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申请/专利权人：浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司;浙江理工大学

摘要：本发明公开的是一种携带利用荧光基因和loxp‑CRE体系构建和包装筛选重组溶瘤痘苗病毒的方法及其应用，包括构建质粒pBATK‑EGFP、px459‑TK‑gRNA、px459‑C11R‑gRNA、px459‑B8R‑gRNA、pCDNA3.1‑loxp‑CRE；重组后获得TK基因缺失、VGF基因缺失和IFN‑γR基因缺失的溶瘤痘苗病毒VV‑ΔT、VV‑ΔV、VV‑ΔB，双基因缺失和三双基因缺失的VV‑ΔTV、VV‑ΔTB、VV‑ΔVB和VV‑ΔTVB，本发明为溶瘤痘苗病毒的包装和筛选的研究提供了新的思路和方法，能够高效构建和包装筛选新的溶瘤痘苗病毒，为溶瘤痘苗病毒的病毒特征研究提供技术基础。

主权项：1.一种携带利用荧光基因和loxp-CRE体系构建和包装筛选重组溶瘤痘苗病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：构建携带EGFP基因的质粒pBATK-EGFP，所述质粒pBATK-EGFP为从头构建质粒，其是以痘苗病毒WesternReverse株为骨架并以EGFP作为筛选的标志物；步骤2：构建携带TK-gRNA序列的质粒pX459-TK-gRNA，所述质粒pX459-TK-gRNA以CRISPRCas9质粒为模板，其携带有靶向痘苗病毒基因组TK基因的gRNA；构建携带VGF基因C11R-gRNA序列的质粒px459-C11R-gRNA；构建携带IFN-γ基因B8R-gRNA序列的质粒px459-B8R-gRNA；步骤3：构建携带loxp-CRE序列的质粒pcDNA3.1-loxp-CRE，所述质粒pcDNA3.1-loxp-CRE以pcDNA3.1为基础，插入带有loxp位点和CRE酶基因序列；步骤4：将质粒px459-TK-gRNA、质粒pBATK-EGFP转染到HEK293A细胞，并感染VV-WR溶瘤痘苗病毒，包装后分别获得所述携带EGFP基因的TK基因缺失的重组溶瘤痘苗病毒VV-ΔT-EGFP、携带EGFP基因的C11R基因缺失的重组溶瘤痘苗病毒VV-ΔV-EGFP以及携带EGFP基因的B8R基因缺失的重组溶瘤痘苗病毒VV-ΔB-EGFP；步骤5：将步骤3中所述pCDNA3.1-loxp-CRE转染到HEK293A细胞，并感染VV-ΔT-EGFP、VV-ΔV-EGFP或VV-ΔB-EGFP溶瘤痘苗病毒，包装后获得删除EGFP基因的TK基因缺失的重组溶瘤痘苗病毒VV-ΔT、VV-ΔV和VV-ΔB；步骤6：分别以步骤5获得的重组溶瘤痘苗病毒VV-ΔT、VV-ΔV和VV-ΔB为基础病毒，重复步骤4和步骤5，获得同时缺失TK和VGF、同时缺失TK和B8R和同时缺失VGF和B8R的双靶向的重组溶瘤痘苗病毒VV-ΔTV、VV-ΔVB和VV-ΔTB；步骤7：以步骤6获得的双靶向重组溶瘤痘苗病毒VV-ΔTV为基础病毒，重复步骤4和步骤5中的转染px459-B8R-gRNA和pCDNA3.1-loxp-CRE，获得三靶向的重组溶瘤痘苗病毒VV-ΔTVB。

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