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申请/专利权人：宁夏张裕龙谕酒庄有限公司;西北农林科技大学

摘要：本发明涉及一种酿酒葡萄组培苗高效复合脱毒的方法，其属于植物病毒防治技术领域，包括以下步骤：步骤S1、携带病毒的植物材料的采集：步骤S2、将外植体消毒进行初代培养，获得无菌组培苗；步骤S3、增值生根培养：步骤S4、葡萄组培苗病毒检测：步骤S5、葡萄组培苗茎尖热处理：步骤S6、超低温脱毒：步骤S7、葡萄组培苗二次病毒检测。本发明采用热处理结合超低温脱毒技术，与传统脱毒方法相比，其脱毒效率大幅提高，可同时高效脱除不同品种的多种病毒，操作简单、快速有效，为以后的脱毒技术提供有力的参考价值，具有很好的技术效果和推广前景。

主权项：1.一种酿酒葡萄组培苗高效复合脱毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1、携带病毒的植物材料的采集：对经过病毒检测的具有病毒的植物材料进行外植体采集；步骤S2、将外植体消毒进行初代培养，获得无菌组培苗；步骤S3、增值生根培养：将步骤S2获得的无菌组培苗切取2cm以上带有2个新生芽的茎段剪下，并接种于增殖生根12MS培养基中，每隔28～30d继代一次，获得足够的组培苗，用于脱毒处理材料；步骤S4、葡萄组培苗病毒检测：利用反转录聚合酶链反应方法对步骤S3组培苗进行葡萄病毒检测；步骤S5、葡萄组培苗茎尖热处理：切取步骤S3中组培苗带叶单芽茎段，接种后在继代培养基上，25±2℃培养15天，升温至32℃预处理2d，之后升温至35℃预处理2d，然后升温至38℃热处理，处理方式为38℃光照8h+32℃黑暗8h，依次循环，热处理培养30d后，选取大小为1.0mm的腋芽茎尖进行超低温脱毒；步骤S6、超低温脱毒：在预培养培养基中遮光培养3d，经预培养基培养的茎尖在室温下用加载液处理20min，然后分别用12浓度的PVS2和PVS2在冰上处理30min和50min后，将脱水后的茎尖转入铝箔条上的PVS2小滴中，制成PVS2小滴，得到冷冻保护剂滴包裹的茎尖，转移至0.8×2.0cm的铝箔条上，将所述载有冷冻保护剂滴包裹的茎尖的铝箔条放入液氮中5min；保存后，迅速将携带茎尖的铝箔条转移至卸载液中进行解冻和卸载20min，然后将腋芽转移至恢复培养基上遮光培养24h后，正常光照下培养，再转移至后培养基上培养；步骤S7、葡萄组培苗二次病毒检测：利用反转录聚合酶链反应方法对步骤S6中组培苗进行葡萄病毒检测。

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