买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

摘要：本发明涉及温度控制表达质粒技术领域，特别涉及一种用于铜绿假单胞菌的温度控制表达质粒及转化子。所述表达质粒由片段1和片段2首尾连接组成；所述片段1包含温敏阻遏蛋白的核苷酸序列、启动子、编码多肽的核苷酸序列，所述多肽的表达受启动子控制；所述启动子受所述温敏阻遏蛋白调控；所述片段2包含复制元件。一种转化子，所述转化子的宿主菌为铜绿假单胞菌，含有上述的温度控制表达质粒。本发明在合成片段2时，使用了可以在铜绿假单胞菌中进行稳定复制的复制起始点oriV及trfA，使次质粒可以稳定存在于铜绿中，进而通过温度控制基因的表达。

主权项：1.一种用于铜绿假单胞菌的温度控制表达质粒，其特征在于：所述表达质粒由片段1和片段2首尾连接组成，核苷酸序列如SEQIDNO:10所示；所述片段1包含温敏阻遏蛋白的核苷酸序列、启动子、编码多肽的核苷酸序列、转录终止序列，多肽的表达受启动子控制；所述启动子受所述温敏阻遏蛋白调控；所述片段2包含复制元件；所述复制元件包括oriT、oriV和trfA，所述oriT的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示、所述oriV的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，所述trfA的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；所述温敏阻遏蛋白为Clts857蛋白，核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；启动子为PL或PR启动子，PL启动子的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，PR启动子的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；所述片段1还包括SD序列和rrnBT1T2序列，所述SD序列用于帮助招募核糖体RNA，并将核糖体比对并结合到信使RNA的起始密码子，所述rrnBT1T2序列用于转录终止信号；所述编码多肽的核苷酸序列包括mcherry荧光蛋白序列；所述片段2还包括筛选序列，所述筛选序列为庆大霉素抗性基因GmR；所述片段1和片段2在片段末端有同源序列，通过同源重组酶进行无缝克隆；所述表达质粒的制备方法包括：（1）通过基因合成得到质粒的片段1和片段2，通过同源重组方法组合；（2）取200ulPCR管，取2×UnicloneSeamlessCloningMix5ul，加入1uL，100ngul片段2，加入1uL，100ngul片段1，加入ddH2O至总体积10ul；（3）混匀后放至50℃孵育30min，（4）取100μL冰浴上融化的DH5α感受态细胞，加入（3）中重组产物，体积不超过所用感受态细胞体积的110，轻轻混匀，冰上静置25min；42℃水浴热激45s，迅速转移至冰浴中，静置2min；向离心管中加入700μL不含抗生素的无菌LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏1h；8000g离心，2min，去600ul上清，将剩余涂覆庆大霉素抗性平板，工作浓度10μgmL，放至37培养箱倒置培养12小时，得到转化子，（5）菌落PCR、酶切验证及测序验证筛选正确转化子；（6）将正确的转化子进行培养后提取质粒pPAT-mcherry。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 山东第二医科大学 一种用于铜绿假单胞菌的温度控制表达质粒及转化子