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两端包含LoxP位点的表达GFP蛋白的质粒及其构建方法和应用 

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申请/专利权人:中国科学院水生生物研究所

摘要:本发明公开了两端包含LoxP位点的表达GFP蛋白的质粒及其构建方法和应用,该质粒的构建方法包括:S1:在GFP表达元件两侧设计两个不同类型的同向LoxP位点;S2:将两个不同LoxP位点分别连入正反向引物,以pEGFP‑N3质粒为模板,扩增GFP基因的表达元件,包括启动子、编码区和5′UTR区;S3:连接至pMD18‑T载体,阳性检测正确后,从插入序列外侧设计正反向引物,扩增出两端包括LoxP位点的GFP基因表达元件组合;S4:将此元件组合连入pTol2‑MCS质粒多克隆位点处,构建完成pTol2‑GFP质粒。本发明质粒转入鳜受精卵后,获得发绿色荧光的鳜转基因底盘家系,从而获得宿主基因组的定点编辑位点,适用于后续不同转基因目标家系的同塘高效筛选和构建,为鱼类基因工程育种提供帮助,极大提高鱼类遗传育种效率。

主权项:1.两端包含LoxP位点的表达GFP蛋白的质粒在基因工程育种上的应用,其特征在于,所述质粒应用于鳜转GFP基因底盘家系构建,其构建方法包括以下步骤:S1:体外转录出Tol2mRNA,将Tol2mRNA和pTol2-GFP一起显微注射入鳜胚胎,构建P0代转基因群体;S2:P0代性成熟后,与野生型亲鱼测交,筛选发绿色荧光的胚胎,即为稳定的所述鳜转GFP基因底盘家系;其中,pTol2-GFP构建方法包括以下步骤:S11:在GFP表达元件两侧设计两个不同类型的同向LoxP位点,其中,上游LoxP位点为Lox66,所述Lox66的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示,下游LoxP位点为Lox71,所述Lox71的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示;S12:将两个不同LoxP位点分别连入正反向引物,以pEGFP-N3质粒为模板,扩增GFP基因的表达元件,包括启动子、编码区和5′UTR区;所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示,所述编码区的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示,所述5′UTR区的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示;S13:连接至pMD18-T载体,阳性检测正确后,从插入序列外侧设计正反向引物,扩增出两端包括LoxP位点的GFP基因表达元件组合;S14:将此元件组合连入pTol2-MCS质粒多克隆位点处,构建完成pTol2-GFP质粒,即为所述两端包含LoxP位点的表达GFP蛋白的质粒。

全文数据:

权利要求:

百度查询: 中国科学院水生生物研究所 两端包含LoxP位点的表达GFP蛋白的质粒及其构建方法和应用

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