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申请/专利权人：华中农业大学

摘要：本发明公开了一种竞争型草鱼卵泡刺激素检测试剂盒及应用。属于生物技术领域。包括：草鱼FSHβ抗体、草鱼FSHβ蛋白标准品、FSHβ示踪剂、涂板液、清洗液、阻断液、催化液、终止液、荧光检测剂A、荧光检测剂B。本发明还公开了检测方法，本发明试剂盒以生物素标记的草鱼FSHβ抗原为示踪剂，采用竞争性荧光免疫方法对草鱼FSH进行定量检测，具有更高的检测灵敏度和特异性，并且成本低，所得检测数据稳定、准确。可以检测草鱼血清、垂体裂解液或培养液等样品中的卵泡刺激素浓度，检测半效应浓度可以达到2.63ngmL，为草鱼卵泡刺激素的研究提供了有效的检测手段。

主权项：1.一种竞争型草鱼卵泡刺激素检测试剂盒，其特征在于，包括：草鱼FSHβ抗体、草鱼FSHβ蛋白标准品、FSHβ示踪剂、涂板液、清洗液、阻断液、催化液、终止液、荧光检测剂A、荧光检测剂B；所述草鱼FSHβ抗体的制备方法：1将纯化的草鱼FSHβ蛋白和PBS的质量体积比为：0.5mg：200μL，再与弗氏佐剂1：1等体积混匀乳化，对家兔进行免疫，免疫完毕后，得兔抗FSHβ多克隆抗血清；2利用蛋白AG纯化法对兔抗FSHβ多克隆抗血清进行纯化获得草鱼FSHβ抗体；草鱼FSHβ蛋白的制备方法：1利用草鱼垂体获得cDNA，进行PCR扩增得PCR产物，双酶切得FSHβ双酶切产物；2表达载体pET-28a+的构建；3将FSHβ双酶切产物与pET-28a+表达载体进行连接，得原核表达重组质粒pET-28a+-FSHβ；4将原核表达重组质粒pET-28a+-FSHβ转化BL21感受态细胞，经诱导表达、纯化获得草鱼FSHβ蛋白；步骤1所述PCR的上游引物：5’-CGGAATTCATGTCAGAATGCAGGTCCAGCTGTC-3’，如SEQIDNO.1所示；下游引物：5’-CCGCTCGAGCTAATGTACAGTGCAGCGGTAT-3’，如SEQIDNO.2所示；反应程序：94℃预变性5min；接着为36个循环，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min；反应体系：TaqDNA酶1μL，PCR反应缓冲液2μL，dNTP2μL，引物2μL，靶序列DNA1μL，双蒸水12μL，总体积20μL；步骤1PCR产物、步骤2表达载体pET-28a+分别用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切；步骤4所述诱导表达条件：28℃，0.5mMIPTG终浓度诱导表达8h；所述草鱼FSHβ抗体在试剂盒储存液中的终浓度为0.5mgmL，检测时使用稀释缓冲液稀释5000倍；所述草鱼FSHβ蛋白标准品：利用稀释缓冲液，将草鱼FSHβ蛋白稀释配置浓度为500ngmL、250ngmL、125ngmL、62.5ngmL、31.25ngmL、15.6ngmL、7.8ngmL、3.9ngmL、1.95ngmL、0.975ngmL、0.488ngmL、0ngmL；所述FSHβ示踪剂的制备方法：将草鱼FSHβ蛋白、生物素按200μg：200μL比例混合均匀，其中生物素含量9mM，再置于冰中2h，使用脱盐柱进行纯化；所述FSHβ示踪剂在试剂盒储存液中的终浓度为0.15μgmL，检测时使用稀释缓冲液稀释25000倍；涂板液：Na2CO3：1.59mgmL；NaHCO3：2.94mgmL；稀释缓冲液：Na2HPO4：1.15mgmL；NaCl：8.0mgmL；KH2PO4：0.2mgmL；KCl：0.2mgmL；BSA：1.0mgmL；Tween20：0.5μLmL；NaN3：0.5μgmL；清洗液：Na2HPO4：1.15mgmL；NaCl：8.0mgmL；KH2PO4：0.2mgmL；KCl：0.2mgmL；Tween20：0.5μLmL；阻断液：Na2HPO4：1.15mgmL；NaCl：8.0mgmL；KH2PO4：0.2mgmL；KCl：0.2mgmL；BSA：10mgmL；Tween20：0.5μlmL；催化液：Na2HPO4：1.15mgmL；NaCl：8.0mgmL；KH2PO4：0.2mgmL；KCl：0.2mgmL；BSA：1.0mgmL；SA-HRP：0.5μgmL；Tween20：0.5μLmL；Thiomersal：5μgmL；终止液：甘氨酸：1.5M；荧光检测剂A：Trisbase：0.1M；EDTA.2Na：2mM；荧光检测剂B：醋酸钠：0.1M；过硼酸钠：20mM；EDTA.2Na：2mM，HPPA：2.2M。

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