3、LAG-3和BTLA、BTLA和LAG-3、BTLA和TIGIT、以及TIGIT和BTLA。这些组合的ABD序列可以如序列表所公开的或如图9到图13所示的，并且处于如图39和图40所示的任何组合。此外，中央scFv格式的Fc结构域通常包括倾斜变体例如，如图3和图8中所示出的一组氨基酸取代，其中特别有用的倾斜变体选自由以下组成的群组：S364KE357Q：L368DK370S；L368DK370S：S364K；L368EK370S：S364K；T411TE360EQ362E：D401K；L368DK370S：S364KE357L、K370S：S364KE357Q、T366SL368AY407V：T366W、以及T366SL368AY407VY349C：T366WS354C、任选地消融变体包含如图5中所示出的那些变体、任选地带电荷scFv连接子包含如图7中所示出的那些连接子，并且重链包括pI变体包含如图4中所示出的那些变体。在一些实施例中，中央scFv格式包含倾斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体，其包括倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及第一可变重结构域和第二可变重结构域，所述第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域构成与第一检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及第一可变重结构域和第二可变轻链，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与如本文所概述的第一检查点抑制剂结合的Fv，所述第二可变轻链与第二可变重链一起形成结合第二检查点抑制剂的FvABD；以及c轻链，其包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域。在这个实施例中，适合的Fv对包含Fab首先被列出，scFv第二个被列出CTLA-4XPD-1、PD-1XCTLA-4、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、以及LAG-3XCTLA-4。在一些实施例中，中央scFv格式包含倾斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体，其包括倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S、以及第一可变重结构域和第二可变重结构域，所述第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域构成与第一检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S、以及第一可变重结构域和第二可变轻链，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与如本文所概述的第一检查点抑制剂结合的Fv，所述第二可变轻链与第二可变重链一起形成结合第二检查点抑制剂的FvABD；以及c轻链，其包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域。在这个实施例中，适合的Fv对包含Fab首先被列出，scFv第二个被列出CTLA-4XPD-1、PD-1XCTLA-4、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、以及LAG-3XCTLA-4。对于类似于利用图37的开瓶器主链1的中央-scFv序列任选地包含M428LN434S，用于本发明的特定Fv组合包含CTLA-4FabXPD-1scFv、PD-1FabXCTLA-4scFv、LAG-3FabXPD-1scFv、BTLAFabXPD-1scFv和LAG-3FabXCTLA-4scFv。对于类似于利用图37的开瓶器主链1的中央-scFv序列任选地包含M428LN434S，与人PD-1结合的特定ABD包含但不限于：1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224；1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288和2E9_H1L1、以及SEQIDNO：6209到11464、SEQIDNO：11465到17134、SEQIDNO：33003到33072、SEQIDNO：33073到35394和SEQIDNO：36127到36146中列出的那些。对于类似于利用图37的开瓶器主链1的中央-scFv序列任选地包含M428LN434S，与人CTLA-4结合的特定ABD包含但不限于：[CTLA-4]_H0.25_L0；[CTLA-4]_H0.26_L0；[CTLA-4]_H0.27_L0；[CTLA-4]_H0.29_L0；[CTLA-4]_H0.38_L0；[CTLA-4]_H0.39_L0；[CTLA-4]_H0.40_L0；[CTLA-4]_H0.70_L0；[CTLA-4]_H0_L0.22；[CTLA-4]_H2_L0；[CTLA-4]_H3.21_L0.124；[CTLA-4]_H3.21_L0.129；[CTLA-4]_H3.21_L0.132；[CTLA-4]_H3.23_L0.124；[CTLA-4]_H3.23_L0.129；[CTLA-4]_H3.23_L0.132；[CTLA-4]_H3.25_L0.124；[CTLA-4]_H3.25_L0.129；[CTLA-4]_H3.25_L0.132；[CTLA-4]_H3.4_L0.118；[CTLA-4]_H3.4_L0.119；[CTLA-4]_H3.4_L0.12；[CTLA-4]_H3.4_L0.121；[CTLA-4]_H3.4_L0.122；[CTLA-4]_H3.4_L0.123；[CTLA-4]_H3.4_L0.124；[CTLA-4]_H3.4_L0.125；[CTLA-4]_H3.4_L0.126；[CTLA-4]_H3.4_L0.127；[CTLA-4]_H3.4_L0.128；[CTLA-4]_H3.4_L0.129；[CTLA-4]_H3.4_L0.130；[CTLA-4]_H3.4_L0.131；[CTLA-4]_H3.4_L0.132；[CTLA-4]_H3.5_L2.1；[CTLA-4]_H3.5_L2.2；[CTLA-4]_H3.5_L2.3；[CTLA-4]_H3_L0；[CTLA-4]_H3_L0.22；[CTLA-4]_H3_L0.44；[CTLA-4]_H3_L0.67和[CTLA-4]_H3_L0.74；以及SEQIDNO：21到2918、SEQIDNO：2919到6208、SEQIDNO：36739到36818和SEQIDNO：35395到35416中列出的那些。对于类似于利用图37的开瓶器主链1的中央-scFv序列任选地包含M428LN434S，与人LAG-3结合的特定ABD包含但不限于：2A11_H0L0；2A11_H1.125_L2.113；2A11_H1.144_L2.142；2A11_H1_L2.122；2A11_H1_L2.123；2A11_H1_L2.124；2A11_H1_L2.25；2A11_H1_L2.47；2A11_H1_L2.50；2A11_H1_L2.91；2A11_H1_L2.93；2A11_H1_L2.97；2A11_H1L1；2A11_H1L2；2A11_H2L2；2A11_H3L1；2A11_H3L2；2A11_H4L1；2A11_H4L2；7G8_H0L0；7G8_H1L1；7G8_H3.18_L1.11；7G8_H3.23_L1.11；7G8_H3.28_L1；7G8_H3.28_L1.11；7G8_H3.28_L1.13；7G8_H3.30_L1.34；7G8_H3.30_L1.34；和7G8_H3L1；以及SEQIDNO：17135到20764、SEQIDNO：36819到36962、SEQIDNO：35417到35606、SEQIDNO：25194到32793和SEQIDNO：32794到33002中列出的那些。对于类似于利用图37的开瓶器主链1的中央-scFv序列任选地包含M428LN434S，与人BTLA结合的特定ABD包含但不限于：9C6_H0L0；9C6_H1.1_L1；和9C6_H1.11_L1；以及SEQIDNO：20885到21503和SEQIDNO：36707到36738中列出的那些。对于类似于利用图37的开瓶器主链1的中央-scFv序列任选地包含M428LN434S，与人TIM-3结合的特定ABD包含但不限于：1D10_H0L0；1D12_H0L0；3H3_H1_L2.1；6C8_H0L0；6D9_H0_1D12_L0；7A9_H0L0；7B11_H0L0；7B11var_H0L0和7C2_H0L0；以及SEQIDNO：20765到20884、SEQIDNO：37587到37698和SEQIDNO：36347到36706中列出的那些。E.中央-Fv格式特别用于本发明的一种异源二聚体支架是如图1G所示出的中央-Fv格式。在这个实施例中，格式依赖于插入的scFv结构域的使用，从而形成第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分与一个检查点靶标结合，并且“额外”scFv结构域与另一个检查点靶标结合。scFv结构域被插入Fc结构域与单体的CH1-Fv区之间，从而提供第三抗原结合结构域，其中每个单体含有scFv的组分例如，一个单体包括可变重结构域，并且另一个单体包括可变轻结构域。在这个实施例中，一个单体包括第一重链，所述第一重链包括第一可变重结构域、CH1结构域、以及Fc结构域和额外可变轻结构域。使用结构域连接子vh1-CH1-[任选连接子]-vl2-铰链-CH2-CH3将轻结构域共价连接在重恒定结构域的CH1结构域的C-末端与第一Fc结构域的N-末端之间。另一个单体包括第一重链，所述第一重链包括第一可变重结构域、CH1结构域、以及Fc结构域和额外可变重结构域vh1-CHI-[任选连接子]-vh2-铰链-CH2-CH3。使用结构域连接子将轻结构域共价连接在重恒定结构域的CH1结构域的C-末端与第一Fc结构域的N-末端之间。这个实施例进一步利用了包括可变轻结构域和恒定轻结构域的共有轻链，所述共有轻链与重链相关联以形成结合TTA的两个相同的Fab。对于本文中的许多实施例，如本文所期望和描述的，这些构建体包含倾斜变体、pI变体、消融变体、额外Fc变体等。在这个实施例中，适合的Fv对包含Fab首先被列出，scFv第二个被列出PD-1和CTLA-4、CTLA-4和PD-1、PD-1和TIM-3、TIM-3和PD-1、PD-1和LAG-3、LAG-3XPD1、PD-1和TIGIT、TIGIT和PD-1、PD-1和BTLA、BTLA和PD-1、CTLA-4和TIM-3、TIM-3和CTLA-4、CTLA-4和LAG-3、LAG-3和CTLA-4、CTLA-4和TIGIT、TIGIT和CTLA-4、CTLA-4和BTLA、BTLA和CTLA-4、TIM-3和LAG-3、LAG-3和TIM-3、TIM-3和TIGIT、TIGIT和TIM-3、TIM-3和BTLA、BTLA和TIM-3、LAG-3和TIGIT、TIGIT和LAG-3、LAG-3和BTLA、BTLA和LAG-3、BTLA和TIGIT、以及TIGIT和BTLA。这些组合的ABD序列可以如序列表所公开的或如图9到图13所示的，并且处于如图39和图40所示的任何组合。在中央-scFv格式下，用于本发明的特定Fv组合包含CTLA-4FabXPD-1scFv、PD-1FabXCTLA-4scFv、LAG-3FabXPD-1scFv、BTLAFabXPD-1scFv和LAG-3FabXCTLA-4scFv。在中央-scFv格式下，与人PD-1结合的特定ABD包含但不限于：1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224；1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288和2E9_H1L1、以及SEQIDNO：6209到11464、SEQIDNO：11465到17134、SEQIDNO：33003到33072、SEQIDNO：33073到35394和SEQIDNO：36127到36146中列出的那些。在中央-scFv格式下，与人CTLA-4结合的特定ABD包含但不限于：[CTLA-4]_H0.25_L0；[CTLA-4]_H0.26_L0；[CTLA-4]_H0.27_L0；[CTLA-4]_H0.29_L0；[CTLA-4]_H0.38_L0；[CTLA-4]_H0.39_L0；[CTLA-4]_H0.40_L0；[CTLA-4]_H0.70_L0；[CTLA-4]_H0_L0.22；[CTLA-4]_H2_L0；[CTLA-4]_H3.21_L0.124；[CTLA-4]_H3.21_L0.129；[CTLA-4]_H3.21_L0.132；[CTLA-4]_H3.23_L0.124；[CTLA-4]_H3.23_L0.129；[CTLA-4]_H3.23_L0.132；[CTLA-4]_H3.25_L0.124；[CTLA-4]_H3.25_L0.129；[CTLA-4]_H3.25_L0.132；[CTLA-4]_H3.4_L0.118；[CTLA-4]_H3.4_L0.119；[CTLA-4]_H3.4_L0.12；[CTLA-4]_H314_L0.121；[CTLA-4]_H3.4_L0.122；[CTLA-4]_H3.4_L0.123；[CTLA-4]_H3.4_L0.124；[CTLA-4]_H3.4_L0.125；[CTLA-4]_H3.4_L0.126；[CTLA-4]_H3.4_L0.127；[CTLA-4]_H3.4_L0.128；[CTLA-4]_H3.4_L0.129；[CTLA-4]_H3.4_L0.130；[CTLA-4]_H3.4_L0.131；[CTLA-4]_H3.4_L0.132；[CTLA-4]_H3.5_L2.1；[CTLA-4]_H3.5_L2.2；[CTLA-4]_H3.5_L2.3；[CTLA-4]_H3_L0；[CTLA-4]_H3_L0.22；[CTLA-4]_H3_L0.44；[CTLA-4]_H3_L0.67和[CTLA-4]_H3_L0.74；以及SEQIDNO：21到2918、SEQIDNO：2919到6208、SEQIDNO：36739到36818和SEQIDNO：35395到35416中列出的那些。在中央-scFv格式下，与人LAG-3结合的特定ABD包含但不限于：2A11_H0L0；2A11_H1.125_L2.113；2A11_H1.144_L2.142；2A11_H1_L2.122；2A11_H1_L2.123；2A11_H1_L2.124；2A11_H1_L2.25；2A11_H1_L2.47；2A11_H1_L2.50；2A11_H1_L2.91；2A11_H1_L2.93；2A11_H1_L2.97；2A11_H1L1；2A11_H1L2；2A11_H2L2；2A11_H3L1；2A11_H3L2；2A11_H4L1；2A11_H4L2；7G8_H0L0；7G8_H1L1；7G8_H3.18_L1.11；7G8_H3.23_L1.11；7G8_H3.28_L1；7G8_H3.28_L1.11；7G8_H3.28_L1.13；7G8_H3.30_L1.34；7G8_H3.30_L1.34；和7G8H3L1、以及SEQIDNO：17135到20764、SEQIDNO：36819到36962、SEQIDNO：35417到35606、SEQIDNO：25194到32793和SEQIDNO：32794到33002中列出的那些。在中央-scFv格式下，与人BTLA结合的特定ABD包含但不限于：9C6_H0L0；9C6_H1.1_L1；和9C6_H1.11_L1；以及SEQIDNO：20885到21503和SEQIDNO：36707到36738中列出的那些。在中央-scFv格式下，与人TIM-3结合的特定ABD包含但不限于：1D10_H0L0；1D12_H0L0；3H3_H1L2.1；6C8_H0L0；6D9_H0_1D12_L0；7A9_H0L0；7B11_H0L0；7B11var_H0L0和7C2_H0L0；以及SEQIDNO：20765到20884、SEQIDNO：37587到37698和SEQIDNO：36347到36706中列出的那些。F.单臂中央-scFv特别用于本发明的一种异源二聚体支架是如图1C所示出的单臂中央-scFv格式。在这个实施例中，一个单体包括仅一个Fc结构域，而另一个单体使用插入的scFv结构域，从而形成第二抗原结合结构域。在此格式下，Fab部分与一个检查点靶标结合，并且scFv与另一个检查点靶标结合。scFv结构域被插入Fc结构域与单体之一的CH1-Fv区之间。在这个实施例中，一个单体包括第一重链，所述第一重链包括第一可变重结构域、CH1结构域和Fc结构域，其中scFv包括scFv可变轻结构域、scFv连接子和scFv可变重结构域。使用结构域连接子将scFv共价连接在重恒定结构域的CH1结构域的C-末端与第一Fc结构域的N-末端之间。第二单体包括Fc结构域。这个实施例进一步利用了包括可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链，所述轻链与重链相关联以形成Fab。对于本文中的许多实施例，如本文所期望和描述的，这些构建体包含倾斜变体、pI变体、消融变体、额外Fc变体等。在这个实施例中，适合的Fv对包含Fab首先被列出，scFv第二个被列出PD-1和CTLA-4、CTLA-4和PD-1、PD-1和TIM-3、TIM-3和PD-1、PD-1和LAG-3、LAG-3XPD1、PD-1和TIGIT、TIGIT和PD-1、PD-1和BTLA、BTLA和PD-1、CTLA-4和TIM-3、TIM-3和CTLA-4、CTLA-4和LAG-3、LAG-3和CTLA-4、CTLA-4和TIGIT、TIGIT和CTLA-4、CTLA-4和BTLA、BTLA和CTLA-4、TIM-3和LAG-3、LAG-3和TIM-3、TIM-3和TIGIT、TIGIT和TIM-3、TIM-3和BTLA、BTLA和TIM-3、LAG-3和TIGIT、TIGIT和LAG-3、LAG-3和BTLA、BTLA和LAG-3、BTLA和TIGIT、以及TIGIT和BTLA。这些组合的ABD序列可以如序列表所公开的或如图9到图13所示的，并且处于如图39和图40所示的任何组合。此外，单臂中央-scFv格式的Fc结构域通常包括倾斜变体例如，如图3和图8中所示出的一组氨基酸取代，其中特别有用的倾斜变体选自由以下组成的群组：S364KE357Q：L368DK370S；L368DK370S：S364K；L368EK370S：S364K；T411TE360EQ362E：D401K；L368DK370S：S364KE357L、K370S：S364KE357Q、T366SL368AY407V：T366W、以及T366SL368AY407VY349C：T366WS354C、任选地消融变体包含如图5中所示出的那些变体、任选地带电荷scFv连接子包含如图7中所示出的那些连接子，并且重链包括pI变体包含如图4中所示出的那些变体。在一些实施例中，单臂中央-scFv格式包含倾斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体，其包括倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及第一可变重结构域和第二可变重结构域，所述第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域构成与第一检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及第一可变重结构域和第二可变轻链，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与如本文所概述的第一检查点抑制剂结合的Fv，所述第二可变轻链与第二可变重链一起形成与第二检查点抑制剂结合的FvABD；以及c轻链，其包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域。在这个实施例中，适合的Fv对包含Fab首先被列出，scFv第二个被列出CTLA-4XPD-1、PD-1XCTLA-4、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、以及LAG-3XCTLA-4。在一些实施例中，单臂中央-scFv格式包含倾斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体，其包括倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S、以及第一可变重结构域和第二可变重结构域，所述第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域构成与第一检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S、以及第一可变重结构域和第二可变轻链，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与如本文所概述的第一检查点抑制剂结合的Fv，所述第二可变轻链与第二可变重链一起形成结合第二检查点抑制剂的FvABD；以及c轻链，其包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域。在这个实施例中，适合的Fv对包含Fab首先被列出，scFv第二个被列出CTLA-4XPD-1、PD-1XCTLA-4、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、以及LAG-3XCTLA-4。在单臂中央-scFv格式下，与人PD-1结合的特定ABD包含但不限于：1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224；1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288和2E9H1L1、以及SEQIDNO：6209到11464、SEQIDNO：11465到17134、SEQIDNO：33003到33072、SEQIDNO：33073到35394和SEQIDNO：36127到36146中列出的那些。在单臂中央-scFv格式下，与人CTLA-4结合的特定ABD包含但不限于：[CTLA-4]_H0.25_L0；[CTLA-4]_H0.26_L0；[CTLA-4]_H0.27_L0；[CTLA-4]_H0.29_L0；[CTLA-4]_H0.38_L0；[CTLA-4]_H0.39_L0；[CTLA-4]_H0.40_L0；[CTLA-4]_H0.70_L0；[CTLA-4]_H0_L0.22；[CTLA-4]_H2_L0；[CTLA-4]_H3.21_L0.124；[CTLA-4]_H3.21_L0.129；[CTLA-4]_H3.21_L0.132；[CTLA-4]_H3.23_L0.124；[CTLA-4]_H3.23_L0.129；[CTLA-4]_H3.23_L0.132；[CTLA-4]_H3.25_L0.124；[CTLA-4]_H3.25_L0.129；[CTLA-4]_H3.25_L0.132；[CTLA-4]_H3.4_L0.118；[CTLA-4]_H3.4_L0.119；[CTLA-4]_H3.4_L0.12；[CTLA-4]_H3.4_L0.121；[CTLA-4]_H3.4_L0.122；[CTLA-4]_H3.4_L0.123；[CTLA-4]_H3.4_L0.124；[CTLA-4]_H3.4_L0.125；[CTLA-4]_H3.4_L0.126；[CTLA-4]_H3.4_L0.127；[CTLA-4]_H3.4_L0.128；[CTLA-4]_H3.4_L0.129；[CTLA-4]_H3.4_L0.130；[CTLA-4]_H3.4_L0.131；[CTLA-4]_H3.4_L0.132；[CTLA-4]_H3.5_L2.1；[CTLA-4]_H3.5_L2.2；[CTLA-4]_H3.5_L2.3；[CTLA-4]_H3_L0；[CTLA-4]_H3_L0.22；[CTLA-4]_H3_L0.44；[CTLA-4]_H3_L0.67和[CTLA-4]_H3_L0.74；以及SEQIDNO：21到2918、SEQIDNO：2919到6208、SEQIDNO：36739到36818和SEQIDNO：35395到35416中列出的那些。在单臂中央-scFv格式下，与人LAG-3结合的特定ABD包含但不限于：2A11_H0L0；2A11_H1.125_L2.113；2A11_H1.144_L2.142；2A11_H1_L2.122；2A11_H1_L2.123；2A11_H1_L2.124；2A11_H1_L2.25；2A11_H1_L2.47；2A11_H1_L2.50；2A11_H1_L2.91；2A11_H1_L2.93；2A11_H1_L2.97；2A11_H1L1；2A11_H1L2；2A11_H2L2；2A11_H3L1；2A11_H3L2；2A11_H4L1；2A11_H4L2；7G8_H0L0；7G8_H1L1；7G8_H3.18_L1.11；7G8_H3.23_L1.11；7G8_H3.28_L1；7G8_H3.28_L1.11；7G8_H3.28_L1.13；7G8_H3.30_L1.34；7G8_H3.30_L1.34；和7G8_H3L1；以及SEQIDNO：17135到20764、SEQIDNO：36819到36962、SEQIDNO：35417到35606、SEQIDNO：25194到32793和SEQIDNO：32794到33002中列出的那些。在单臂中央-scFv格式下，与人BTLA结合的特定ABD包含但不限于：9C6_H0L0；9C6_H1.1_L1；和9C6_H1.11_L1；以及SEQIDNO：20885到21503和SEQIDNO：36707到36738中列出的那些。在单臂中央-scFv格式下，与人TIM-3结合的特定ABD包含但不限于：1D10_H0L0；1D12_H0L0；3H3_H1L2.1；6C8_H0L0；6D9_H0_1D12_L0；7A9_H0L0；7B11_H0L0；7B11var_H0L0和7C2_H0L0；以及SEQIDNO：20765到20884、SEQIDNO：37587到37698和SEQIDNO：36347到36706中列出的那些。G.单臂scFv-mAb特别用于本发明的一种异源二聚体支架是如图1D所示出的单臂scFv-mAb格式。在这个实施例中，一个单体包括仅一个Fc结构域，而另一个单体通常通过使用以下连接子来使用连接在重链的N-末端处的scFv结构域：vh-scFv连接子-vl-[任选结构域连接子]-CH1-铰链-CH2-CH3或在相反朝向vl-scFv连接子-vh-[任选结构域连接子]-CH1-铰链-CH2-CH3。在此格式下，Fab部分与一个检查点靶标结合，并且scFv与另一个检查点靶标结合。这个实施例进一步利用了包括可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链，所述轻链与重链相关联以形成Fab。对于本文中的许多实施例，如本文所期望和描述的，这些构建体包含倾斜变体、pI变体、消融变体、额外Fc变体等。在这个实施例中，适合的Fv对包含Fab首先被列出，scFv第二个被列出PD-1和CTLA-4、CTLA-4和PD-1、PD-1和TIM-3、TIM-3和PD-1、PD-1和LAG-3、LAG-3XPD1、PD-1和TIGIT、TIGIT和PD-1、PD-1和BTLA、BTLA和PD-1、CTLA-4和TIM-3、TIM-3和CTLA-4、CTLA-4和LAG-3、LAG-3和CTLA-4、CTLA-4和TIGIT、TIGIT和CTLA-4、CTLA-4和BTLA、BTLA和CTLA-4、TIM-3和LAG-3、LAG-3和TIM-3、TIM-3和TIGIT、TIGIT和TIM-3、TIM-3和BTLA、BTLA和TIM-3、LAG-3和TIGIT、TIGIT和LAG-3、LAG-3和BTLA、BTLA和LAG-3、BTLA和TIGIT、以及TIGIT和BTLA。这些组合的ABD序列可以如序列表所公开的或如图9到图13所示的，并且处于如图39和图40所示的任何组合。此外，Fc结构域通常包括倾斜变体例如，如图3和图8中所示出的一组氨基酸取代，其中特别有用的倾斜变体选自由以下组成的群组：S364KE357Q：L368DK370S；L368DK370S：S364K；L368EK370S：S364K；T411TE360EQ362E：D401K；L368DK370S：S364KE357L、K370S：S364KE357Q、T366SL368AY407V：T366W、以及T366SL368AY407VY349C：T366WS354C、任选地消融变体包含如图5中所示出的那些变体、任选地带电荷scFv连接子包含如图7中所示出的那些连接子，并且重链包括pI变体包含如图4中所示出的那些变体。在一些实施例中，单臂scFv-mAb格式包含倾斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体，其包括倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及第一可变重结构域和第二可变重结构域，所述第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域构成与第一检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及第一可变重结构域和第二可变轻链，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与如本文所概述的第一检查点抑制剂结合的Fv，所述第二可变轻链与第二可变重链一起形成与第二检查点抑制剂结合的FvABD；以及c轻链，其包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域。在这个实施例中，适合的Fv对包含Fab首先被列出，scFv第二个被列出CTLA-4XPD-1、PD-1XCTLA-4、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、以及LAG-3XCTLA-4。在一些实施例中，单臂scFv-mAb格式包含倾斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体，其包括倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S、以及第一可变重结构域和第二可变重结构域，所述第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域构成与第一检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S、以及第一可变重结构域和第二可变轻链，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与如本文所概述的第一检查点抑制剂结合的Fv，所述第二可变轻链与第二可变重链一起形成结合第二检查点抑制剂的FvABD；以及c轻链，其包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域。在这个实施例中，适合的Fv对包含Fab首先被列出，scFv第二个被列出CTLA-4XPD-1、PD-1XCTLA-4、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1、以及LAG-3XCTLA-4。在单臂scFv-mAb格式下，与人PD-1结合的特定ABD包含但不限于：1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224；1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288和2E9H1L1、以及SEQIDNO：6209到11464、SEQIDNO：11465到17134、SEQIDNO：33003到33072、SEQIDNO：33073到35394和SEQIDNO：36127到36146中列出的那些。在单臂scFv-mAb格式下，与人CTLA-4结合的特定ABD包含但不限于：[CTLA-4]_H0.25_L0；[CTLA-4]_H0.26_L0；[CTLA-4]_H0.27_L0；[CTLA-4]_H0.29_L0；[CTLA-4]_H0.38_L0；[CTLA-4]_H0.39_L0；[CTLA-4]_H0.40_L0；[CTLA-4]_H0.70_L0；[CTLA-4]_H0_L0.22；[CTLA-4]_H2_L0；[CTLA-4]_H3.21_L0.124；[CTLA-4]_H3.21_L0.129；[CTLA-4]_H3.21_L0.132；[CTLA-4]_H3.23_L0.124；[CTLA-4]_H3.23_L0.129；[CTLA-4]_H3.23_L0.132；[CTLA-4]_H3.25_L0.124；[CTLA-4]_H3.25_L0.129；[CTLA-4]_H3.25_L0.132；[CTLA-4]_H3.4_L0.118；[CTLA-4]_H3.4_L0.119；[CTLA-4]_H3.4_L0.12；[CTLA-4]_H3.4_L0.121；[CTLA-4]_H3.4_L0.122；[CTLA-4]_H3.4__L0.123；[CTLA-4]_H3.4_L0.124；[CTLA-4]_H3.4_L0.125；[CTLA-4]_H3.4_L0.126；[CTLA-4]_H3.4_L0.127；[CTLA-4]_H3.4_L0.128；[CTLA-4]_H3.4_L0.129；[CTLA-4]_H3.4_L0.130；[CTLA-4]_H3.4_L0.131；[CTLA-4]_H3.4_L0.132；[CTLA-4]_H3.5_L2.1；[CTLA-4]_H3.5_L2.2；[CTLA-4]_H3.5_L2.3；[CTLA-4]_H3_L0；[CTLA-4]_H3_L0.22；[CTLA-4]_H3_L0.44；[CTLA-4]_H3_L0.67和[CTLA-4]_H3_L0.74；以及SEQIDNO：21到2918、SEQIDNO：2919到6208、SEQIDNO：36739到36818和SEQIDNO：35395到35416中列出的那些。在单臂scFv-mAb格式下，与人LAG-3结合的特定ABD包含但不限于：2A11_H0L0；2A11_H1.125_L2.113；2A11_H1.144_L2.142；2A11_H1_L2.122；2A11_H1_L2.123；2A11_H1_L2.124；2A11_H1_L2.25；2A11_H1_L2.47；2A11_H1_L2.50；2A11_H1_L2.91；2A11_H1_L2.93；2A11_H1_L2.97；2A11_H1L1；2A11_H1L2；2A11_H2L2；2A11_H3L1；2A11_H3L2；2A11_H4L1；2A11_H4L2；7G8_H0L0；7G8_H1L1；7G8_H3.18_L1.11；7G8_H3.23_L1.11；7G8_H3.28_L1；7G8_H3.28_L1.11；7G8_H3.28_L1.13；7G8_H3.30_L1.34；7G8_H3.30_L1.34；和7G8_H3L1；以及SEQIDNO：17135到20764、SEQIDNO：36819到36962、SEQIDNO：35417到35606、SEQIDNO：25194到32793和SEQIDNO：32794到33002中列出的那些。在单臂scFv-mAb格式下，与人BTLA结合的特定ABD包含但不限于：9C6_H0L0；9C6_H1.1_L1；和9C6_H1.11_L1；以及SEQIDNO：20885到21503和SEQIDNO：36707到36738中列出的那些。在单臂scFv-mAb格式下，与人TIM-3结合的特定ABD包含但不限于：1D10_H0L0；1D12_H0L0；3H3_H1_L2.1；6C8_H0L0；6D9_H0_1D12_L0；7A9_H0L0；7B11_H0L0；7B11var_H0L0和7C2_H0L0；以及SEQIDNO：20765到20884、SEQIDNO：37587到37698和SEQIDNO：36347到36706中列出的那些。H.scFv-mAb格式特别用于本发明的一种异源二聚体支架是如图1E所示出的mAb-scFv格式。在这个实施例中，格式依赖于将scFv的N-末端连接用于单体之一，从而形成第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分与一个检查点靶标结合，并且“额外”scFv结构域与不同的检查点靶标结合。在这个实施例中，第一单体包括第一重链包括可变重结构域和恒定结构域，其中N-末端共价连接的scFv包括在任一朝向上的scFv可变轻结构域、scFv连接子和scFv可变重结构域vh1-scFv连接子-vl1-[任选结构域连接子]-vh2-CH1-铰链-CH2-CH3或scFv在相反朝向上vl1-scFv连接子-vh1-[任选结构域连接子]-vh2-CH1-铰链-CH2-CH3。这个实施例进一步利用了包括可变轻结构域和恒定轻结构域的共有轻链，所述共有轻链与重链相关联以形成结合靶抗原中的一个的两个相同的Fab。对于本文中的许多实施例，如本文所期望和描述的，这些构建体包含倾斜变体、pI变体、消融变体、额外Fc变体等。在这个实施例中，适合的Fv对包含Fab首先被列出，scFv第二个被列出PD-1和CTLA-4、CTLA-4和PD-1、PD-1和TIM-3、TIM-3和PD-1、PD-1和LAG-3、LAG-3XPD1、PD-1和TIGIT、TIGIT和PD-1、PD-1和BTLA、BTLA和PD-1、CTLA-4和TIM-3、TIM-3和CTLA-4、CTLA-4和LAG-3、LAG-3和CTLA-4、CTLA-4和TIGIT、TIGIT和CTLA-4、CTLA-4和BTLA、BTLA和CTLA-4、TIM-3和LAG-3、LAG-3和TIM-3、TIM-3和TIGIT、TIGIT和TIM-3、TIM-3和BTLA、BTLA和TIM-3、LAG-3和TIGIT、TIGIT和LAG-3、LAG-3和BTLA、BTLA和LAG-3、BTLA和TIGIT、以及TIGIT和BTLA。这些组合的ABD序列可以如序列表所公开的或如图9到图13所示的，并且处于如图39和图40所示的任何组合。此外，scFv-mAb格式的Fc结构域通常包括倾斜变体例如，如图3和图8中所示出的一组氨基酸取代，其中特别有用的倾斜变体选自由以下组成的群组：S364KE357Q：L368DK370S；L368DK370S：S364K；L368EK370S：S364K；T411TE360EQ362E：D401K；L368DK370S：S364KE357L、K370S：S364KE357Q、T366SL368AY407V：T366W、以及T366SL368AY407VY349C：T366WS354C、任选地消融变体包含如图5中所示出的那些变体、任选地带电荷scFv连接子包含如图7中所示出的那些连接子，并且重链包括pI变体包含如图4中所示出的那些变体。在一些实施例中，mAb-scFv格式包含倾斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体，其包括倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及第一可变重结构域和第二可变重结构域，所述第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域构成与第一检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及第一可变重结构域和第二可变轻链，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与如本文所概述的第一检查点抑制剂结合的Fv，所述第二可变轻链与第二可变重链一起形成结合第二检查点抑制剂的FvABD；以及c轻链，其包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域。在这个格式下尤其用于一些实施例中的是Fab-scFv顺序CTLA-4XPD-1、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1和LAG-3XCTLA-4。在一些实施例中，mAb-scFv格式包含倾斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体，其包括倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S、以及第一可变重结构域和第二可变重结构域，所述第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域构成与第一检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S、以及第一可变重结构域和第二可变轻链，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与如本文所概述的第一检查点抑制剂结合的Fv，所述第二可变轻链与第二可变重链一起形成结合第二检查点抑制剂的FvABD；以及c轻链，其包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域。在这个格式下尤其用于一些实施例中的是Fab-scFv顺序CTLA-4XPD-1、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1和LAG-3XCTLA-4。对于来自图38的mAb-scFv格式主链1任选地包含M428LN434S，与人PD-1结合的特定ABD包含但不限于：1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224；1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288和2E9_H1L1、以及SEQIDNO：6209到11464、SEQIDNO：11465到17134、SEQIDNO：33003到33072、SEQIDNO：33073到35394和SEQIDNO：36127到36146中列出的那些。对于来自图38的mAb-scFv格式主链1任选地包含M428LN434S，与人CTLA-4结合的特定ABD包含但不限于：[CTLA-4]_H0.25_L0；[CTLA-4]_H0.26_L0；[CTLA-4]_H0.27_L0；[CTLA-4]_H0.29_L0；[CTLA-4]_H0.38_L0；[CTLA-4]_H0.39_L0；[CTLA-4]_H0.40_L0；[CTLA-4]_H0.70_L0；[CTLA-4]_H0_L0.22；[CTLA-4]_H2L0；[CTLA-4]_H3.21_L0.124；[CTLA-4]_H3.21_L0.129；[CTLA-4]_H3.21_L0.132；[CTLA-4]_H3.23_L0.124；[CTLA-4]_H3.23_L0.129；[CTLA-4]_H3.23_L0.132；[CTLA-4]_H3.25_L0.124；[CTLA-4]_H3.25_L0.129；[CTLA-4]_H3.25_L0.132；[CTLA-4]_H3.4_L0.118；[CTLA-4]_H3.4_L0.119；[CTLA-4]_H3.4_L0.12；[CTLA-4]_H3.4_L0.121；[CTLA-4]_H3.4_L0.122；[CTLA-4]_H3.4_L0.123；[CTLA-4]_H3.4_L0.124；[CTLA-4]_H3.4_L0.125；[CTLA-4]_H3.4_L0.126；[CTLA-4]_H3.4_L0.127；[CTLA-4]_H3.4_L0.128；[CTLA-4]_H3.4_L0.129；[CTLA-4]_H3.4_L0.130；[CTLA-4]_H3.4_L0.131；[CTLA-4]_H3.4_L0.132；[CTLA-4]_H3.5_L2.1；[CTLA-4]_H3.5_L2.2；[CTLA-4]_H3.5_L2.3；[CTLA-4]_H3_L0；[CTLA-4]_H3_L0.22；[CTLA-4]_H3_L0.44；[CTLA-4]_H3_L0.67和[CTLA-4]_H3_L0.74；以及SEQIDNO：21到2918、SEQIDNO：2919到6208、SEQIDNO：36739到36818和SEQIDNO：35395到35416中列出的那些。对于来自图38的mAb-scFv格式主链1任选地包含M428LN434S，与人LAG-3结合的特定ABD包含但不限于：2A11_H0L0；2A11_H1.125_L2.113；2A11_H1.144_L2.142；2A11_H1_L2.122；2A11_H1_L2.123；2A11_H1_L2.124；2A11_H1_L2.25；2A11_H1_L2.47；2A11_H1_L2.50；2A11_H1_L2.91；2A11_H1_L2.93；2A11_H1_L2.97；2A11_H1L1；2A11_H1L2；2A11_H2L2；2A11_H3L1；2A11_H3L2；2A11_H4L1；2A11_H4L2；7G8_H0L0；7G8_H1L1；7G8_H3.18_L1.11；7G8_H3.23_L1.11；7G8_H3.28_L1；7G8_H3.28_L1.11；7G8_H3.28_L1.13；7G8_H3.30_L1.34；7G8_H3.30_L1.34；和7G8_H3L1；以及SEQIDNO：17135到20764、SEQIDNO：36819到36962、SEQIDNO：35417到35606、SEQIDNO：25194到32793和SEQIDNO：32794到33002中列出的那些。对于来自图38的mAb-scFv格式主链1任选地包含M428LN434S，与人BTLA结合的特定ABD包含但不限于：9C6_H0L0；9C6_H1.1_L1；和9C6_H1.11_L1；以及SEQIDNO：20885到21503和SEQIDNO：36707到36738中列出的那些。对于来自图38的mAb-scFv格式主链1任选地包含M428LN434S，与人TIM-3结合的特定ABD包含但不限于：1D10_H0L0；1D12_H0L0；3H3_H1L2.1；6C8_H0L0；6D9H01D12L0；7A9_H0L0；7B11_H0L0；7B11var_H0L0和7C2_H0L0；以及SEQIDNO：20765到20884、SEQIDNO：37587到37698和SEQIDNO：36347到36706中列出的那些。I.双scFv格式本发明还提供了如本领域已知且图1B中示出的双scFv格式。在这个实施例中，异源二聚体双特异性抗体由两个scFv-Fc单体这两个单体呈现vh-scFv连接子-vl-[任选结构域连接子]-CH2-CH3格式或vl-scFv连接子-vh-[任选结构域连接子]-CH2-CH3格式，或者一个单体在一个朝向上，而另一个单体在另一个朝向上构成。在此情况下，所有ABD都呈scFv格式，其中PD-1和CTLA-4、PD-1和TIM-3、PD-1和LAG-3、PD-1和TIGIT、PD-1和BTLA、CTLA-4和TIM-3、CTLA-4和LAG-3、CTLA-4和TIGIT、CTLA-4和BTLA、TIM-3和LAG-3、TIM-3和TIGIT、TIM-3和BTLA、LAG-3和TIGIT、LAG-3和BTLA、以及TIGIT和BTLA的任何组合都是有用的。这些组合的ABD序列可以如序列表所公开的或如图9到图13所示的，并且处于如图39和图40所示的任何组合。此外，双scFv格式的Fc结构域通常包括倾斜变体例如，如图3和图8中所示出的一组氨基酸取代，其中特别有用的倾斜变体选自由以下组成的群组：S364KE357Q：L368DK370S；L368DK370S：S364K；L368EK370S：S364K；T411TE360EQ362E：D401K；L368DK370S：S364KE357L、K370S：S364KE357Q、T366SL368AY407V：T366W、以及T366SL368AY407VY349C：T366WS354C、任选地消融变体包含如图5中所示出的那些变体、任选地带电荷scFv连接子包含如图7中所示出的那些连接子，并且重链包括pI变体包含如图4中所示出的那些变体。在一些实施例中，双scFv格式包含倾斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体，其包括倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及第一可变重结构域和第二可变重结构域，所述第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域构成与第一检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及第一可变重结构域和第二可变轻链，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与如本文所概述的第一检查点抑制剂结合的Fv，所述第二可变轻链与第二可变重链一起形成结合第二检查点抑制剂的FvABD；以及c轻链，其包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域。在这个格式下尤其用于一些实施例中的是Fab-scFv顺序CTLA-4XPD-1、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1和LAG-3XCTLA-4。在一些实施例中，双scFv格式包含倾斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体，其包括倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S、以及第一可变重结构域和第二可变重结构域，所述第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域构成与第一检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S、以及第一可变重结构域和第二可变轻链，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与如本文所概述的第一检查点抑制剂结合的Fv，所述第二可变轻链与第二可变重链一起形成结合第二检查点抑制剂的FvABD；以及c轻链，其包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域。在这个格式下尤其用于一些实施例中的是Fab-scFv顺序CTLA-4XPD-1、LAG-3XPD-1、BTLAXPD-1和LAG-3XCTLA-4。J.非异源二聚体双特异性抗体如本领域技术人员将了解的，本文所概述的Fv序列还可以用于单特异性抗体例如，“传统单克隆抗体”或非异源二聚体双特异性格式两者。适合的非异源二聚体双特异性格式是本领域已知的，并且包含如Spiess等人，《分子免疫学MolecularImmunology》67：95-1062015和Kontermann，mAb4：2，182-1972012中总体上描绘的许多不同格式，这两个文献通过引用明确地并入本文中的格式并且特别是对于附图、图例以及引文。K.单特异性单克隆抗体如本领域技术人员将了解的，本文所概述的新型Fv序列还可以用于单特异性抗体例如，“传统单克隆抗体”或非异源二聚体双特异性格式两者。因此，本发明提供了单克隆单特异性抗体，所述单克隆抗体包括6个CDR和或来自附图的vh和vl序列，通常具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区，其中IgG1、IgG2和IgG4包含包括S228P氨基酸取代的IgG4恒定区尤其用于一些实施例中。也就是说，本文中的具有“H_L”名称的任何序列可以连接到人IgG1抗体的恒定区。VI.针对靶抗原的抗原结合结构域本发明的双特异性抗体具有两个不同的抗原结合结构域ABD，所述两个不同的ABD与呈总体上如图1所示出的二价双特异性格式或三价双特异性格式的两个不同的靶检查点抗原“靶对”结合。适合的靶检查点抗原包含人以及有时食蟹猴PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT和BTLA，图2中示出了其序列。因此，适合的双特异性抗体与PD-1和CTLA-4、PD-1和TIM-3、PD-1和LAG-3、PD-1和TIGIT、PD-1和BTLA、CTLA-4和TIM-3、CTLA-4和LAG-3、CTLA-4和TIGIT、CTLA-4和BTLA、TIM-3和LAG-3、TIM-3和TIGIT、TIM-3和BTLA、LAG-3和TIGIT、LAG-3和BTLA、以及TIGIT和BTLA结合。应注意，针对每一对，这些双特异性抗体通常被命名为“抗PD-1X抗CTLA-4”或通常简化地或为方便起见并且因此可互换地被命名为“PD-1XCTLA-4”等。应注意，除非本文另外说明，以名称列出的抗原的顺序不赋予结构；也就是说，PD-1XCTLA-4开瓶器抗体可以具有与PD-1或CTLA-4结合的scFv，尽管在一些情况下，所述顺序指定了如所指示的结构。如本文中更全面地概述的，ABD的这些组合可以呈如下文概述的各种各样的格式，通常是一个ABD呈Fab格式并且另一个呈scFv格式的组合。如本文中所讨论的并且如图1中所示出的，一些格式使用单个Fab和单个scFv图1A、图1C和图1D，并且一些格式使用两个Fab和单个scFv图1E、图1F、图1G、图1H和图1I。A.抗原结合结构域如本文中所讨论的，本发明的双特异性检查点异源二聚体抗体包含两个抗原结合结构域ABD，所述两个ABD中的每一个与不同的检查点蛋白质结合。如本文所概述的，这些异源二聚体抗体可以是双特异性且二价的每个抗原与呈例如图1A中所描绘的格式的单个ABD结合或双特异性且三价的一个抗原与单个ABD结合，并且另一个抗原与例如如图1F中所描述的两个ABD结合。此外，通常，ABD中的一个包括如本文中所概述的在从vh-scFv连接子-vl或vl-scFv连接子-vh的N-末端到C-末端的朝向上的scFv。根据格式，其它ABD中的一个或两个通常是包括一个蛋白质链上的vh结构域通常作为重链的组分和另一个蛋白质链上的vl通常作为轻链的组分的Fab。本发明还提供了与如下文所概述的许多不同的检查点蛋白质结合的许多ABD。如本领域技术人员将了解的，任何一组6个CDR或vh和vl结构域可以呈scFv格式或Fab格式，所述格式然后被添加到重恒定结构域和轻恒定结构域，其中重恒定结构域包括变体包含在CH1结构域以及Fc结构域内。序列表中含有的scFv序列利用特定带电荷连接子，而如本文所概述的，可以使用不带电荷或其它带电荷的连接子，包含图7中所描述的那些连接子。此外，如上文所讨论的，序列表中使用的用于鉴定CDR的编号是Kabat，然而，可以使用不同的编号，所述不同的编号将改变如表1所示出的CDR的氨基酸序列。对于本文所列出的所有可变重结构域和轻结构域，可以制作另外的变体。如本文所概述的，在一些实施例中，一组6个CDR可以具有0个、1个、2个、3个、4个或5个氨基酸修饰其中氨基酸取代特别有用以及可变重结构域和轻结构域的框架区的变化，只要框架除CDR之外保持与选自图1中的美国专利号7,657,380中列出的那些序列的人种系序列至少约80％、85％或90％的同一性，所述美国专利的附图和图例通过引用以其全部内容并入本文。因此，例如，如本文所描述的相同CDR可以与来自人种系序列的不同框架序列组合，只要框架区保持与选自图1中的美国专利号7,657,380中列出的那些序列的人种系序列至少80％、85％或90％的同一性。可替代地，CDR可以具有氨基酸修饰例如，一组CDR中的1个、2个、3个、4个或5个氨基酸修饰也就是说，只要一组6个CDR的总数量变化小于6个氨基酸修饰，CDR就可以被修饰，其中改变了CDR的任何组合；例如，vlCDR1中可以存在一个改变，vhCDR2中可以存在两个改变，vhCDR3中不存在改变等，以及具有框架区改变，只要框架区保持与选自图1中的美国专利号7,657,380中列出的那些序列的人种系序列至少80％、85％或90％的同一性。B.PD-1抗原结合结构域在一些实施例中，ABD中的一个与PD-1结合。SEQIDNO：6209到11464、SEQIDNO：11465到17134、SEQIDNO：33003到33072、SEQIDNO：33073到35394和SEQIDNO：36127到36146中描绘了适合的多组6个CDR和或vh和vl结构域以及scFv序列。图9中示出了一些实施例中特别关注的ABD序列，并且所述ABD序列包含序列表中的具有以下标识符的那些序列：1G6_H1.279_L1.194；1G6_H1.280_L1.224；1G6_L1.194_H1.279；1G6_L1.210_H1.288；和2E9_H1L1。如本领域技术人员将了解的，适合的抗PD-1ABD可以包括如在这些序列和附图中所描述的、如其被加下划线的一组6个CDR或在如本文中所描述和如表1中所示出的使用不同编号方案的情况下使用在vh和vl序列SEQIDNO：6209到11464、SEQIDNO：11465到17134、SEQIDNO：33003到33072、SEQIDNO：33073到35394、以及SEQIDNO：36127到36146内的其它比对鉴定的CDR。适合的ABD还可以包含如这些序列和附图中所描绘的用作scFv或Fab的整个vh和vl序列。在本文中的含有Fv到PD-1的许多实施例中，scFv单体与PD-1结合。如本文所讨论的，当PD-1是抗原之一时，靶对的另一个选自CTLA-4SEQIDNO：21到2918、SEQIDNO：2919到6208、SEQIDNO：36739到36818、以及SEQIDNO：35395到35416中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、TIM-3SEQIDNO：20765到20884、SEQIDNO：37587到37698、以及SEQIDNO：36347到36706中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、LAG-3SEQIDNO：17135到20764、SEQIDNO：36819到36962、SEQIDNO：35417到35606、SEQIDNO：25194到32793以及SEQIDNO：32794到33002中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、BTLASEQIDNO：20885到21503和SEQIDNO：36707到36738中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、以及TIGITSEQIDNO：21504到21523和SEQIDNO：37435到37586中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列或vh和vl序列。与人PD-1结合的特别有用的ABD包含但不限于：1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224；1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288和2E9_H1L1。除了序列表中公开的形成ABD到PD-1的亲本CDR组之外，本发明提供了变体CDR组。在一个实施例中，如由Biacore、表面等离子体共振SPR和或BLI生物双层干涉，例如八隅体测定测定中的至少一个所测量的，只要ABD仍能够与靶抗原结合，一组6个CDR就可以具有来自亲本CDR的1个、2个、3个、4个或5个氨基酸改变，其中所述BLI特别用于许多实施例中。除了本文公开的形成ABD到PD-1的亲本可变重结构域和可变轻结构域之外，本发明提供了变体vh和vl结构域。在一个实施例中，如由Biacore、表面等离子体共振SPR和或BLI生物双层干涉，例如八隅体测定测定中的至少一个所测量的，只要ABD仍能够与靶抗原结合，变体vh和vl结构域各自就可以具有来自亲本vh和vl结构域的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸改变，其中所述BLI特别用于许多实施例中。在另一个实施例中，如由Biacore、表面等离子体共振SPR和或BLI生物双层干涉，例如八隅体测定测定中的至少一个所测量的，只要ABD仍能够与靶抗原结合，变体vh和vl就与相应的亲本vh或vl具有至少90％、95％、97％、98％或99％的同一性，其中所述BLI特别用于许多实施例中。特别优选的实施例包含图37的开瓶器格式主链的任一个内包含的呈scFv格式的1G6_L1.194_H1.279抗PD-1Fv。特别优选的实施例包含图38的mAb-scFv格式主链的任一个内包含的呈scFv格式的1G6_L1.194_H1.279抗PD-1Fv。C.CTLA-4抗原结合结构域在一些实施例中，ABD中的一个与CTLA-4结合。SEQIDNO：21到2918、SEQIDNO：2919到6208、SEQIDNO：36739到36818和SEQIDNO：35395到35416中描绘了适合的多组6个CDR和或vh和vl结构域以及scFv序列。图10中示出了一些实施例中特别关注的ABD序列，并且所述ABD序列还包含序列表中的具有以下标识符的那些序列：[CTLA-4]_H0.25_L0；[CTLA-4]_H0.26_L0；[CTLA-4]_H0.27_L0；[CTLA-4]_H0.29_L0；[CTLA-4]_H0.38_L0；[CTLA-4]_HO.39_L0；0[CTLA-4]_H0.40_L0；[CTLA-4]_H0.70_L0；[CTLA-4]_H0_L0.22；[CTLA-4]_H2_L0；[CTLA-4]_H3.21_L0.124；[CTLA-4]_H3.21_L0.129；[CTLA-4]_H3.21_L0.132；[CTLA-4]_H3.23_L0.124；[CTLA-4]_H3.23_L0.129；[CTLA-4]_H3.23_L0.132；[CTLA-4]_H3.25_L0.124；[CTLA-4]_H3.25_L0.129；[CTLA-4]_H3.25_L0.132；[CTLA-4]_H3.4_L0.118；[CTLA-4]_H3.4_L0.119；[CTLA-4]_H3.4_L0.12；[CTLA-4]_H3.4_L0.121；[CTLA-4]_H3.4_L0.122；[CTLA-4]_H3.4_L0.123；[CTLA-4]_H3.4_L0.124；[CTLA-4]_H3.4_L0.125；[CTLA-4]_H3.4_L0.126；[CTLA-4]_H3.4_L0.127；[CTLA-4]_H3.4_L0.128；[CTLA-4]_H3.4_L0.129；[CTLA-4]_H3.4_L0.130；[CTLA-4]_H3.4_L0.131；[CTLA-4]_H3.4_L0.132；[CTLA-4]_H3.5_L2.1；[CTLA-4]_H3.5_L2.2；[CTLA-4]_H3.5_L2.3；[CTLA-4]_H3_L0；[CTLA-4]_H3_L0.22；[CTLA-4]_H3_L0.44；[CTLA-4]_H3_L0.67；以及[CTLA-4]_H3_L0.74。如本领域技术人员将了解的，适合的抗CTLA-4ABD可以包括如在这些序列和附图中所描述的、如其被加下划线的一组6个CDR或在如本文中所描述和如表1中所示出的使用不同编号方案的情况下使用在vh和vl序列SEQIDNO：21到2918、SEQIDNO：2919到6208、SEQIDNO：36739到36818、以及SEQIDNO：35395到35416内的其它比对鉴定的CDR。适合的ABD还可以包含如这些序列和附图中所描绘的用作scFv或Fab的整个vh和vl序列。在本文中的含有Fv到CTLA-4的许多实施例中，scFv单体与CTLA-4结合。如本文所讨论的，当CTLA-4是抗原之一时，靶对的另一个选自PD-1SEQIDNO：6209到11464、SEQIDNO：11465到17134、SEQIDNO：33003到33072、SEQIDNO：33073到35394以及SEQIDNO：36127到36146中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、TIM-3SEQIDNO：20765到20884、SEQIDNO：37587到-37698、以及SEQIDNO：36347到36706中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、LAG-3SEQIDNO：17135到-20764、SEQIDNO：36819到36962、SEQIDNO：35417到35606、SEQIDNO：25194到32793以及SEQIDNO：32794到33002中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、BTLASEQIDNO：20885到21503和SEQIDNO：36707到36738中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、以及TIGITSEQIDNO：21504到21523和SEQIDNO：37435到37586中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列或vh和vl序列。除了序列表中公开的形成ABD到CTLA-4的亲本CDR组之外，本发明提供了变体CDR组。在一个实施例中，如由Biacore、表面等离子体共振SPR和或BLI生物双层干涉，例如八隅体测定测定中的至少一个所测量的，只要ABD仍能够与靶抗原结合，一组6个CDR就可以具有来自亲本CDR的1个、2个、3个、4个或5个氨基酸改变，其中所述BLI特别用于许多实施例中。除了本文公开的形成ABD到CTLA-4的亲本可变重结构域和可变轻结构域之外，本发明提供了变体vh和vl结构域。在一个实施例中，如由Biacore、表面等离子体共振SPR和或BLI生物双层干涉，例如八隅体测定测定中的至少一个所测量的，只要ABD仍能够与靶抗原结合，变体vh和vl结构域各自就可以具有来自亲本vh和vl结构域的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸改变，其中所述BLI特别用于许多实施例中。在另一个实施例中，如由Biacore、表面等离子体共振SPR和或BLI生物双层干涉，例如八隅体测定测定中的至少一个所测量的，只要ABD仍能够与靶抗原结合，变体vh和vl就与相应的亲本vh或vl具有至少90％、95％、97％、98％或99％的同一性，其中所述BLI特别用于许多实施例中。特别优选的实施例包含图37的开瓶器格式主链的任一个内包含的呈Fab格式的[CTLA-4]_H3_L0.22抗CTLA-4Fv。特别优选的实施例包含图37的开瓶器格式主链的任一个内包含的呈scFv格式的[CTLA-4]_H3_L0.22抗CTLA-4Fv。特别优选的实施例包含图38的mAb-scFv格式主链的任一个内包含的呈scFv格式的[CTLA-4]_H3_L0.22抗CTLA-4Fv。特别优选的实施例包含图38的mAb-scFv格式主链的任一个内包含的呈Fab格式的[CTLA-4]_H3_L0.22抗CTLA-4Fv。D.TIM-3抗原结合结构域在一些实施例中，ABD中的一个与TIM-3结合。SEQIDNO：20765到20884、SEQIDNO：37587到37698和SEQIDNO：36347到36706中描绘了适合的多组6个CDR和或vh和vl结构域以及scFv序列。一些实施例中特别关注的ABD序列包含序列表中的具有以下标识符的那些序列：1D10_H0L0；1D12_H0L0；3H3_H1_L2.1；6C8_H0L0；6D9_H0_1D12_L0；7A9_H0L0；7B11_H0L0；7B11var_H0L0；以及7C2_H0L0。如本领域技术人员将了解的，适合的抗TIM-3ABD可以包括如在这些序列和附图中所描述的、如其被加下划线的一组6个CDR或在如本文中所描述和如表1中所示出的使用不同编号方案的情况下使用在vh和vl序列SEQIDNO：20765到20884、SEQIDNO：37587到37698、以及SEQIDNO：36347到36706内的其它比对鉴定的CDR。适合的ABD还可以包含如这些序列和附图中所描绘的用作scFv或Fab的整个vh和vl序列。在本文中的含有Fv到TIM-3的许多实施例中，Fab单体与TIM-3结合。如本文所讨论的，当TIM-3是抗原之一时，靶对的另一个选自PD-1SEQIDNO：6209到11464、SEQIDNO：11465到17134、SEQIDNO：33003到33072、SEQIDNO：33073到35394以及SEQIDNO：36127到36146中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、CTLA-4SEQIDNO：21到2918、SEQIDNO：2919到6208、SEQIDNO：36739到36818以及SEQIDNO：35395到35416中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、LAG-3SEQIDNO：17135到-20764、SEQIDNO：36819到36962、SEQIDNO：35417到35606、SEQIDNO：25194到32793以及SEQIDNO：32794到33002中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、BTLASEQIDNO：20885到21503和SEQIDNO：36707到36738中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、以及TIGITSEQIDNO：21504到21523和SEQIDNO：37435到37586中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列或vh和vl序列。除了序列表中公开的形成ABD到TIM-3的亲本CDR组之外，本发明提供了变体CDR组。在一个实施例中，如由Biacore、表面等离子体共振SPR和或BLI生物双层干涉，例如八隅体测定测定中的至少一个所测量的，只要ABD仍能够与靶抗原结合，一组6个CDR就可以具有来自亲本CDR的1个、2个、3个、4个或5个氨基酸改变，其中所述BLI特别用于许多实施例中。除了本文公开的形成ABD到TIM-3的亲本可变重结构域和可变轻结构域之外，本发明提供了变体vh和vl结构域。在一个实施例中，如由Biacore、表面等离子体共振SPR和或BLI生物双层干涉，例如八隅体测定测定中的至少一个所测量的，只要ABD仍能够与靶抗原结合，变体vh和vl结构域各自就可以具有来自亲本vh和vl结构域的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸改变，其中所述BLI特别用于许多实施例中。在另一个实施例中，如由Biacore、表面等离子体共振SPR和或BLI生物双层干涉，例如八隅体测定测定中的至少一个所测量的，只要ABD仍能够与靶抗原结合，变体vh和vl就与相应的亲本vh或vl具有至少90％、95％、97％、98％或99％的同一性，其中所述BLI特别用于许多实施例中。LAG-3抗原结合结构域在一些实施例中，ABD中的一个与LAG-3结合。SEQIDNO：17135到20764、SEQIDNO：36819到36962、SEQIDNO：35417到35606、SEQIDNO：25194到32793以及SEQIDNO：32794到33002中描绘了适合的多组6个CDR和或vh和vl结构域以及scFv序列。图11中示出了一些实施例中特别关注的ABD序列，并且所述ABD序列还包含序列表中的具有以下标识符的那些序列：2A11_H0L0；2A11_H1.125_L2.113；2A11_H1.144_L2.142；2A11_H1_L2.122；2A11_H1_L2.123；2A11_H1_L2.124；2A11_H1_L2.25；2A11_H1_L2.47；2A11_H1_L2.50；2A11_H1_L2.91；2A11_H1_L2.93；2A11_H1_L2.97；2A11_H1L1；2A11_H1L2；2A11_H2L2；2A11_H3L1；2A11_H3L2；2A11_H4L1；2A11_H4L2；7G8_H0L0；7G8_H1L1；7G8_H3.18_L1.11；7G8_H3.23_L1.11；7G8_H3.28_L1；7G8_H3.28_L1.11；7G8_H3.28_L1.13；7G8_H3.30_L1.34；7G8_H3.30_L1.34；以及7G8_H3L1。如本领域技术人员将了解的，适合的抗LAG-3ABD可以包括如在这些序列和附图中所描述的、如其被加下划线的一组6个CDR或在如本文中所描述和如表1中所示出的使用不同编号方案的情况下使用在vh和vl序列SEQIDNO：17135到20764、SEQIDNO：36819到36962、SEQIDNO：35417到35606、SEQIDNO：25194到32793、以及SEQIDNO：32794到33002内的其它比对鉴定的CDR。适合的ABD还可以包含如这些序列和附图中所描绘的用作scFv或Fab的整个vh和vl序列。在本文中的含有Fv到LAG-3的许多实施例中，Fab单体与LAG-3结合。如本文所讨论的，当LAG-3是抗原之一时，靶对的另一个选自PD-1SEQIDNO：6209到11464、SEQIDNO：11465到17134、SEQIDNO：33003到33072、SEQIDNO：33073到35394以及SEQIDNO：36127到36146中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、CTLA-4SEQIDNO：21到2918、SEQIDNO：2919到6208、SEQIDNO：36739到36818以及SEQIDNO：35395到35416中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、TIM-3SEQIDNO：20765到20884、SEQIDNO：37587到37698以及SEQIDNO：36347到36706中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、BTLASEQIDNO：20885到21503和SEQIDNO：36707到36738中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、以及TIGITSEQIDNO：21504到21523和SEQIDNO：37435到37586中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列或vh和vl序列。除了序列表中公开的形成ABD到LAG-3的亲本CDR组之外，本发明提供了变体CDR组。在一个实施例中，如由Biacore、表面等离子体共振SPR和或BLI生物双层干涉，例如八隅体测定测定中的至少一个所测量的，只要ABD仍能够与靶抗原结合，一组6个CDR就可以具有来自亲本CDR的1个、2个、3个、4个或5个氨基酸改变，其中所述BLI特别用于许多实施例中。除了本文公开的形成ABD到LAG-3的亲本可变重结构域和可变轻结构域之外，本发明提供了变体vh和vl结构域。在一个实施例中，如由Biacore、表面等离子体共振SPR和或BLI生物双层干涉，例如八隅体测定测定中的至少一个所测量的，只要ABD仍能够与靶抗原结合，变体vh和vl结构域各自就可以具有来自亲本vh和vl结构域的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸改变，其中所述BLI特别用于许多实施例中。在另一个实施例中，如由Biacore、表面等离子体共振SPR和或BLI生物双层干涉，例如八隅体测定测定中的至少一个所测量的，只要ABD仍能够与靶抗原结合，变体vh和vl就与相应的亲本vh或vl具有至少90％、95％、97％、98％或99％的同一性，其中所述BLI特别用于许多实施例中。特别优选的实施例包含图37的开瓶器格式主链的任一个内包含的呈Fab格式的7G8_H3.30_L1.34抗LAG-3Fv。特别优选的实施例包含图37的开瓶器格式主链的任一个内包含的呈scFv格式的7G8_H3.30_L1.34抗LAG-3Fv。E.BTLA抗原结合结构域在一些实施例中，ABD中的一个与BTLA结合。SEQIDNO：20885到21503和SEQIDNO：36707到36738中描绘了适合的多组6个CDR和或vh和vl结构域以及scFv序列。图12中示出了一些实施例中特别关注的ABD序列，并且所述ABD序列还包含序列表中的具有以下标识符的那些序列：9C6_H0L0；9C6_H1.1_L1；以及9C6_H1.11_L1。如本领域技术人员将了解的，适合的抗BTLAABD可以包括如在这些序列和附图中所描述的、如其被加下划线的一组6个CDR或在如本文中所描述和如表1中所示出的使用不同编号方案的情况下使用在vh和vl序列SEQIDNO：20885到21503以及SEQIDNO：36707到36738内的其它比对鉴定的CDR。适合的ABD还可以包含如这些序列和附图中所描绘的用作scFv或Fab的整个vh和vl序列。在本文中的含有Fv到BTLA的许多实施例中，Fab单体与BTLA结合。如本文所讨论的，当LAG-3是抗原之一时，靶对的另一个选自PD-1SEQIDNO：6209到11464、SEQIDNO：11465到17134、SEQIDNO：33003到33072、SEQIDNO：33073到35394以及SEQIDNO：36127到36146中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、CTLA-4SEQIDNO：21到2918、SEQIDNO：2919到6208、SEQIDNO：36739到36818以及SEQIDNO：35395到35416中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、TIM-3SEQIDNO：20765到20884、SEQIDNO：37587到37698以及SEQIDNO：36347到36706中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、LAG-3SEQIDNO：17135到20764、SEQIDNO：36819到36962、SEQIDNO：35417到35606、SEQIDNO：25194到32793以及SEQIDNO：32794到33002中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、以及TIGITSEQIDNO：21504到21523和SEQIDNO：37435到37586中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列或vh和vl序列。除了序列表中公开的形成ABD到BTLA的亲本CDR组之外，本发明提供了变体CDR组。在一个实施例中，如由Biacore、表面等离子体共振SPR和或BLI生物双层干涉，例如八隅体测定测定中的至少一个所测量的，只要ABD仍能够与靶抗原结合，一组6个CDR就可以具有来自亲本CDR的1个、2个、3个、4个或5个氨基酸改变，其中所述BLI特别用于许多实施例中。除了本文公开的形成ABD到BTLA的亲本可变重结构域和可变轻结构域之外，本发明提供了变体vh和vl结构域。在一个实施例中，如由Biacore、表面等离子体共振SPR和或BLI生物双层干涉，例如八隅体测定测定中的至少一个所测量的，只要ABD仍能够与靶抗原结合，变体vh和vl结构域各自就可以具有来自亲本vh和vl结构域的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸改变，其中所述BLI特别用于许多实施例中。在另一个实施例中，如由Biacore、表面等离子体共振SPR和或BLI生物双层干涉，例如八隅体测定测定中的至少一个所测量的，只要ABD仍能够与靶抗原结合，变体vh和vl就与相应的亲本vh或vl具有至少90％、95％、97％、98％或99％的同一性，其中所述BLI特别用于许多实施例中。特别优选的实施例包含图37的开瓶器格式主链的任一个内包含的呈Fab格式的9C6H1.1L1抗LAG-3Fv。特别优选的实施例包含图37的开瓶器格式主链的任一个内包含的呈scFv格式的7G8_H3.30_L1.34抗LAG-3Fv。F.TIGIT抗原结合结构域在一些实施例中，ABD中的一个与TIGIT结合。SEQIDNO：21504到21523和SEQIDNO：37435到37586中描绘了适合的多组6个CDR和或vh和vl结构域以及scFv序列。如本领域技术人员将了解的，适合的抗TIGITABD可以包括如在这些序列和附图中所描述的、如其被加下划线的一组6个CDR或在如本文中所描述和如表1中所示出的使用不同编号方案的情况下使用在vh和vl序列SEQIDNO：21504到21523以及SEQIDNO：37435到37586内的其它比对鉴定的CDR。适合的ABD还可以包含如这些序列和附图中所描绘的用作scFv或Fab的整个vh和vl序列。在本文中的含有Fv到TIGIT的许多实施例中，Fab单体与TIGIT结合。如本文所讨论的，当LAG-3是抗原之一时，靶对的另一个选自PD-1SEQIDNO：6209到11464、SEQIDNO：11465到17134、SEQIDNO：33003到33072、SEQIDNO：33073到35394以及SEQIDNO：36127到36146中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、CTLA-4SEQIDNO：21到2918、SEQIDNO：2919到6208、SEQIDNO：36739到36818以及SEQIDNO：35395到35416中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、TIM-3SEQIDNO：20765到20884、SEQIDNO：37587到37698以及SEQIDNO：36347到36706中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列组或vh和vl序列、LAG-3SEQIDNO：17135到20764、SEQIDNO：36819到36962、SEQIDNO：35417到35606、SEQIDNO：25194到32793以及SEQIDNO：32794到33002中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列或vh和vl序列、以及BTLASEQIDNO：20885到21503和SEQIDNO：36707到36738中描绘了适合的序列所述序列可以是scFv序列、CDR序列或vh和vl序列。G.具体双特异性实施例本发明提供了如下文所概述的许多具体双特异性抗体。1.LAG-3XCTLA-4在一些实施例中，本发明提供了双特异性异源二聚体抗体，所述双特异性异源二聚体抗体包括与人LAG-3结合的第一ABD和与人CTLA-4结合的第二ABD，所述第一ABD和所述第二ABD可以呈图1中所示出的任何格式。本公开的大部分涉及一种开瓶器格式，其中Fab是LAG-3侧，并且CLTA-4侧是scFv侧，但这对于本文中的所有实施例可以是颠倒的。在一个实施例中，LAG-3XCTLA-4双特异性抗体呈图1A的开瓶器格式，其中CTLA-4ABD是scFv。在另一个实施例中，LAG-3XCTLA-4双特异性抗体呈图1F的中央-scFv格式，其中LAG-3ABD是Fab组分。在另一个实施例中，LAG-3XCTLA-4双特异性抗体呈图1F的中央-scFv格式，其中CTLA-4ABD是scFv。LAG-3XCTLA-4双特异性抗体呈开瓶器格式或中央-scFv格式通常包含如本文中所概述的倾斜变体、pI变体和消融变体。也就是说，在任一格式下，两个单体的Fc结构域可以包括倾斜变体例如，一组如图3和图8所示出的氨基酸取代，任选地消融变体包含图5中示出的那些变体，并且包括Fab侧例如，重链恒定结构域的单体包括pI变体包含图4中示出的那些变体。在一些实施例中，LAG-3XCTLA-4双特异性抗体包括具有倾斜变体的Fc结构域，其中特别有用的倾斜变体选自由以下组成的群组：S364KE357Q：L368DK370S；L368DK370S：S364K；L368EK370S：S364K；T411TE360EQ362E：D401K；L368DK370S：S364KE357L；K370S：S364KE357Q；T366SL368AY407V：T366W以及T366SL368AY407VY349C：T366WS354C。在一些实施例中，LAG-3XCTLA-4抗体包含倾斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体“scFv单体”，其包括带电荷scFv连接子图7的+H序列在一些实施例中是优选的、倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及与如本文所概述的检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体“Fab单体”，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及可变重结构域，所述可变重结构域与可变轻结构域构成与如本文所概述的第二检查点抑制剂结合的Fv；以及c轻链。这个实施例的具体实例利用LAG-3Fab7G8_H3.30_L1.34和CTLA-4scFv[CTLA-4]_H3.23_L0.129，尽管序列表中的CTLA-4或LAG-3Fv中的任一个可以以任何组合成对并且使用。在一些实施例中，LAG-3XCTLA-4抗体包含倾斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体“scFv单体”，其包括带电荷scFv连接子图7的+H序列在一些实施例中是优选的、倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S和与如本文所概述的检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体“Fab单体”，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S、以及可变重结构域，所述可变重结构域与可变轻结构域构成与如本文所概述的第二检查点抑制剂结合的Fv；以及c轻链。这个实施例的具体实例利用LAG-3Fab7G8_H3.30_L1.34和CTLA-4scFv[CTLA-4]_H3.23_L0.129，尽管序列表中的CTLA-4或LAG-3Fv中的任一个可以以任何组合成对并且使用。附加实施例包含来自图37的具有LAG-3Fab7G8_H3.30_L1.34和CTLA-4scFv[CTLA-4]_H3.23_L0.129的主链中的任一个。附加实施例包含来自图38的具有LAG-3Fab7G8_H3.30_L1.34和CTLA-4scFv[CTLA-4]_H3.23_L0.129的主链中的任一个。在一些实施例中，对于LAG-3XCLTA-4双特异性抗体，LAG-3Fab侧的Fv选自序列表中的具有以下标识符的那些序列：2A11_H0L0；2A11_H1.125_L2.113；2A11_H1.144_L2.142；2A11_H1_L2.122；2A11_H1_L2.123；2A11_H1_L2.124；2A11_H1_L2.25；2A11_H1_L2.47；2A11_H1_L2.50；2A11_H1_L2.91；2A11_H1_L2.93；2A11_H1_L2.97；2A11_H1L1；2A11_H1L2；2A11_H2L2；2A11_H3L1；2A11_H3L2；2A11_H4L1；2A11_H4L2；7G8_H0L0；7G8_H1L1；7G8_H3.18_L1.11；7G8_H3.23_L1.11；7G8_H3.28_L1；7G8_H3.28_L1.11；7G8_H3.28_L1.13；7G8_H3.30_L1.34；7G8_H3.30_L1.34；以及7G8_H3L1。CTLA-4scFv侧的Fv选自序列表中的具有以下标识符的那些序列：[CTLA-4]_H0.25_L0；[CTLA-4]_H0.26_L0；[CTLA-4]_H0.27_L0；[CTLA-4]_H0.29_L0；[CTLA-4]_H0.38_L0；[CTLA-4]_H0.39_L0；0[CTLA-4]_H0.40_L0；[CTLA-4]_H0.70_L0；[CTLA-4]_H0_L0.22；[CTLA-4]_H2_L0；[CTLA-4]_H3.21_L0.124；[CTLA-4]_H3.21_L0.129；[CTLA-4]_H3.21_L0.132；[CTLA-4]_H3.23_L0.124；[CTLA-4]_H3.23_L0.129；[CTLA-4]_H3.23_L0.132；[CTLA-4]_H3.25_L0.124；[CTLA-4]_H3.25_L0.129；[CTLA-4]_H3.25_L0.132；[CTLA-4]_H3.4_L0.118；[CTLA-4]_H3.4_L0.119；[CTLA-4]_H3.4_L0.12；[CTLA-4]_H3.4_L0.121；[CTLA-4]_H3.4_L0.122；[CTLA-4]_H3.4_L0.123；[CTLA-4]_H3.4_L0.124；[CTLA-4]_H3.4_L0.125；[CTLA-4]_H3.4_L0.126；[CTLA-4]_H3.4_L0.127；[CTLA-4]_H3.4_L0.128；[CTLA-4]_H3.4_L0.129；[CTLA-4]_H3.4_L0.130；[CTLA-4]_H3.4_L0.131；[CTLA-4]_H3.4_L0.132；[CTLA-4]_H3.5_L2.1；[CTLA-4]_H3.5_L2.2；[CTLA-4]_H3.5_L2.3；[CTLA-4]_H3_L0；[CTLA-4]_H3_L0.22；[CTLA-4]_H3_L0.44；[CTLA-4]_H3_L0.67；以及[CTLA-4]_H3_L0.74。在一些实施例中，LAG-3XCTLA-4双特异性抗体选自SEQIDNO：35607到35866和SEQIDNO：21524到22620中列出的那些构建体。在一些实施例中，LAG-3XCTLA-4双特异性抗体选自：XENP20206、XENP21582、XENP21584、XENP21588、XENP22123、XENP22124、XENP22125、XENP22604、XENP22672、XENP22847、XENP22847、XENP22841和XENP22849。2.BTLAXPD-1在一些实施例中，本发明提供了双特异性异源二聚体抗体，所述双特异性异源二聚体抗体包括与人BTLA结合的第一ABD和与人PD-1结合的第二ABD，所述第一ABD和所述第二ABD可以呈图1中所示出的任何格式。本公开的大部分涉及一种开瓶器格式，其中Fab是BTLA侧，并且PD-1侧是scFv侧，但这对于本文中的所有实施例可以是颠倒的。在一个实施例中，BTLAXPD-1双特异性抗体呈图1A的开瓶器格式，其中PD-1ABD是scFv。在另一个实施例中，BTLAXPD-1双特异性抗体呈图1F的中央-scFv格式，其中BTLAABD是Fab组分。在另一个实施例中，BTLAXPD-1双特异性抗体呈图1F的中央-scFv格式，其中PD-1ABD是scFv。BTLAXPD-1双特异性抗体呈开瓶器格式或中央-scFv格式通常包含如本文中所概述的倾斜变体、pI变体和消融变体。也就是说，在任一格式下，两个单体的Fc结构域可以包括倾斜变体例如，一组如图3和图8所示出的氨基酸取代，任选地消融变体包含图5中示出的那些变体，并且包括Fab侧例如，重链恒定结构域的单体包括pI变体包含图4中示出的那些变体。在一些实施例中，BTLAXPD-1双特异性抗体包括具有倾斜变体的Fc结构域，其中特别有用的倾斜变体选自由以下组成的群组：S364KE357Q：L368DK370S；L368DK370S：S364K；L368EK370S：S364K；T411TE360EQ362E：D401K；L368DK370S：S364KE357L；K370S：S364KE357Q；T366SL368AY407V：T366W以及T366SL368AY407VY349C：T366WS354C。在一些实施例中，BTLAXPD-1抗体包含倾斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体“scFv单体”，其包括带电荷scFv连接子图7的+H序列在一些实施例中是优选的、倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及与如本文所概述的检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体“Fab单体”，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及可变重结构域，所述可变重结构域与可变轻结构域构成与如本文所概述的第二检查点抑制剂结合的Fv；以及c轻链。这个实施例的具体实例利用BTLAFab9C6_H1.1_L1和PD-1scFv1G6_L1.194_H1.279，尽管序列表中的BTLA或PD-1Fv中的任一个可以以任何组合成对并且使用。在一些实施例中，BTLAXPD-1抗体包含倾斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体“scFv单体”，其包括带电荷scFv连接子图7的+H序列在一些实施例中是优选的、倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S、以及与如本文所概述的检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体“Fab单体”，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S和可变重结构域，所述可变重结构域与可变轻结构域构成与如本文所概述的第二检查点抑制剂结合的Fv；以及c轻链。这个实施例的具体实例利用BTLAFab9C6_H1.1_L1和PD-1scFv1G6_L1.194_H1.279，尽管序列表中的BTLA或PD-1Fv中的任一个可以以任何组合成对并且使用。附加实施例包含来自图37的具有BTLAFab9C6H1.1L1和PD-1scFv1G6_L1.194_H1.279的主链中的任一个。附加实施例包含来自图38的具有BTLAFab9C6H1.1L1和PD-1scFv1G6_L1.194_H1.279的主链中的任一个。在一些实施例中，对于BTLAXPD-1双特异性抗体，BTLAFab侧的Fv选自序列表中的具有以下标识符的那些序列：9C6_H0L0、9C6_H1.1_L1、9C6_H1.11_L1。PD-1scFv侧的Fv选自序列表中的具有以下标识符的那些序列：1G6_H1.279_L1.194；1G6_H1.280_L1.224；1G6_L1.194_H1.279；1G6_L1.210_H1.288；和2E9_H1L1。在一些实施例中，BTLAXPD-1双特异性抗体选自构建体，所述构建体包含SEQIDNO：22724到23315和SEQIDNO：36147到36166中列出那些构建体。在一些实施例中，BTLAXPD-1双特异性抗体选自XENP20895、XENP21220、XENP21221和XENP22858。3.CTLA-4XPD-1在一些实施例中，本发明提供了双特异性异源二聚体抗体，所述双特异性异源二聚体抗体包括与人CTLA-4结合的第一ABD和与人PD-1结合的第二ABD，所述第一ABD和所述第二ABD可以呈图1中所示出的任何格式。本公开的大部分涉及一种开瓶器格式，其中Fab是CTLA-4侧，并且PD-1侧是scFv侧，但这对于本文中的所有实施例可以是颠倒的。在一个实施例中，CTLA-4XPD-1双特异性抗体呈图1A的开瓶器格式，其中PD-1ABD是scFv。在另一个实施例中，CTLA-4XPD-1双特异性抗体呈图1F的中央-scFv格式，其中CTLA-4ABD是Fab组分。在另一个实施例中，CTLA-4XPD-1双特异性抗体呈图1F的中央-scFv格式，其中PD-1ABD是scFv。CTLA-4XPD-1双特异性抗体呈开瓶器格式或中央-scFv格式通常包含如本文中所概述的倾斜变体、pI变体和消融变体。也就是说，在任一格式下，两个单体的Fc结构域可以包括倾斜变体例如，一组如图3和图8所示出的氨基酸取代，任选地消融变体包含图5中示出的那些变体，并且包括Fab侧例如，重链恒定结构域的单体包括pI变体包含图4中示出的那些变体。在一些实施例中，CTLA-4XPD-1双特异性抗体包括具有倾斜变体的Fc结构域，其中特别有用的倾斜变体选自由以下组成的群组：S364KE357Q：L368DK370S；L368DK370S：S364K；L368EK370S：S364K；T411TE360EQ362E：D401K；L368DK370S：S364KE357L；K370S：S364KE357Q；T366SL368AY407V：T366W以及T366SL368AY407VY349C：T366WS354C。在一些实施例中，CTLA-4XPD-1抗体包含倾斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体“scFv单体”，其包括带电荷scFv连接子图7的+H序列在一些实施例中是优选的、倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及与如本文所概述的检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体“Fab单体”，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及可变重结构域，所述可变重结构域与可变轻结构域构成与如本文所概述的第二检查点抑制剂结合的Fv；以及c轻链。这个实施例的具体实例利用CTLA-4Fab[CTLA-4]_H3_L0.22和PD-1scFv1G6_L1.194_H1.279，尽管序列表中的CTLA-4或PD-1Fv中的任一个可以以任何组合成对并且使用。在一些实施例中，CTLA-4XPD-1抗体包含倾斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体“scFv单体”，其包括带电荷scFv连接子图7的+H序列在一些实施例中是优选的、倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S、以及与如本文所概述的检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体“Fab单体”，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S、以及可变重结构域，所述可变重结构域与可变轻结构域构成与如本文所概述的第二检查点抑制剂结合的Fv；以及c轻链。这个实施例的具体实例利用CTLA-4Fab[CTLA-4]_H3_L0.22和PD-1scFv1G6_L1.194_H1.279，尽管序列表中的CTLA-4或PD-1Fv中的任一个可以以任何组合成对并且使用。附加实施例包含来自图37的具有CTLA-4Fab[CTLA-4]_H3_L0.22和PD-1scFv1G6_L1.194_H1.279的主链中的任一个。附加实施例包含来自图38的具有CTLA-4Fab[CTLA-4]_H3_L0.22和PD-1scFv1G6_L1.194_H1.279的主链中的任一个。在一些实施例中，对于CTLA-4XPD-1双特异性抗体，CTLA-4Fab侧的Fv选自序列表中的具有以下标识符的那些序列：[CTLA-4]_H0.25_L0；[CTLA-4]_H0.26_L0；[CTLA-4]_H0.27_L0；[CTLA-4]_H0.29_L0；[CTLA-4]_H0.38_L0；[CTLA-4]_H0.39_L0；0[CTLA-4]_H0.40_L0；[CTLA-4]_H0.70_L0；[CTLA-4]_H0_L0.22；[CTLA-4]_H2_L0；[CTLA-4]_H3.21_L0.124；[CTLA-4]_H3.21_L0.129；[CTLA-4]_H3.21_L0.132；[CTLA-4]_H3.23_L0.124；[CTLA-4]_H3.23_L0.129；[CTLA-4]_H3.23_L0.132；[CTLA-4]_H3.25_L0.124；[CTLA-4]_H3.25_L0.129；[CTLA-4]_H3.25_L0.132；[CTLA-4]_H3.4_L0.118；[CTLA-4]_H3.4_L0.119；[CTLA-4]_H3.4_L0.12；[CTLA-4]_H3.4_L0.121；[CTLA-4]_H3.4_L0.122；[CTLA-4]_H3.4_L0.123；[CTLA-4]_H3.4_L0.124；[CTLA-4]_H3.4_L0.125；[CTLA-4]_H3.4_L0.126；[CTLA-4]_H3.4_L0.127；[CTLA-4]_H3.4_L0.128；[CTLA-4]_H3.4_L0.129；[CTLA-4]_H3.4_L0.130；[CTLA-4]_H3.4_L0.131；[CTLA-4]_H3.4_L0.132；[CTLA-4]_H3.5_L2.1；[CTLA-4]_H3.5_L2.2；[CTLA-4]_H3.5_L2.3；[CTLA-4]_H3_L0；[CTLA-4]_H3_L0.22；[CTLA-4]_H3_L0.44；[CTLA-4]_H3_L0.67；以及[CTLA-4]_H3_L0.74。PD-1scFv侧的Fv选自序列表中的具有以下标识符的那些序列：1G6_H1.279_L1.194；1G6_H1.280_L1.224；1G6_L1.194_H1.279；1G6_L1.210_H1.288；以及2E9H1L1。在一些实施例中，CTLA-4XPD-1双特异性抗体选自如SEQIDNO：36167到36346和SEQIDNO：23316到23735中列出那些抗体。在一些实施例中，CTLA-4XPD-1双特异性抗体选自：XENP19738、XENP19739、XENP19741、XENP20053、XENP20066、XENP20130、XENP20146、XENP20717和XENP22836。4.LAG-3XPD-1在一些实施例中，本发明提供了双特异性异源二聚体抗体，所述双特异性异源二聚体抗体包括与人LAG-3结合的第一ABD和与人PD-1结合的第二ABD，所述第一ABD和所述第二ABD可以呈图1中所示出的任何格式。本公开的大部分涉及一种开瓶器格式，其中Fab是LAG-3侧，并且PD-1侧是scFv侧，但这对于本文中的所有实施例可以是颠倒的。在一个实施例中，LAG-3XPD-1双特异性抗体呈图1A的开瓶器格式，其中PD-1ABD是scFv。在另一个实施例中，LAG-3XPD-1双特异性抗体呈图1F的中央-scFv格式，其中LAG-3ABD是Fab组分。在另一个实施例中，LAG-3XPD-1双特异性抗体呈图1F的中央-scFv格式，其中PD-1ABD是scFv。LAG-3XPD-1双特异性抗体呈开瓶器格式或中央-scFv格式通常包含如本文中所概述的倾斜变体、pI变体和消融变体。也就是说，在任一格式下，两个单体的Fc结构域可以包括倾斜变体例如，一组如图3和图8所示出的氨基酸取代，任选地消融变体包含图5中示出的那些变体，并且包括Fab侧例如，重链恒定结构域的单体包括pI变体包含图4中示出的那些变体。在一些实施例中，LAG-3XPD-1双特异性抗体包括具有倾斜变体的Fc结构域，其中特别有用的倾斜变体选自由以下组成的群组：S364KE357Q：L368DK370S；L368DK370S：S364K；L368EK370S：S364K；T411TE360EQ362E：D401K；L368DK370S：S364KE357L；K370S：S364KE357Q；T366SL368AY407V：T366W以及T366SL368AY407VY349C：T366WS354C。在一些实施例中，LAG-3XPD-1抗体包含倾斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体“scFv单体”，其包括带电荷scFv连接子图7的+H序列在一些实施例中是优选的、倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及与如本文所概述的检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体“Fab单体”，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及可变重结构域，所述可变重结构域与可变轻结构域构成与如本文所概述的第二检查点抑制剂结合的Fv；以及c轻链。这个实施例的具体实例利用LAG-3Fab7G8_H3.30_L1.34和PD-1scFv1G6_L1.194_H1.279，尽管序列表中的LAG-3或PD-1Fv中的任一个可以以任何组合成对并且使用。在一些实施例中，LAG-3XPD-1抗体包含倾斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体“scFv单体”，其包括带电荷scFv连接子图7的+H序列在一些实施例中是优选的、倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S和与如本文所概述的检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体“Fab单体”，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S、以及可变重结构域，所述可变重结构域与可变轻结构域构成与如本文所概述的第二检查点抑制剂结合的Fv；以及c轻链。这个实施例的具体实例利用LAG-3Fab7G8_H3.30_L1.34和PD-1scFv1G6_L1.194_H1.279，尽管序列表中的LAG-3或PD-1Fv中的任一个可以以任何组合成对并且使用。附加实施例包含来自图37的具有LAG-3Fab7G8_H3.30_L1.34和PD-1scFv1G6_L1.194_H1.279的主链中的任一个。附加实施例包含来自图38的具有LAG-3Fab7G8_H3.30_L1.34和PD-1scFv1G6_L1.194_H1.279的主链中的任一个。在一些实施例中，对于LAG-3XPD-1双特异性抗体，LAG-3Fab侧的Fv选自序列表中的具有以下标识符的那些序列：2A11_H0L0；2A11_H1.125_L2.113；2A11_H1.144_L2.142；2A11_H1_L2.122；2A11_H1_L2.123；2A11_H1_L2.124；2A11_H1_L2.25；2A11_H1_L2.47；2A11_H1_L2.50；2A11_H1_L2.91；2A11_H1_L2.93；2A11_H1_L2.97；2A11_H1L1；2A11_H1L2；2A11_H2L2；2A11_H3L1；2A11_H3L2；2A11_H4L1；2A11_H4L2；7G8_H0L0；7G8_H1L1；7G8_H3.18_L1.11；7G8_H3.23_L1.11；7G8_H3.28_L1；7G8_H3.28_L1.11；7G8_H3.28_L1.13；7G8_H3.30_L1.34；7G8_H3.30_L1.34；以及7G8_H3L1。PD-1scFv侧的Fv选自序列表中的具有以下标识符的那些序列：1G6_H1.279_L1.194；1G6_H1.280_L1.224；1G6_L1.194_H1.279；1G6_L1.210_H1.288；以及2E9H1L1。在一些实施例中，LAG-3XPD-1双特异性抗体选自构建体，所述构建体包含SEQIDNO：35867到36126和SEQIDNO：23736到25133中列出那些构建体。在一些实施例中，LAG-3XPD-1双特异性抗体选自：XENP20206、XENP21582、XENP21584、XENP21588、XENP22123、XENP22124、XENP22125、XENP22604、XENP22672、XENP22847、XENP22847和XENP22849。5.TIGITXPD-1在一些实施例中，TIGITXPD-1双特异性抗体选自SEQIDNO：25134到25173中列出的那些构建体。6.TIM-3XPD-1在一些实施例中，本发明提供了双特异性异源二聚体抗体，所述双特异性异源二聚体抗体包括与人TIM-3结合的第一ABD和与人PD-1结合的第二ABD，所述第一ABD和所述第二ABD可以呈图1中所示出的任何格式。本公开的大部分涉及一种开瓶器格式，其中Fab是TIM-3侧，并且PD-1侧是scFv侧，但这对于本文中的所有实施例可以是颠倒的。在一个实施例中，TIM-3XPD-1双特异性抗体呈图1A的开瓶器格式，其中PD-1ABD是scFv。在另一个实施例中，TIM-3XPD-1双特异性抗体呈图1F的中央-scFv格式，其中TIM-3ABD是Fab组分。在另一个实施例中，TIM-3XPD-1双特异性抗体呈图1F的中央-scFv格式，其中PD-1ABD是scFv。TIM-3XPD-1双特异性抗体呈开瓶器格式或中央-scFv格式通常包含如本文中所概述的倾斜变体、pI变体和消融变体。也就是说，在任一格式下，两个单体的Fc结构域可以包括倾斜变体例如，一组如图3和图8所示出的氨基酸取代，任选地消融变体包含图5中示出的那些变体，并且包括Fab侧例如，重链恒定结构域的单体包括pI变体包含图4中示出的那些变体。在一些实施例中，TIM-3XPD-1双特异性抗体包括具有倾斜变体的Fc结构域，其中特别有用的倾斜变体选自由以下组成的群组：S364KE357Q：L368DK370S；L368DK370S：S364K；L368EK370S：S364KT411TE360EQ362E：D401K；L368DK370S：S364KE357L；K370S：S364KE357Q；T366SL368AY407V：T366W以及T366SL368AY407VY349C：T366WS354C。在一些实施例中，TIM-3XPD-1抗体包含倾斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体“scFv单体”，其包括带电荷scFv连接子图7的+H序列在一些实施例中是优选的、倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及与如本文所概述的检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体“Fab单体”，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、以及可变重结构域，所述可变重结构域与可变轻结构域构成与如本文所概述的第二检查点抑制剂结合的Fv；以及c轻链。这个实施例的具体实例利用PD-1scFv1G6_L1.194_H1.279，尽管序列表中的TIM-3或PD-1Fv中的任一个可以以任何组合成对并且使用。在一些实施例中，TIM-3XPD-1抗体包含倾斜变体、pI变体、消融变体和FcRn变体。因此，一些实施例包含开瓶器格式，所述开瓶器格式包括：a第一单体“scFv单体”，其包括带电荷scFv连接子图7的+H序列在一些实施例中是优选的、倾斜变体S364KE357Q、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S、以及与如本文所概述的检查点抑制剂结合的Fv；b第二单体“Fab单体”，其包括倾斜变体L368DK370S、pI变体N208DQ295EN384DQ418EN421D、消融变体E233PL234VL235AG236delS267K、FcRn变体M428LN434S和可变重结构域，所述可变重结构域与可变轻结构域构成与如本文所概述的第二检查点抑制剂结合的Fv；以及c轻链。这个实施例的具体实例利用PD-1scFv1G6_L1.194_H1.279，尽管序列表中的TIM-3或PD-1Fv中的任一个可以以任何组合成对并且使用。附加实施例包含来自图37的具有TIM-3Fab侧和PD-1scFv1G6_L1.194_H1.279的主链中的任一个。附加实施例包含来自图38的具有TIM-3Fab侧和PD-1scFv1G6_L1.194_H1.279的主链中的任一个。在一些实施例中，对于TIM-3Fab侧XPD-1双特异性抗体，TIM-3Fab侧的Fv选自序列表中的具有以下标识符的那些序列：1D10_H0L0；1D12_H0L0；3H3_H1_L2.1；6C8_H0L0；6D9_H0_1D12_L0；7A9H0L0；7B11_H0L0；7B11var_H0L0；以及7C2_H0L0。PD-1scFv侧的Fv选自序列表中的具有以下标识符的那些序列：1G6_H1.279L_1.194；1G6_H1.280_L1.224；1G6_L1.194_H1.279；1G6_L1.210_H1.288；以及2E9H1L1。此外，本发明的抗体包含与和本文所概述的抗原结合结构域相同的表位结合或竞争与本文所概述的抗原结合结构域结合的抗体。在一些实施例中，双特异性检查点抗体可以含有本文所概述的ABD之一和竞争与本文所概述的ABD之一结合的第二ABD。在一些实施例中，这两个ABD竞争与本文所概述的相应ABD结合。通常使用Biacore、表面等离子体共振SPR和或BLI生物双层干涉，例如八隅体测定来确定结合竞争，其中所述BLI特别用于许多实施例中。VII.有用实施例在一个实施例中，用于本发明的倾斜变体和pI变体的特定组合为T366SL368AY407V：T366W任选地包含桥接二硫化物、T366SL368AY407VY349C：T366WS354C，其中一个单体包括Q295EN384DQ418EN481D，并且另一个单体包括带正电荷的scFv连接子当所述格式包含scFv结构域时。如本领域将了解的，“杵臼结构”变体不改变pI，并且因此可以用在任一单体上。VIII.本发明的核酸本发明进一步提供了对本发明的双特异性抗体进行编码的核酸组合物或者，在“单特异性”抗体的情况下，也对那些单特异性抗体进行编码的核酸。如本领域技术人员将了解的，核酸组合物将依赖于异源二聚体蛋白的格式和支架。因此，例如，当格式需要三个氨基酸序列时，如对于除了双scFv格式之外图1所描述的所有格式，三个核酸序列可以并入一个或多个表达载体以进行表达。类似地，仅两个核酸需要一些格式例如，双scFv格式，如图1所公开的格式；再次，所述两个核酸被放入到一个或多个表达载体中。如本领域已知的，对本发明的组合物进行编码的核酸可以并入如本领域已知并且取决于用于产生本发明的异源二聚体抗体的宿主细胞的表达载体中。通常，核酸可操作地连接到任何数量的调节元件启动子、复制起点、可选择标记、核糖体结合位点、诱导剂等。表达载体可以是染色体外载体或整合载体。本发明的核酸和或表达载体然后可以转化成如本领域众所周知的任何数量的不同类型的宿主细胞，包含哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和或真菌细胞，其中哺乳动物细胞例如，CHO细胞用于许多实施例中。在一些实施例中，如果取决于格式适用的话，对每个单体进行编码的核酸和对轻链进行编码的任选核酸通常在不同或相同的启动子对照条件下各自包含在单个表达载体内。在特别用于本发明的实施例中，这两个或这三个核酸中的每一个包含在不同表达载体上。如本文所示出并且如通过引用特此并入本文的62025,931所示出的，不同的载体比可以用于驱使异源二聚体形成。也就是说，令人惊讶的是，虽然蛋白质包括比率为1：1：2的第一单体：第二单体：轻链在本文中具有包括异源二聚体抗体的三个多肽的许多实施例的情况下，但是这些不是给出最佳结果的比率。通过培养包括如本领域众所周知的一个或多个表达载体的宿主细胞来制作本发明的异源二聚体抗体。一旦产生，就执行传统抗体纯化步骤，包含离子交换色谱法步骤。如本文所讨论的，使两个单体的pI相差至少0.5可以允许通过离子交换色谱法或等电聚焦或对等电点敏感的其它方法进行分离。也就是说，包含改变每个单体的等电点pI的pI取代使得每个单体具有不同的pI并且异源二聚体也具有不同的pI，从而促进“三重F”异源二聚体等电纯化例如，阴离子交换柱、阳离子交换柱。这些取代还有助于确定和监测任何污染的双scFv-Fc和纯化后mAh同源二聚体例如，IEF凝胶、cIEF和分析型IEX柱。IX.异源二聚体检查点抗体的生物学和生物化学功能通常，本发明的双特异性检查点抗体被施用给患有癌症的患者，并且以如本文所描述的多种方式对功效进行评估。因此，在可以进行标准功效测定时，如癌症负载、肿瘤大小、对存在或转移程度的评估等，可以也可以基于免疫状态评估来估计免疫肿瘤学治疗。这可以以多种方式进行，包含体外和体内测定两者。例如，可以进行免疫状态改变评估例如，ipi治疗之后ICOS+CD4+T细胞的存在与“老式”测量，如肿瘤负荷、大小、侵袭性、LN参与、转移等。因此，可以评估以下中的任一个或全部：检查点对CD4+T细胞活化或增殖、CD8+TCTL细胞活化或增殖、CD8+T细胞介导的细胞毒活性和或CTL介导的细胞衰竭、NK细胞活性和NK介导的细胞衰竭的抑制作用、检查点对Treg细胞分化和增殖和Treg衍生或髓样衍生遏制细胞MDSC介导的免疫遏制或免疫耐受的增强作用、和或检查点对通过免疫细胞产生的促炎细胞因子的作用，例如通过T细胞或其它免疫细胞产生的IL-2、IFN-γ或TNF-α。在一些实施例中，通过使用例如CFSE稀释方法、免疫效应细胞的Ki67细胞内染色和3H-胸腺嘧啶核苷掺入法评估免疫细胞增殖来进行治疗估计。在一些实施例中，通过评估基因表达增加或活化相关标志物的增加的蛋白质水平来进行治疗估计，包含以下中的一个或多个：CD25、CD69、CD137、ICOS、PD1、GITR、0X40、以及通过CD107A的表面表达测量的细胞脱颗粒。通常，如本领域已知的，进行基因表达测定。通常，如本领域已知的，还类似地进行蛋白质表达测量。在一些实施例中，通过评估各种细胞参数如酶活性包含蛋白酶活性、细胞膜渗透性、细胞粘附、ATP产生、辅酶产生和核苷酸摄取活性来估计通过靶细胞活力检测测量的细胞毒活性进行治疗估计。这些测定的具体实例包含但不限于TrypanBlue或PI染色、51Cr或35S释放方法、LDH活性、MTT和或WST测定、钙黄绿素-AM测定、发光基测定以及其它测定。在一些实施例中，通过估计由细胞因子产生测量的T细胞活性、使用包含但不限于IFNγ、TNFα、GM-CSF、IL2、IL6、IL4、IL5、IL10、IL13的细胞因子在培养上清液中进行细胞内测量来使用众所周知的技术进行治疗估计。因此，可以使用评估以下中的一种或多种的测定法来评估治疗：i免疫应答增加；iiαβ和或γδT细胞的活化增加；iii细胞毒性T细胞活性增加；ivNK和或NKT细胞活性增加；vαβ和或γδT细胞遏制缓解；vi促炎细胞因子分泌增加；viiIL-2分泌增加；viii干扰素-γ产生增加；ixTh1应答增加；xTh2应答减少；xi调节T细胞Tregs.和细胞中的至少一种的细胞数目和或活性减少。用于测量功效的测定在一些实施例中，使用如本领域已知的混合淋巴细胞反应MLR测定来估计T细胞活化。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过不同因素的磷酸化或去磷酸化测量或通过其它转译后修饰测量的免疫应答。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物如例如CD137、CD107a、PD1等的表达测量的αβ和或γδT细胞的活化。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过直接杀伤靶细胞如例如癌细胞或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物如例如CD137、CD107a、PD1等的表达测量的毒性T细胞活性。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过直接杀伤靶细胞如例如癌细胞或通过细胞因子分泌或通过改变活化标志物如例如CD107a等的表达测量的NK和或NKT细胞活性。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物如例如CD137、CD107a、PD1等的表达测量的αβ和或γδT细胞遏制。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于多珠方法或通过胞内染色和FACS分析或通过Alispot等测量的促炎性细胞因子分泌。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于多珠方法或通过胞内染色和FACS分析或通过Alispot等测量的IL-2分泌。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于多珠方法或通过胞内染色和FACS分析或通过Alispot等测量的干扰素-γ产生。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过细胞因子分泌或通过改变活化标志物的表达测量的Thl应答。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过细胞因子分泌或通过改变活化标志物的表达测量的Th2应答。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过流式细胞术或通过IHC测量的调节T细胞Tregs之一的细胞数量和或活性。应答减少指示免疫刺激活性。下文概述的适当的减少与增加相同。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过流式细胞术或通过IHC测量的M2巨噬细胞数量。应答减少指示免疫刺激活性。下文概述的适当的减少与增加相同。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过细胞因子分泌或通过改变活化标志物的表达测量的M2巨噬细胞促致癌基因活性。应答减少指示免疫刺激活性。下文概述的适当的减少与增加相同。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过流式细胞术或通过IHC测量的N2中性粒细胞增加。应答减少指示免疫刺激活性。下文概述的适当的减少与增加相同。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过细胞因子分泌或通过改变活化标志物的表达测量的N2中性粒细胞促致癌基因活性。应答减少指示免疫刺激活性。下文概述的适当的减少与增加相同。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物如例如CD137、CD107a、PD1等的表达测量的对T细胞活化的抑制。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过直接杀伤靶细胞如例如癌细胞或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物如例如CD137、CD107a、PD1等的表达测量的对CTL活化的抑制。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过改变活化标志物的表达测量的αβ和或γδT细胞耗竭。应答减少指示免疫刺激活性。下文概述的适当的减少与增加相同。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物如例如CD137、CD107a、PD1等的表达测量的αβ和或γδT细胞应答。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物如例如CD45RA、CCR7等的表达测量的对抗原特异性记忆应答的刺激。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过细胞毒性测定如例如MTT、Cr释放、钙黄绿素AM或通过基于流式细胞术测定如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等测量的癌细胞的凋亡或裂解。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过细胞毒性测定如例如MTT、Cr释放、钙黄绿素AM或通过基于流式细胞术测定如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等测量的对癌细胞的细胞毒性效应或细胞生长抑制效应的刺激。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过细胞毒性测定如例如MTT、Cr释放、钙黄绿素AM或通过基于流式细胞术测定如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等测量的对癌细胞的直接杀伤。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物的表达测量的Th17活性。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。在一个实施例中，信号传导途径测定测量增加或减少如例如通过细胞毒性测定如例如MTT、Cr释放、钙黄绿素AM或通过基于流式细胞术测定如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等测量的对补体依赖性细胞毒性和或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的诱导。活性增加指示免疫刺激活性。下文概述了活性适当增加。在一个实施例中，例如通过直接杀伤靶细胞如例如癌细胞或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物如例如CD137、CD107a、PD1等的表达来测量T细胞活化。对于T细胞，增殖、活化的细胞表面标志物例如，CD25、CD69、CD137、PD1、细胞毒性杀伤靶细胞的能力、以及细胞因子产生例如，IL-2、IL-4、IL-6、IFNγ、TNF-a、IL-10、IL-17A的增加将指示将与增强的癌细胞杀伤一致的免疫调节。在一个实施例中，例如通过直接杀伤靶细胞如例如癌细胞或通过细胞因子分泌或通过改变活化标志物如例如CD107a等的表达来测量NK细胞活化。对于NK细胞，增殖、细胞毒性杀伤靶细胞和增加CD107a、颗粒酶以及进行表达的能力、细胞因子产生例如，IFNγ和TNF、以及细胞表面受体表达例如，CD25的增加将指示将与增强的癌细胞杀伤一致的免疫调节。在一个实施例中，例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过改变活化标志物的表达来测量γδT细胞活化。在一个实施例中，例如通过细胞因子分泌或通过改变活化标志物的表达来测量Th1细胞活化。活性或应答的适当增加或减少，如上文所概述的视情况而定比参考样本或对照样本例如不含有本发明的抗体的测试样本中的信号增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％到99％。类似地，与参考样本或对照样本相比增加至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍示出了功效。X.治疗一旦制成，在与本发明的双特异性检查点抗体结合的情况下，通过治疗癌症、通常通过抑制对T细胞活化的遏制例如，T细胞不再遏制，本发明的组合物可以用于许多肿瘤学应用。因此，本发明的异源二聚体组合物可以用于治疗这些癌症。XI.组合疗法在一些实施例中，当双特异性检查点不包含抗PD-1抗原结合结构域时，双特异性抗体可以与单独的抗PD-1抗体如派姆单抗或纳武单抗共同施用。如本领域技术人员将了解的，共同施用可以同时或依次进行。也就是说，本文公开的CTLA-4XLAG-3双特异性检查点抗体或如并入来自序列表的抗LAG-3序列和抗CTLA-4序列的那些抗体中的任一个、以及具体地XENP22602、XENP22675、XENP22841或XENP22843可以与抗PD-1抗体共同施用。类似地，本文公开的BTLAXCTLA-4双特异性检查点或如并入来自序列表的抗BTLA序列和抗CTLA-4序列的那些抗体中的任一个可以与抗PD-1抗体共同施用。CTLA-4XTIM-3双特异性检查点抗体如并入来自序列表的抗TIM-3序列和抗CTLA-4序列的那些抗体中的任一个可以与抗PD-1抗体共同施用。CTLA-4和TIGIT双特异性检查点抗体如并入来自序列表的抗CTLA-4序列和抗TIGIT序列的那些抗体中的任一个可以与抗PD-1抗体共同施用。TIM-3和LAG-3双特异性检查点抗体如并入来自序列表的抗TIM-3序列和抗LAG-3序列的那些抗体中的任一个可以与抗PD-1抗体共同施用。TIM-3和TIGIT双特异性检查点抗体如并入来自序列表的抗TIM-3序列和抗TIGIT序列的那些抗体中的任一个可以与抗PD-1抗体共同施用。TIM-3和BTLA双特异性检查点抗体如并入来自序列表的抗TIM-3序列和抗BTLA序列的那些抗体中的任一个可以与抗PD-1抗体共同施用。LAG-3和TIGIT双特异性检查点抗体如并入来自序列表的抗LAG-3序列和抗TIGIT序列的那些抗体中的任一个可以与抗PD-1抗体共同施用。LAG-3和BTLA双特异性检查点抗体如并入来自序列表的抗LAG-3序列和抗BTLA序列的那些抗体中的任一个可以与抗PD-1抗体共同施用。TIGIT和BTLA双特异性检查点抗体如并入来自序列表的抗TIGIT序列和抗BTLA序列的那些抗体中的任一个可以与抗PD-1抗体共同施用。XII.体内施用的抗体组合物通过将具有期望程度的纯度的抗体与任选的药学上可接受的呈冻干配制品或水性溶液的形式的载剂、赋形剂或稳定剂如《雷明顿药物科学Remington′sPharmaceuticalSciences》，第16版，Osol，A.编辑[1980]中所概述的进行混合来制备根据本发明使用的抗体的配制品以供储存。可接受的载剂、缓冲剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包含缓冲剂如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚；低分子量少于约10个残基的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；金属络合物例如，Zn-蛋白络合物；和或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇PEG。施用方式根据已知方法如作为大丸剂静脉内施用或通过连续注射一段时间将本发明的抗体和化疗剂施用给受试者。治疗方式在本发明的方法中，用疗法来提供对疾病或病症的阳性治疗应答。“阳性治疗应答”旨在改善疾病或病症和或改善与疾病或病症相关联的症状。例如，阳性治疗应答将指对疾病的以下改善中的一种或多种：1减少赘生性细胞的数量；2增加赘生性细胞死亡；3抑制赘生性细胞存活；5抑制即减慢到某种程度并且优选停止肿瘤生长；6增加患者存活率；以及7与疾病或病症相关联的一个或多个症状的一些缓解。可以通过对那个疾病或病症具有特异性的标惟化应答标惟来确定任何给定疾病或病症的阳性治疗应答。可以使用筛选技术如磁共振成像MRI扫描、x-射线成像、计算机断层CT扫描、骨扫描成像、内窥镜检查和肿瘤活检取样，包含骨髓吸出BMA和对循环中的肿瘤细胞计数来估计针对肿瘤形态即总体肿瘤负荷、肿瘤大小等改变的肿瘤应答。除了这些阳性治疗应答之外，正经受疗法的受试者可能经历与疾病相关联的症状的改善的有益效果。根据本发明的治疗包含所使用的“治疗有效量的”药物。“治疗有效量”是指以剂量计并且持续所需的时间段以实现所希望的治疗结果的有效的量。治疗有效量可以根据因素而变化，如个体的疾病状态、年龄、性别、以及体重、以及药物在个体中引发希望的应答的能力。治疗有效量也指抗体或抗体部分的治疗有益效果超过其任何毒性或有害效果的量。肿瘤疗法的“治疗有效量”还可以通过其稳定疾病的进展的能力测量。可以在预示人类肿瘤的功效的动物模型系统中评估化合物抑制癌症的能力。可替代地，通过熟练的从业者已知的体外测定，组合物的这种特性可以通过检验化合物抑制肿瘤生长或诱导凋亡的能力来评估。治疗有效量的治疗化合物能减小肿瘤大小或以其它方式减轻受试者的症状。本领域的普通技术人员将能够基于如受试者的大小、受试者症状的严重程度和特定的组合物或所选择的施用途径这种因素确定这种量。调整剂量方案以提供最佳的期望应答例如，治疗应答。例如，可以施用单个大丸剂，可以随时间推移施用若干分次剂量，或者可以按治疗状况的紧急情况所指出的成比例地减少或增加剂量。为了方便施用和剂量的均匀性，肠胃外组合物可以按剂量单位配制。如本文使用的剂量单位是指作为针对待治疗受试者的单一剂量适合的物理上离散的单位；每个单位含有与所需药物载体缔合的、经计算产生所希望的治疗效果的预定量的活性化合物。针对本发明的剂量单位形式的规格受制于并直接取决于：a活性化合物的独特特性和待实现的特定治疗效果，和b个体敏感性对复合用于治疗的此类活性化合物造成的本领域固有限制。用于本发明的双特异性抗体的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症并且可以由本领域技术人员确定。用于本发明的双特异性抗体的治疗有效量的示例性非限制性范围为0.1mgkg到100mgkg。所有引用的参考文献通过引用以其全部内容明确地并入本文。尽管出于说明的目的已经在上文描述了本发明的具体实施例，但是本领域技术人员将了解的是，在不脱离如所附权利要求所描述的本发明的情况下可以做出许多细节变化。实例下文提供的实例旨在说明本发明。这些实例并非意在将本发明约束到任何具体应用或操作理论。对于本发明所讨论的所有恒定区位置，编号是根据如Kabat的EU索引的Kabat等人，1991，《免疫学上感兴趣的蛋白质序列SequencesofProteinsofImmunologicalInterest》，第5版，美国公共卫生署UnitedStatesPublicHealthService，国立卫生研究院NationalInstituteofHealth，贝塞斯达Bethesda，马里兰州，其通过引用以其全部内容并入本文。抗体领域的技术人员将了解，这种转化由免疫球蛋白序列的特异性区域的无序编号组成，从而使能够标准化参考免疫球蛋白家族的保守位置。因此，如由EU索引限定的任何给定免疫球蛋白的位置将不一定对应于其顺序序列。美国公开20150307629、20140288275和WO2014145806中概述了通用和特定科学技术，所有所述公开通过引用以其全部内容明确地并入并且特别用于在此概述的技术。A.实例1：来自多种癌症类型的TIL共同表达免疫检查点受体[514]为了研究PD-1、CTLA-4、LAG-3与BTLA之间的潜在关联性，来自癌症基因组图谱TCGA的RNA测序数据用于分析。从FireBrowsehttp：firebrowse.org下载V2RSEM数据。使用R与定制程序一起进行分析。图66中描述了PD-1与CTLA-4表达之间的相关性与所计算的R2值图1；Pearson相关系数的平方。图66进一步示出了PD-1和LAG-3表达、PD-1和BTLA表达与LAG-3和CTLA-4表达之间的相关性。图44示出在包含膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、黑素瘤癌、卵巢癌和肺癌的癌症中共同表达的PD-1和CTLA-4，示出在包含膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺腺癌、肺鳞癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、黑素瘤癌的癌症中共同表达的组PD-1和CTLA-4、PD-1和LAG-3、PD-1和BTLA、以及LAG-3和CTLA-4。B.实例2：双特异性免疫检查点抗体优于单特异性免疫检查点抗体产生原型免疫检查点抗体例如，纳武单抗和伊匹单抗和基于原型抗体的双特异性免疫检查点抗体以证明双检查点阻断的效应。除非另有说明，否则本文中的双特异性首先使用Fab变体可变区命名，并且其次使用scFv可变区命名。序列表中列出了原型抗体的氨基酸序列。对重链和轻链进行编码的DNA通过基因合成BlueHeronBiotechnology，博塞尔，华盛顿州生成、使用标准分子生物技术亚克隆成含有二价或双特异性恒定区的表达载体pTT5、并且在HEK293E细胞中瞬时转染。通过蛋白A层析以及针对双特异性抗体的阳离子交换色谱法纯化抗体。通过尺寸排阻色谱法、阴离子交换色谱法和毛细管等电聚焦来估计纯度。1.双特异性免疫检查点抗体选择性地占据双阳性细胞选择性地靶向相对于表达单个免疫检查点受体的非肿瘤反应性T细胞的表达多个免疫检查点受体的如实例1中所示出的肿瘤反应性TIL将增强抗肿瘤活性，同时避免周围毒性如图42所描绘的。SEB刺激的PBMC测定用于研究双特异性免疫检查点抗体与T细胞的结合。SEB刺激的PBMC测定是用于测定T辅助TH细胞增殖和用于生成细胞毒性T淋巴细胞CTL群的体外方法。当用葡萄球菌肠毒素BSEB刺激PBMC时，TH细胞群扩增，随后CTL群扩增。用100ngmLSEB刺激PBMC3天，然后在4℃下用原型抗LAG-3x抗PD-1双特异性抗体和阴性对照物Numax二价处理30分钟。处理之后，在4℃下用APC标记的单臂抗LAG-3抗体、FITC标记的单臂抗PD-1抗体和BV605标记的抗CD3抗体孵育细胞30分钟。图67中描绘了CD3+T的散点图。数据示出，抗LAG-3x抗PD-1双特异性选择性地占据表达PD-1和LAG-3两者的双阳性细胞，这表明双特异性免疫检查点抗体选择性地靶向表达多个检查点受体的T细胞。2.抗CTLA-4x抗PD-1双特异性增强混合淋巴细胞反应中的IL-2应答在混合淋巴细胞反应也被称为混合白血球反应或MLR中测试原型免疫检查点抗体XENP16432纳武单抗和XENP16433伊匹单抗、基于纳武单抗和伊匹单抗的双特异性免疫检查点抗体XENP16004、以及单臂双特异性、单价组合对照物。MLR是用于测定T辅助TH细胞增殖和用于生成细胞毒性T淋巴细胞CTL群的另一种体外方法。当同种异体不同的MHC单倍型淋巴细胞一起培养时，TH细胞群扩增，随后CTL群扩增。白介素-2IL-2分泌用于监测T细胞活化。使用Ficoll-PaqueTMPlus密度梯度从不同的匿名健康志愿者HemaCare，VanNuys，加利福尼亚州的白细胞除去法中纯化不同组的人PBMC。将来自两个供体的PBMC混合并且然后使用20pgmL的所示测试品对其进行处理。收集上清液，并且使用IL-2ELISA测量IL-2的浓度，并且所示出的数据描绘了一些抗CTLA-4Fab筛选的结果。这描绘了Fab和scFv实施例的XENP编码、vh和vl工程化结构域的名称、通过八隅体测量的人和食蟹猴CTLA-4的KD结合常数、以及scFv和Fab的Tm。另外，与至少一个人VH或VL种系精确匹配的多个序列9聚体被描绘成Fab和scFv的可变区的人源性的量度。图25A.对于每栏，每个数据点是与不同的供体-供体组合的单独反应。数据示出，与单独的纳武单抗和伊匹单抗相比，原型抗PD-1x抗CTLA-4双特异性抗体更大程度上增强了IL-2应答。值得注意的是，单臂组合单独添加每个双特异性单价臂不如抗PD-1x抗CTLA-4双特异性，这表明双特异性与双阳性PD-1+CTLA-4+细胞的更亲和结合，这与图67中描绘的针对抗LAG-3x抗PD-1双特异性抗体的发现一致。3.附加双特异性免疫检查点抗体增强混合淋巴细胞反应中的IL-2应答在如上文所描述的MLR测定中测试针对附加免疫检查点受体的附加原型免疫检查点抗体和双特异性免疫检查点抗体。创建了两组MLR，其中20个供体靶向1个受体供体，并且另一组20个供体靶向另一1个受体供体，总计40个MLR反应。用20μgmL的所示测试品孵育反应6天。图32中示出了描绘与用抗PD-1二价抗体XENP16432处理相比，用所示测试品处理后IL-2和IFNγ的倍数增加如通过ELISA所测定的数据。数据示出附加双特异性免疫检查点抗体也优于单独活化T细胞的纳武单抗。4.三重免疫检查点阻断-抗PD-1二价和抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性抗体在增强SEB刺激的PBMC测定中的IL-2应答方面是协同的假设三重免疫检查点阻断如图43所描绘的抗PD-1二价和抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性将在增强T细胞活化方面提供额外益处。为了测试假设，在SEB刺激的PBMC测定中测试原型免疫检查点抗体XENP16432纳武单抗、基于25F7和伊匹单抗的原型双特异性抗LAG-3x抗CTLA-4免疫检查点抗体XENP16430、以及XENP16432和XENP16430的组合。用具有20pgmL的所示测试品的10ngml的SEB刺激来自多个供体的人PBMC72小时。处理之后，通过ELISA来测定细胞上清液的IL-2。图33中的数据示出IL-2相对于Numax二价抗体的倍数增加。每个点指示以技术单线态表示的供体。数据示出抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性检查点抗体XENP16430单独增强相对于对照物Numax二价的IL-2应答，尽管增强低于单独的纳武单抗XENP16432。然而，与纳武单抗组合的抗CTLA-4x抗LAG-3双特异性导致IL-2应答比单独的任一者显著更高。5.检查点受体配体相互作用的阻断对T细胞活化是必需的使用八隅体、基于生物双层干涉BLI的方法来筛选原型抗BTLA抗体4A7、E8D9和8D5阻断BTLA与其配体HVEM相互作用的能力。八隅体的实验步骤通常包含以下：固定将配体或测试品捕获到生物传感器上；关联将配体或测试品涂覆的生物传感器浸渍到含有相应测试品或配体的连续稀释液的孔中；以及离解将生物传感器返回到含有缓冲剂的孔中以确定测试品的单价亲和力。仅含有缓冲剂的参考孔也包含在用于在数据处理期间进行背景校正的方法中。孵育500nM的每种抗BTLA抗体和100nM的BTLA-Fc超过一个小时。Anti-Penta-HISHISIK生物传感器用于捕获HVEM-Fc-His并且然后浸渍到抗体BTLA混合物中以测量残留BTLAHVEM结合。如图35B所描绘的，8D5不阻断BTLAHVEM相互作用，而4A7和E8D9阻断BTLAHVEM相互作用。在SEB刺激的PBMC测定中测试原型抗BTLA抗体和基于原型抗体的具有抗BTLAFab臂的抗BTLAx抗PD-1双特异性抗体。具体地，用具有20pgmL的所示测试品的20ngmL的SEB刺激人PBMC72小时。处理之后，通过ELISA来测定细胞上清液的IL-2。图35A中的数据示出IL-2相对于Numax二价抗体的倍数增加每个点表示以单线态测试的单独PBMC供体。数据示出双特异性抗体，其中不阻断8D5抗BTLAFab臂诱导的IL-2显著少于纳武单抗，这指示阻断BTLAHVEM相互作用对增强T细胞活化是必需的。6.双特异性免疫检查点抗体增强人PBMC移植的NSG小鼠中的移植和疾病活性在对NSGNOD-SCID-γ免疫缺陷小鼠进行的移植物抗宿主病GVHD模型中评估双特异性检查点抗体。当用人PBMC注射NSG小鼠时，人PBMC产生针对小鼠细胞的自身免疫应答。用人PBMC注射NSG小鼠、随后用免疫检查点抑制剂进行治疗抑制了移植的T细胞并且增强了移植。1千万人PBMC在第0天通过IV-OSP移植到NSG小鼠中，随后在第1天用所示测试品5mgkg或如所指示的给药。在第14天测量到CD45+事件图34。虽然可以直接测量GVHD，但是增加的CD45+细胞水平与减少的体重相关描绘了通过以下来增强IL-2释放的混合淋巴细胞反应：单独的纳武单抗抗PD-1单克隆抗体，作为销售、单独的伊匹单抗抗CTLA-4单克隆抗体，作为销售、基于纳武单抗和伊匹单抗臂的原型抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体、以及“单臂”组合对照物。图26B并且预言疾病。数据示出，本发明的双特异性检查点抗体增强CD45+细胞在相对于对照物PBS+PBMC的人PBMC移植的NSG小鼠中增殖。进一步地，此增强大于单独利用纳武单抗XENP16432所看到的增强。此外，与纳武单抗组合的抗CTLA-4x抗LAG-3双特异性XENP16430产生与实例2D中的数据一致的最高移植水平。C.实例3：杂交瘤1.杂交瘤产生为了产生针对本发明的双特异性免疫检查点抗体的PD-1、LAG-3和BTLA靶向臂，首先通过ImmunoPrecise、通过其标准方法或快速灌注方法由杂交瘤技术产生单克隆抗体。对于标准方法，一种或多种抗原被注入到3BALBc小鼠中。在处死用于杂交瘤产生之前的7天到10天，免疫的小鼠接收抗原加强免疫。通过ELISA评估针对抗原的抗体滴度，并且选择最好应答的小鼠进行融合。融合前4天给出最终抗原加强免疫。集中、纯化来自小鼠的淋巴细胞，然后与SP20骨髓瘤细胞融合。使融合的细胞在HAT选择性单步式克隆培养基上生成10天到12天，在此时间点，准备筛选杂交瘤。对于快速灌注方法，一种或多种抗原被注入到3BALBc小鼠中。19天后，集中、纯化来自所有小鼠的淋巴细胞，然后与SP20骨髓瘤细胞融合。使融合的细胞在HAT选择性单步式克隆培养基上生成10天到12天，在此时间点，准备筛选杂交瘤。对于抗PD-1杂交瘤的产生，使用了标准方法和快速灌注方法，并且所使用的一种或多种抗原是人PD-1的小鼠Fc融合huPD-1-mFc、食蟹猴PD-1的小鼠Fc融合cynoPD-1-mFc、His标记的人PD-1huPD-1-His、His标记的食蟹猴PD-1cynoPD-1-His或其混合物。对于抗BTLA杂交瘤的产生，使用了标准方法和快速灌注方法，并且所使用的抗原是人BTLA的小鼠Fc融合huBTLA-mFc、食蟹猴BTLA的小鼠Fc融合cynoBTLA-mFc、His标记的人BTLAhuBTLA-His或huBTLA-mFc和cynoBTLA-mFc的混合物。对于抗LAG-3杂交瘤的产生，使用了快速灌注方法，并且所使用的抗原是人LAG-3的小鼠Fc融合huLAG-3-mFc、食蟹猴LAG-3的小鼠Fc融合cynoLAG-3-mFc、His标记的人LAG-3huLAG-3-His、huLAG-3-mFc和cynoLAG-3-mFc的混合物或huLAG-3-His和cynoLAG-3-His的混合物。对于抗TIM-3杂交瘤的产生，使用了标准方法和快速灌注方法，并且所使用的一种或多种抗原是人TIM-3的小鼠Fc融合huTIM-3-mFc、食蟹猴TIM-3的小鼠Fc融合cynoTIM-3-mFc、His标记的人TIM-3huTIM-3-His、His标记的食蟹猴TIM-3cynoTIM-3-His或其混合物。2.筛选抗PD-1杂交瘤克隆使用八隅体使如上文所描述的产生的抗PD-1杂交瘤克隆经受两轮筛选。对于第一轮，在浸渍到500nM的二价人和食蟹猴PD-1-Fc-His的情况下，抗小鼠FcAMC生物传感器用于捕获克隆。对于第二轮，在第一轮中鉴定的对人和食蟹猴PD-1两者呈阳性的克隆被捕获到AMC生物传感器上并且浸渍到500nM单价人和食蟹猴PD-1-His中。示例性抗PD-1抗体的序列在序列表中。3.筛选抗BTLA杂交瘤克隆使用八隅体使如上文所描述的产生的抗BTLA杂交瘤克隆经受两轮筛选。对于第一轮，在浸渍到多种浓度的人和食蟹猴BTLA-His的情况下，AMC生物传感器用于捕获克隆以确定KD。对于第二轮，阻断测定用于鉴定阻断BTLAHVEM相互作用的克隆。Anti-Penta-HISHISIK生物传感器用于捕获HVEM-Fc-His并且单独浸渍到杂交瘤样本的25nMBTLA-Fc或25nMBTLA-F+1：1稀释液中以测量残留BTLAHVEM结合。示例性抗BTLA抗体的序列在序列表中。4.筛选抗LAG-3杂交瘤克隆使如上文所描述的产生的抗LAG-3杂交瘤克隆经受若干轮筛选以鉴定具有高亲和力的克隆，所述克隆阻断LAG-3与同源性地表达MHC-II的Ramos细胞结合并且结合与25F7mAh不同的表位。使用八隅体确定亲和力。在浸渍到单浓度的人LAG-3-Fc和食蟹猴LAG-3-Fc的情况下，AMC生物传感器用于捕获克隆。为了鉴定阻断LAG-3MHC-II相互作用的克隆，将10μL中的1μg人LAG-3-hIg与50μL杂交瘤上清液在RPMI培养基中用10％FBS进行2倍稀释8次在室温下混合20分钟。加入40μLDaudi或Ramos细胞所述细胞内源地表达MHC-II并在4℃下孵育30分钟。然后洗涤细胞并用抗人-Fc-A0exa647第二抗体孵育30分钟。然后洗涤细胞并针对Alexa647通过FACS进行分析。图62中描绘了数据。为了鉴定结合与25F7mAh不同的表位的克隆，在浸渍到具有500nM25F7的100nM人LAG-3-hFc或100nMLAG-3-hFc的情况下，AMC生物传感器用于捕获克隆以测量残留结合。示例性抗LAG-3抗体的序列在序列表中。5.筛选抗TIM-3杂交瘤克隆使如上文所描述的产生的抗TIM-3杂交瘤克隆经受两轮筛选。第一轮被分成筛选IgG样本和IgM克隆。对于IgG克隆，AMC生物传感器用于捕获克隆并且浸渍到多种浓度的人和食蟹猴TIM-3-His中。对于IgG克隆，使用AR2G将抗IgMmAb偶联到生物传感器中，所述生物传感器被浸渍到多种浓度的人和食蟹猴TIM-3-His中。IgM样本都不产生比基线高的结合信号。第一轮筛选之后，用二价版本的二价人和食蟹猴TIM-3-Fc重新筛选结合人和食蟹猴TIM-3两者的IgG克隆。示例性抗TIM-3抗体的序列在序列表中。在SEB刺激的PBMC测定中，嵌合并估计细胞结合的若干克隆。用100ngmLSEB刺激人PBMC3天。刺激之后，在4度下用所示测试品处理细胞30分钟。用抗人Fc第二抗体检测CD3+细胞上的结合，并且图21中描绘了所述结合。6.衍生自杂交瘤的组分抗体结构域阻断检查点受体配体相互作用如实例2E中所描述的，检查点受体配体相互作用的阻断对T细胞活化是必需的。使用细胞结合测定或如图表中所描绘的八隅体研究包括衍生自杂交瘤的结构域的示例性抗体的阻断能力示出本文中提供的主题抗体的组分抗体结构域能够阻断检查点受体配体相互作用。具体地说，包括1G6抗PD-1scFv臂的双特异性抗体能够阻断PD-1PD-L1相互作用和PD-1PD-L2相互作用；7G8抗LAG-3单臂能够阻断LAG-3MHCII相互作用；包括示例性抗PD-1Fab臂的双特异性抗体能够阻断CTLA-4CD80相互作用和CTLA-4CD86相互作用；并且包括9C6抗BTLAFab臂的双特异性抗体能够阻断BTLAHVEM相互作用。图68.用XENP20717孵育外源性地表达PD-1的HEK293T防止通过PD-L1和PD-L2以剂量依赖性方式与PD-1结合。用XENP22606孵育LAG-3防止其与内源性地表达MHC-II的Daudi细胞结合。用XENP20066孵育CTLA-4防止与CD80和CD86残留结合。用XENP20895孵育BTLA防止与HVEM残留结合。D.实例4：亲和力和稳定性优化1.抗PD-1mAb1G6和2E9在用于双特异性免疫检查点抑制剂的scFv或Fab的背景下，在实例3中产生的抗PD-1杂交瘤克隆1G6和2E9被工程化为具有最佳亲和力和稳定性。首先使用字串内容优化参见例如于2010年2月2日发布的美国专利号7,657,380使克隆人源化。对重链和轻链进行编码的DNA通过基因合成BlueHeronBiotechnology，博塞尔，华盛顿州生成，并且使用标准分子生物技术亚克隆成表达载体pTT5。scFv的C-末端包含多组氨酸标签。Fv变体的文库通过标准诱变QuikChange、Stratagene、CedarCreek、Tx.以全长二价、Fab-His和或scFv-His格式构建。通过标准蛋白质A层析法纯化二价mAb，并且通过Ni-NTA层析法纯化scFv-His。序列表中列出了本发明的示例性1G6和2E9二价抗体、Fab和scFv的序列尽管已经移除针对Fab和scFv的多组氨酸标签。在初始筛选之后，组合由所关注的变体构成，并且这些组合被表达、纯化、并且重新检查其亲和力和稳定性。使用八隅体进行二价抗体的亲和力筛选。抗人FcAHC生物传感器用于捕获测试品并且浸渍在多种浓度的PD-1-His中以进行KD确定。使用差示扫描荧光测定法DSF来评估scFv-His的稳定性。使用Bio-RadCFX连接实时PCR检测系统来进行DSF实验。将蛋白质与SYPROOrange荧光染料混合并且稀释到PBS中0.2mgmL中。SYPROOrange的最终浓度为10X。在25℃下初始10分钟孵育时间段之后，使用1℃分钟的升温速率将蛋白质从25℃加热到95℃。每30秒进行荧光测量。使用仪器软件计算熔融温度Tm。图23中示出了亲和力和稳定性结果。2.抗CTLA-4mAh抗CTLA-4抗体的亲本可变区被工程化为用作各种双特异性的组分。采取两种方法来尝试鉴定具有改进特性的变体：1通过QuikChangeStratagene、CedarCreek、Tx.进行单个、两个和三个氨基酸取代；2通过DNA合成和亚克隆构建具有与替代性人种系交换的框架的再移植序列IGHV3-7、IGHV3-13、IGHV3-21、IGHV3-64、IGKV3D-20、IGKV3-15。设计、表达并纯化变体Fab和scFv。使用八隅体测量针对Fab的人和食蟹猴CTLA-4的亲和力。AHC生物传感器用于捕获人或食蟹猴CTLA-4的Fc融合并且浸渍到多种浓度的Fab测试品中以进行KD确定。使用DSF测量Fab和scFv两者的热稳定性。此外，与至少一个人VH或VL种系精确匹配的多个序列9聚体被计数成Fab和scFv的可变区的人源性的量度参见例如于2010年2月2日发布的美国专利号7,657,380。在初始筛选之后，组合由所关注的变体构成，并且这些组合被表达、纯化、并且重新检查其亲和力和稳定性。结果总结在图24中。若干变体拥有与亲本可变区的热稳定性相比增加的热稳定性，同时保持人和食蟹猴CTLA-4两者类似的亲和力。此外，鉴定针对若干变体的如由多个人种系匹配序列9聚体所测量的序列人源性增加。优选变体包含：H0.25_L0、H0.26_L0、H0.27_L0、H0.29_L0、H0.38_L0、H0.39_L0、H0.40_L0、H0.70_L0、H0_L0.22、H2_L0、H3_L0、H3_L0.22、H3_L0.67、H3_L0.74、H3_L0.44、H3.4_L0.118、H3.4_L0.119、H3.4_L0.120、H3.4_L0.121、H3.4_L0.122、H3.4_L0.123、H3.4_L0.124、H3.4_L0.125、H3.4_L0.126、H3.4_L0.127、H3.4_L0.128、H3.4_L0.129、H3.4_L0.130、H3.4_L0.131、H3.4_L0.132、H3.5_L2.1、H3.5_L2.2、H3.5_L2.3、H3.21_L0.124、H3.21_L0.129、H3.21_L0.132、H3.23_L0.124、H3.23_L0.129、H3.23_L0.132、H3.25_L0.124、H3.25_L0.129和H3.25_L0.132。3.抗BTLAmAh9C6在实例3中产生的抗BTLA杂交瘤克隆9C6被人源化和工程化为具有如由上文实例4A中总体上描述的呈二价抗体格式的最佳亲和力和稳定性。序列表中列出了本发明的示例性抗BTLA二价抗体的序列。使用八隅体进行变体二价抗体的亲和力筛选。AHC生物传感器用于捕获测试品并且浸渍到具有多种浓度的BTLA-His的孔中以进行KD确定A和B中示出抗BTLAx抗PD-1嵌合双特异性提高从SEB刺激的PBMC分泌的IFNγ。通过所示测试品用10ngmLSEB刺激PBMC3天。收集细胞上清液并通过MSD来测定所述细胞上清液中的所示分析物。A：20μgmL测试品；B：5μgmL测试品。图52。4.抗LAG-3mAb7G8和2A11在用于双特异性免疫检查点抑制剂的Fab的背景下，如上文实例4A中总体上描述的，在实例3中产生的抗LAG-3杂交瘤克隆7G8和2A11被人源化和工程化为具有最佳亲和力和稳定性。序列表中列出了本发明的示例性抗LAG-3二价抗体和Fab的序列。如上文实例4A中总体上描述的，确定变体抗LAG-3Fab的亲和力和稳定性。AMC生物传感器用于捕获人LAG-3的小鼠Fc融合并且浸渍到含有多种浓度的测试品的孔中以确定KD。图53中示出了2A11变体的结果，并且图54中示出了7G8变体的结果。进一步筛选示例性变体2A11和7G8抗LAG-3二价抗体阻断LAG-3与内源性表达MHC-II的Daudi细胞结合的能力。将1μg的LAG-3-mFc与所示浓度的mAh在室温下混合30分钟。然后添加Daudi细胞并在4℃下孵育30分钟。用抗鼠-Fc第二抗体检测LAG-3-mFc结合。图63中描绘了数据。5.抗TIM-3mAb实例3中产生的抗TIM-3杂交瘤克隆被人源化和工程化为具有如上文实例4A中总体上描述的呈二价抗体格式的最佳亲和力和稳定性。序列表中列出了本发明的示例性抗TIM-3二价抗体的序列。使用八隅体进行变体二价抗体的亲和力筛选。AHC生物传感器用于捕获测试品并且浸渍到具有多种浓度的TIM-3-His的孔中以进行KD确定如图22所示出的。在SEB刺激的PBMC测定中，还测试了T细胞结合的优化变体。用100ngmLSEB刺激人PBMC72小时。刺激之后，用所示测试品处理细胞。用抗人Fc第二抗体检测CD3+细胞上的3H3H1L2.1XENP21189结合，并且图21中描绘了所述结合。用抗人IgG-APC第二抗体检测CD3+细胞上的7B11HJ1L1.1XENP21196的结合，并且图21中描绘了所述结合。6.变体抗LAG-3x抗CTLA-4Fab-scFv双特异性抗体的亲和力筛选使用如上文总体上描述的八隅体来筛选图4D中描述的包括衍生自优化的抗LAG-3二价抗体的抗LAG-3Fab的双特异性抗体和实例4B中描述的示例性抗CTLA-4scFv的亲和力。具体地，AMC或HISIK生物传感器用于捕获人LAG-3的小鼠Fc融合或人LAG-3的His-Avi标记的TEV-Fc融合并且浸渍到含有测试品的孔中以确定KD。结果示于图55中。7.变体抗LAG-3x抗PD-1Fab-scFv双特异性抗体的亲和力筛选使用如上文总体上描述的八隅体来筛选图4D中描述的包括衍生自优化的抗LAG-3二价抗体的抗LAG-3Fab的双特异性抗体和实例4A中描述的示例性抗PD-1scFv的亲和力。具体地，AMC或HIS1K生物传感器用于捕获人LAG-3的小鼠Fc融合或人LAG-3的His-Avi标记的TEV-Fc融合并且浸渍到含有测试品的孔中以确定KD。结果示于图61中。E.实例5：在体外估计具有亲和力和稳定性优化臂的双特异性免疫检查点抗体1.抗PD-1x抗CTLA-4双特异性抗体a.双特异性抗PD-1x抗CTLA-4双特异性抗体阻断PD-1与PD-L1和PD-L2相互作用在4℃下用XENP20717抗PD-1x抗CTLA-4和单臂抗PD-1和抗CTLA-4对照物对应地XENP20111和XENP20059孵育表达PD-1的HEK293T细胞30分钟。孵育之后，添加PD-L1-mFc或PD-L2-mFc并且允许在4℃下进一步孵育30分钟。用抗鼠IgG第二抗体检测PD-L1-mFc和PD-L2-mFc。图45示出XENP20717能够阻断PD-1与配体PD-L1和PD-L2以剂量依赖性方式结合。XENP20111还能够阻断PD-1与配体PD-L1和PD-L2结合，而XENP20559不阻断PD-1与其配体结合。b.T细胞与CD3+细胞上双特异性抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体结合用500ngmLSEB刺激人PBMC3天，在培养基中洗涤两次，并且然后用500ngmLSEB重新刺激额外24小时。然后在4℃下用XENP20717抗CTLA-4x抗PD-1处理PBMC30分钟。处理之后，洗涤并在具有抗CD3-FITCUCHT1mAh的CD3+细胞上用抗人Fc-Fab片段特异性-APC第二抗体JacksonLabs孵育PBMC。然后将PBMC洗涤两次并通过流式细胞术进行分析。图45描绘了7个独特PBMC供体的平均MFI并且示出XENP20717在CD3+T细胞上的结合，并且那种结合是以剂量依赖性方式进行的。c.估计T细胞活化上的变体抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体在MLR测定中测试具有变体抗CTLA-4Fab臂的抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体。用69.5nM的二价抗体例如，纳武单抗或139nM的双特异性抗体例如，XENP16004处理混合的PBMC以得到等摩尔PD-1结合浓度。所描绘的数据描绘了一些抗CTLA-4Fab筛选的结果。这描绘了Fab和scFv实施例的XENP编码、vh和vl工程化结构域的名称、通过八隅体测量的人和食蟹猴CTLA-4的KD结合常数、以及scFv和Fab的Tm。另外，与至少一个人VH或VL种系精确匹配的多个序列9聚体被描绘成Fab和scFv的可变区的人源性的量度。图25B示出许多双特异性抗体使IL-2诱导能够优于单独的纳武单抗。在SEB刺激的PBMC测定中，用500ngmLSEB处理PBMC2天。然后洗涤细胞并用20pgmL的XENP16432纳武单抗或XENP20717和500ngmLSEB进行处理。测定上清液的作为T细胞活化的指示剂的IL-2。图69中描绘的数据示出抗CTLA-4x抗PD-1双特异性诱导IL-2释放比单独的纳武单抗更显著。在另一个研究中，在SEB刺激的PBMC测定中测试XENP16432、XENP20717和单臂组合对照物。用500ngmLSEB刺激PBMC2天。然后用PBS洗涤细胞一次，并且然后添加具有20pgmL的所示测试品和500ngmLSEB的培养基。24小时后收集上清液并测定IL-2。在没有SEB刺激的对照物实验中，在测定IL-2上清液之前，用所示测试品处理PBMC3天。图45A到图45C中描绘了IL-2浓度的倍数变化。如图45B所示出的，与纳武单抗相比，XENP20717更显著地增强IL-2分泌。数据示出，XENP20717比单独的抗PD-1二价以及单臂抗PD-1和单臂抗CTLA-4的组合两者更有效地活化T细胞，这表明选择性活化表达多个免疫检查点受体的T细胞的优点。值得注意的并且与实例2B中所描述的发现一致的是，双特异性XENP20717与衍生自XENP20717的单臂抗体的组合相比在更大程度上增强IL-2分泌。在SEB刺激的PBMC测定中测试靶向具有抗CTLA-4scFv臂和变体2E9抗PD-1Fab臂的CTLA-4和PD-1和对照测试品的附加双特异性抗体。用100ngmLSEB刺激人PBMC2天。洗涤细胞并用100ngmLSEB与20pgmL所示测试品组合进行重新刺激。处理后24小时，测定上清液的IL-2和IFNγ图19A和图19B中分别描绘的。2.在体外估计抗LAG-3x抗PD-1双特异性检查点抗体a.估计T细胞活化上的变体抗LAG-3x抗PD-1双特异性抗体在SEB刺激的PBMC测定中，用500ngmLSEB处理PBMC2天。然后洗涤细胞并用20pgmL的XENP16432纳武单抗或XENP22604和500ngmLSEB进行处理。测定上清液的作为T细胞活化的指示剂的IL-2图69中所描绘的。在SEB刺激的PBMC测定中，还估计了具有衍生自如实例4所描述的产生的变体mAb的优化的2A11抗LAG-3Fab臂的附加抗LAG-3x抗PD-1双特异性抗体的T细胞活化。用500ngml的SEB刺激来自多个供体的人PBMC2天。然后将细胞在培养基中洗涤两次并将500ngnLSEB与10pgmL所示测试品组合进行刺激。处理24小时之后，测定细胞上清液的IL-2和IFNγ。图64中的数据示出IL-2和IFNγ相对于Numax二价抗体的倍数增加。每个点指示以技术单线态表示的供体。数据示出，许多抗LAG-3x抗PD-1双特异性抗体比单独的纳武单抗或单独的抗LAG-3二价更有效地活化T细胞。3.在体外估计抗BTLAx抗PD-1双特异性检查点抗体a.T细胞与CD3+细胞上双特异性抗BTLAx抗PD-1双特异性抗体结合估计具有衍生自如实例4所描述的产生的变体mAb的优化的抗BTLAFab臂的抗BTLAx抗PD-1双特异性抗体在T细胞上的结合。用100ngmLSEB刺激人PBMC3天，在此之后，在4℃下用所示测试品处理PBMC30分钟。然后在4℃下用抗人Fc第二抗体孵育PBMC30分钟。图47示出了所示测试品在CD3+细胞上的结合。数据示出，本发明的抗PD-1x抗BTLA双特异性检查点抗体例如，XENP20895、XENP21220和XENP21221与单臂对照物例如，XENP21446和XENP16011相比更亲和地结合T细胞。这表明人T细胞通常与双特异性抗体更好地结合，每个臂单价地结合不同抗原，而不是单价单特异性抗体，如单臂对照物。b.估计T细胞活化上的变体抗BTLAx抗PD-1双特异性抗体在SEB刺激的PBMC测定中，估计具有原型抗BTLA例如，4C7、8D5和E8D9和9C6Fab臂的抗BTLAx抗PD-1双特异性抗体的T细胞活化。用具有5pgmL或20pgmL的如所指示的测试品的10ngml的SEB刺激来自多个供体的人PBMC72小时。处理之后，如图1J和图1K中分别描绘的，通过ELISA测定细胞上清液的IL-2和IFNγ。数据示出，包括9C6杂交瘤衍生的臂的双特异性抗体不仅比单独的抗PD-1二价抗体而且比具有原型抗BTLAFab臂的双特异性抗体更强地增强T细胞活化。在SEB刺激的PBMC测定中估计示例性抗BTLAx抗PD-1XENP21220和XENP16432纳武单抗。用500ngmLSEB处理PBMC2天。然后洗涤细胞并用20pgmL的XENP16432或XENP21220和500ngmLSEB进行处理。测定上清液的作为T细胞活化的指示剂的IL-2图69中所描绘的。如上文所描述的，在SEB刺激的PBMC测定中估计具有变体9C6抗BTLAFab臂和单臂变体9C6抗体单独和与单臂抗PD-1抗体组合的附加抗BTLAx抗PD-1双特异性抗体的T细胞活化。图1L中的数据示出IL-2和IFNγ分泌相对于用PBS进行的治疗的倍数增加。4.在体外估计抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性检查点抗体a.T细胞与CD3+细胞上双特异性抗BTLAx抗PD-1双特异性抗体结合估计具有变体抗LAG-3Fab臂和单臂变体抗LAG-3抗体的抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性抗体在T细胞上的结合。用100ngmLSEB刺激人PBMC3天，在此之后，在4℃下用所示测试品处理PBMC30分钟。处理之后，在4℃下用抗CD3-FITC和抗人Fc-APC抗体孵育PBMC30分钟。然后将PBMC洗涤两次并通过流式细胞术进行分析。图56示出了所示测试品在CD3+T细胞上的结合。数据示出，本发明的许多抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性检查点抗体例如，XENP22505和XENP21896与单臂对照物例如，XENP22516相比更亲和地结合T细胞。这表明人T细胞可以与双特异性抗体更好地结合，每个臂单价地结合不同抗原，而不是单价单特异性抗体，如单臂对照物。b.通过抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性抗体进行T细胞活化在MLR和SEB刺激的PBMC测定中估计抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性抗体的T细胞活化。在存在20pgmL所示测试品的情况下进行40个MLR反应，并且在处理后6天测定细胞上清液的IL-2和IFNγ。图59描绘了IL-2和IFNγ相对于抗RSV二价抗体XENP15074的倍数诱导。在SEB刺激的PBMC测定中，用500ngmLSEB处理PBMC2天。然后洗涤细胞并用20pgmL的XENP16432纳武单抗、XENP22602或XENP16432和XENP22602的组合和500ngmLSEB进行处理。测定上清液的作为T细胞活化的指示剂的IL-2图69中所描绘的。在另一个SEB刺激的PBMC测定中，估计了附加抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性抗体。用500ngml的SEB刺激来自多个供体的人PBMC2天。然后将细胞在培养基中洗涤两次并将500ngmLSEB与20pgmL所示测试品组合进行刺激。处理24小时之后，测定细胞上清液的IL-2和IFNγ。图57和图58和图60中的数据示出IL-2和IFNγ相对于Numax二价抗体的倍数增加。每个点指示以技术单线态表示的供体。与实例2D一致的数据示出抗PD-1二价抗体与抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性抗体的组合对T细胞活化施加协同作用。进一步地，数据示出基于7G8的抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性抗体比基于2A11的抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性抗体对PBMC具有更多选择功能。F.实例6：在体内估计双特异性免疫检查点抗体1.抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体增强人PBMC移植的NSG小鼠中的移植和疾病活性在若干GVHD研究中，本发明的示例性抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体被示出为增强人PBMC移植的NSG小鼠中的移植和疾病活性。在第一个研究中，在第0天通过IV-OSP将1千万人PBMC移植到NSG小鼠中。在第1天，对小鼠给药XENP164322.89mgkg、XENP200532mgkg以及XENP16432和XENP16433的组合2.89+2.92mgkg。在第14天测量CD45+细胞计数图70中所描绘的。估计具有变体抗CTLA-4Fab和抗PD-1scFv臂的附加抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体。1千万人PBMC在第0天通过IV-OSP移植到NSG小鼠中，随后在第1天用所示测试品5mgkg或如所指示的给药。在第14天测量CD45+细胞计数图1QA、图1RA和图1S。IFNγ水平还被测量为GVHD的附加指示剂并且针对CD45+细胞水平绘制描绘了通过以下来增强IL-2释放的混合淋巴细胞反应：具有变体抗CTLA-4Fab臂和变体抗PD-1scFv臂的抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体、以及单独的纳武单抗、单独的伊匹单抗以及基于纳武单抗和伊匹单抗的原型抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体作为对照物。图27和图30。数据示出，本发明的抗PD-1x抗CTLA-4双特异性检查点抗体增强CD45+细胞在相对于对照物PBS+PBMC的人PBMC移植的NSG小鼠中增殖。进一步地，此增强大于单独利用纳武单抗XENP16432所看到的增强。图31示出测试品对研究160314图26中所呈现的与160331图29中所呈现的之间的CD45+细胞增殖的影响的比较。这两个研究一致地表明抗PD-1x抗CTLA-4双特异性检查点抗体优于单独的纳武单抗。在另一个研究中，估计了具有XtendFc的抗CTLA-4x抗PD-1双特异性抗体。对PBMC移植的小鼠给药所示浓度下的所示测试品，并且在第14天测量CD45+、CD4+和CD8+事件图20中所描绘的。2.抗BTLAx抗PD-1双特异性抗体增强人PBMC移植的NSG小鼠中的移植和疾病活性在第一个研究中，在第0天通过IV-OSP将1千万人PBMC移植到NSG小鼠中。在第1天，对小鼠给药XENP164322.89mgkg和XENP208955mgkg。在第14天测量CD45+细胞计数图70中所描绘的。在第二个GVHD研究中估计抗BTLAx抗PD-1双特异性XENP20895。1千万人PBMC在第0天通过IV-OSP移植到NSG小鼠中，随后在第1天用所示测试品在所示浓度下给药。在第10天、第14天和第22天测量CD45+细胞计数和IFNγ对应地图51中所描绘的。3.抗LAG-3x抗PD-1双特异性抗体增强人PBMC移植的NSG小鼠中的移植和疾病活性在GVHD中，在第0天通过IV-OSP将1千万人PBMC移植到NSG小鼠中。在第1天，对小鼠给药XENP164322.89mgkg和XENP226725mgkg。在第14天测量CD45+细胞计数图70中所描绘的。在实例6A中所描述的第二研究中，还估计了另一个示例性抗LAG-3x抗PD-1XENP22847图20C。4.抗LAG-3x抗CTLA-4双特异性抗体增强人PBMC移植的NSG小鼠中的移植和疾病活性在GVHD中，在第0天通过IV-OSP将1千万人PBMC移植到NSG小鼠中。在第1天，对小鼠给药XENP164322.89mgkg、XENP226755mgkg以及XENP16432和XENP22675的组合5+5mgkg。在第14天测量CD45+细胞计数图70中所描绘的。数据示出XENP22675与单独给药纳武单抗相比增强了移植和疾病活性。值得注意的是，XENP22675与纳武单抗组合协同作用以进一步增强移植。G.实例7：抗PD-1x抗CTLA-4双特异性抗体在移植有KG1A-luc癌细胞和人PBMC的NSG小鼠中具有抗肿瘤活性NODSCIDγNSG小鼠在第0天移植有KGlA-luc癌细胞。在第21天，将人PBMC移植到小鼠腹膜内。在PBMC移植之后，通过腹膜内注射每周给药所示测试品对照小鼠给药PBS。通过测量每个小鼠的总通量来使用体内成像系统LuminaIII监测肿瘤生长，并且图71中示出了数据第1次给药后的天数。XIII.引用参考来自USSN62420,500的来自权利要求组A1到A30的“抗CTLA-4”、权利要求组B1到B30的“抗PD-1”、权利要求组C1到C28的“抗LAG-3”、权利要求组D1到D28的“抗TIM-3”、权利要求组E1到E28的“抗TIGIT”、权利要求组F1到F28的“抗BTLA”、权利要求组Y1到Y5的“主链加Fv”、以及权利要求组X1到X16的“特异性分子”的权利要求组通过引用以其全部内容明确地并入。

权利要求：1.一种异源二聚体抗体，其包括：a第一重链，其包括：i第一变体Fc结构域；和ii与第一抗原结合的单链Fv区scFv，其中所述scFv区包括第一可变重结构域、第一可变轻结构域和带电荷scFv连接子，其中所述带电荷scFv连接子共价连接所述第一可变重结构域和所述可变轻结构域；和b第二重链，其包括VH-CH1-铰链-CH2-CH3单体，其中VH是第二可变重结构域，并且CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c轻链，其包括第二可变轻结构域和轻恒定结构域；其中所述第二变体Fc结构域包括氨基酸取代N208DQ295EN384DQ418EN241D，其中所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自包括氨基酸取代E233PL234VL235AG236delS267K；其中所述第一变体Fc结构域包括氨基酸取代S364KE357Q，并且所述第二变体Fc结构域包括氨基酸取代L368DK370S，其中所述第一可变重结构域和所述第一可变轻结构域选自包括以下的组：SEQIDNO：11376和SEQIDNO：11377、SEQIDNO：22970和SEQIDNO：22971、SEQIDNO：11394和SEQIDNO：11395、SEQIDNO：11367和SEQIDNO：11368、以及SEQIDNO：11412和SEQIDNO：11413，其中编号是根据如Kabat中的EU索引的。2.根据权利要求1所述的异源二聚体抗体，其中所述第二重链的CH1-铰链-CH2-CH3组分具有SEQIDNO：37725，所述第一变体Fc结构域具有SEQIDNO：37726，并且所述恒定轻结构域具有SEQIDNO：37727。3.根据权利要求1或2所述的异源二聚体抗体，其中所述第二可变重结构域和所述第二可变轻结构域形成抗原结合结构域，所述抗原结合结构域结合来自群组人CTLA-4、人LAG-3、人TIM-3和人TIGIT的人检查点受体。4.根据权利要求1、2或3所述的异源二聚体抗体，其中所述第一可变重结构域具有SEQIDNO：11394，并且所述第一可变轻结构域具有SEQIDNO：11395。5.根据权利要求1、2、3或4所述的异源二聚体抗体，其中所述第一重链具有SEQIDNO：23581，所述第二重链具有SEQIDNO：23576，并且所述轻链具有SEQIDNO：23591。6.一种核酸组合物，其对应地包括：a第一核酸，其对权利要求1到5所述的第一重链进行编码；b第二核酸，其对权利要求1到5所述的第二重链进行编码；以及c第三核酸，其对权利要求1到5所述的轻链进行编码。7.一种表达载体组合物，其包括：a第一表达载体，其包括权利要求6所述的第一核酸；b第二表达载体，其包括权利要求6所述的第二核酸；以及c第三表达载体，其包括权利要求6所述的第三核酸。8.一种宿主细胞，其包括权利要求7所述的表达载体组合物。9.一种用于制作根据权利要求1到5所述的异源二聚体抗体的方法，其包括在表达所述抗体的条件下培养根据权利要求8所述的宿主细胞，以及回收所述抗体。

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